反相HPLC法測定復(fù)方芍紅顆粒中芍藥苷含量

甘　為　陳金鳳　馬桂芝.山東電力中心醫(yī)院藥劑科，山東濟(jì)南500；.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊8300；3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830054

反相HPLC法測定復(fù)方芍紅顆粒中芍藥苷含量

甘為1陳金鳳2馬桂芝3▲
1.山東電力中心醫(yī)院藥劑科，山東濟(jì)南250011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830054

目的建立用于測定復(fù)方芍紅顆粒中芍藥苷含量的HPLC法。方法采用色譜柱Kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇-水（40∶60）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長232 nm，柱溫30℃。結(jié)果芍藥苷檢測濃度在0.008～0.512mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性（r=0.9998）；平均回收率為100.3%，RSD為1.38%；精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗RSD均小于2%。含量測定平均值為17.54mg/g。結(jié)論該方法簡單、快速，精密度高，重復(fù)性好，所建立的方法可以用于復(fù)方芍紅顆粒中芍藥苷的質(zhì)量控制。

復(fù)方芍紅顆粒；含量測定；RP-HPLC；芍藥苷

復(fù)方芍紅顆粒是據(jù)臨床驗方研發(fā)而成的中藥新藥，原方主要是由赤芍、紅花、紅景天、川芎四味藥材組成，用于冠心病的治療。方中赤芍（Paeonia lactiflora Pall）為君藥，為毛茛科多年生草本植物，以干燥根入藥，栽培品干燥根稱之為白芍，野生品干燥根稱之為赤芍［1］。赤芍，性微寒、微苦，具有清熱涼血，散瘀止痛之功效，用于熱入營血、溫毒發(fā)斑、吐血衄血、目赤腫痛、肝郁脅痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕腹痛、跌撲損傷、癰腫瘡瘍［2-10］。赤芍的主要有效成分為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷等多種苷類物質(zhì)，總稱為赤芍總苷，其中芍藥苷為赤芍中含量較高的主要有效成分之一［11-12］。為了有效控制該制劑的質(zhì)量，采用HPLC法對復(fù)方芍紅顆粒中芍藥苷進(jìn)行含量測定。

1　儀器與材料

1.1儀器

LC20-AB高效液相色譜儀（日本島津，SPD-20A檢測器），KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BS110S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2試藥

甲醇（色譜級，F(xiàn)isher公司），水為超純水，芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號0736-200014），復(fù)方芍紅顆粒、缺赤芍陰性樣品顆粒（課題組自制）。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相：甲醇-水（40∶60），柱溫30℃，檢測波長232 nm，進(jìn)樣量10μL，流速1.0 mL/min［13-19］。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)減壓干燥48h的芍藥苷對照品5.08mg，加甲醇適量，超聲使溶解，放冷，甲醇定容至25 mL，制成0.2032 mg/m L的溶液，用0.22μm微孔濾膜濾過，濾液作為對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

取復(fù)方芍紅顆粒0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，靜置4 h，超聲20min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，過濾，取上清液，用0.22μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液的制備

精密稱取缺赤芍陰性樣品顆粒0.2 g，其余方法同供試品溶液的制備。

2.3專屬性考察

在“2.1”項下色譜條件下，芍藥苷對照品色譜峰與供試品中其他色譜峰基線分離，分離度為1.33，拖尾因子1.04，顆粒中其他成分對芍藥苷測定無干擾。

2.4線性關(guān)系

配制系列濃度芍藥苷對照品溶液（8、32、64、128、192、256、384、512μg/m L），分別吸取10μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以峰面積值（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=15 851X+ 24 681（r=0.9998），芍藥苷濃度在8～512μg/mL范圍內(nèi)峰面與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.5供試品溶液制備方法的優(yōu)選

2.5.1單因素試驗

2.5.1.1提取溶劑濃度的選擇精密稱取0.2 g復(fù)方芍紅顆粒6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入10%、30%、50%、70%、90%、100%的甲醇10 mL，稱定重量，超聲提取30 min（功率100W，溫度20℃）取出，放冷用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失重量，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰，不同濃度甲醇提取對芍藥苷含量影響較大，采用100%甲醇提取時，芍藥苷的提取率最高。

2.5.1.2提取溶劑加入量的選擇精密稱取7份0.2 g復(fù)方芍紅顆粒，置具塞錐形瓶中，分別加入10、20、30、40、50、100、200 mL的甲醇溶液中，稱定重量，超聲提取30 min（功率100W，溫度20℃）取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰，加入不同體積甲醇提取對芍藥苷含量影響較大，采用1∶100的提取溶劑提取時，芍藥苷的提取率最高。

2.5.1.3超聲時間的選擇精密稱取6份0.2 g復(fù)方芍紅顆粒，置具塞錐形瓶中，加甲醇溶解，定容，稱定重量，分別超聲10、20、30、40、50、60 min（功率100 W，溫度20℃），取出，放冷用甲醇補(bǔ)足減失重量，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰，不同超聲時間提取對芍藥苷含量影響較大，超聲時間為20 min時，芍藥苷的提取率最高。

2.5.1.4超聲溫度的選擇精密稱取5份0.2 g復(fù)方芍紅顆粒，置具塞錐形瓶中，加甲醇溶解，定容，稱定重量，分別超聲在20、30、40、50、60℃（功率100 W）超聲20 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰，不同超聲溫度提取對芍藥苷含量影響較大，超聲溫度為50℃時，芍藥苷的提取率最高。

2.5.1.5提取方式的選擇精密稱取3份0.2 g復(fù)方芍紅顆粒，加甲醇溶解，定容，稱定重量，分別超聲，靜置，回流提取20 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰，不同提取方式對芍藥苷含量影響較大，采用超聲提取時，芍藥苷的提取率最高。

2.5.2正交試驗

2.5.2.1試驗設(shè)計單因素試驗結(jié)果表明甲醇濃度、物料比、超聲時間、超聲溫度均對提取效果有影響，因此采用L9（34）重復(fù)正交試驗設(shè)計考察四個因素不同水平對樣品芍藥苷含量測定值的影響，進(jìn)而對其樣品制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平表見表1，正交試驗安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

直觀分析結(jié)果表明各因素對指標(biāo)的影響依次為A＞B＞D＞C，優(yōu)選水平組合為為A1B1C3D1；方差分析結(jié)果表明A、B因素對指標(biāo)變化的影響比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而C、D因素對結(jié)果影響比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），因此初步確定優(yōu)選條件為A1B1C1D1，并進(jìn)行驗證試驗。

表1　因素水平表

表2　L9（34）重復(fù)正交試驗結(jié)果（n=27）

表3　方差分析表

2.5.2.2驗證試驗取同批次的復(fù)方芍紅顆粒，按照篩選出的最優(yōu)供試品制備方法平行制備3份供試品，測定芍藥苷含量。芍藥苷含量結(jié)果平均值為（18.870± 0.127）mg/g，RSD=0.67%，提示該樣品處理工藝穩(wěn)定、合理、可行。

2.5.2.3確定樣品處理工藝結(jié)合以上試驗數(shù)據(jù)，確定樣品前處理條件為取復(fù)方芍紅顆粒約0.2 g，精密稱定，置10 m L容量瓶中，精密加入70%甲醇，定容，功率100 W，溫度40℃，超聲10 min，放冷，用0.22μm微孔濾膜慮過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.6精密度試驗

取3個濃度芍藥苷對照品溶液，同一天連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)測定3 d，記錄芍藥苷峰面積，計算RSD。評價日內(nèi)精密度與日間精密度。日內(nèi)精密度RSD分別為1.50%、1.14%、0.48%；日間精密度RSD分別為1.35%、0.87%、0.82%；各峰的相對面積的RSD均小于2%，表明日內(nèi)、日間儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗

精密稱取0.2 g復(fù)方芍紅顆粒6份，按照供試品制備方法制備6份供試品，按前述色譜條件進(jìn)樣，測定芍藥苷峰面積，計算芍藥苷含量，計算RSD。6份供試品溶液含量的RSD為1.46%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.8穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按前述色譜條件在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定芍藥苷峰面積，計算芍藥苷含量，計算RSD，供試品溶液在24 h內(nèi)的RSD為1.49%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9加樣回收率

取已知含量復(fù)方芍紅顆粒0.2 g 9份，分別加入對照品適量，按照供試品制備方法制備，按照前述色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，計算芍藥苷含量及回收率。測定峰面積見表4，回收率在98%～102%之間，RSD＜2%。結(jié)果表明，采用本法準(zhǔn)確可靠，回收率良好。

表4　加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.10樣品含量測定

取10批復(fù)方芍紅顆粒，按照供試品制備方法制備，按照前述色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，計算芍藥苷含量，10批復(fù)方芍紅顆粒中芍藥苷含量分別為18.47、16.68、18.06、16.41、15.48、18.44、17.91、17.96、18.01、17.98mg/g，平均值為17.54mg/g。

3　討論

3.1色譜條件的選擇

在流動相的選擇上，本實驗先后選用乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.05%磷酸和甲醇-水為流動相進(jìn)行分離，比較之后發(fā)現(xiàn)甲醇-水較其他體系，有機(jī)相用量少，柱壓低，色譜峰較尖銳，分離效果好。塔板數(shù)較高，大于3000，分離度和拖尾因子基本符合要求［20-27］。

3.2供試品制備工藝的篩選

對供試品的制備工藝進(jìn)行篩選，靜置，超聲和回流，結(jié)果顯示超聲較好，對溶劑濃度（10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、純甲醇）進(jìn)行篩選，最后得出甲醇濃度越高，對芍藥苷提取得越完全，對超聲時間（10、20、30、40、50 min）進(jìn)行篩選，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示20min較好，對超聲溫度（20、30、40、50、60℃）進(jìn)行篩選，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示50℃提取的芍藥苷較完全。將單因素篩選出的條件，選取左右各兩個因素進(jìn)入正交試驗，正交結(jié)果優(yōu)選出70%甲醇，物料比1∶50，超聲溫度40℃，超聲10 min，經(jīng)過驗證，該方法可盡可能提取出樣品中的芍藥苷。

3.3供試品溶液的含量測定

從10批供試品的測定結(jié)果來看，含量變化幅度不大，最高為18.47 mg/g，最低為15.48 mg/g，考慮到藥材的來源，以及提取工藝、顆粒的制備，以及供試品溶液的制備等因素，將供試品中的芍藥苷含量定為每克不低于15mg。

綜上所述，本方法簡單、快速、精密度高、重復(fù)性好，可以用于復(fù)方芍紅顆粒中芍藥苷的質(zhì)量控制。

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Contents determ ination of paeoniflorin in Fufangshaohong Granules by RP-HPLC

GANWei1CHEN Jinfeng2MA Guizhi3▲
1.Pharmacy Department，Shandong Electric PowerCentralHospital，Shandong Province，Ji＇nan 250011，China；2.Pharmacy Division，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang Autonomous Region，Urumqi 830011，China；3.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Xinjiang Autonomous Region，Urumqi 830054，China

Ob jective To establish an RP-HPLCmethod for the determination of the content of paeoniflorin in the Fufangshaohong Granules.Methods The chromatographic columns（Kromasil C18，4.6 mm×250 mm，5μm）was applied to test the contentof paeoniflorin.Amixture ofmethanol-water（40∶60）was utilized as themobile phase whose flow rate was 1.0 mL/min.The detection wavelength was 232 nm，and the column temperature was set at 30℃.Results The results showed there were linear relationships between peak area and concentration of paeoniflorin within 0.008-0.512 mg/mL（r=0.9998）；The average recovery ratewas 100.31%，with a RSD value of 1.38%.The error of RSD in precision，stability and repeatability test were nomore than 2%；the average content of paeoniflorin was 17.54 mg/g.Conclusion The method in this paper is simple，quick，accurate and reproducible，which can be used for controlling the content of paeoniflorin in Fufangshaohong Granules.

Fufangshaohong Granule；Content determination；RP-HPLC；Paeoniflorin

R927.2

A

1673-7210（2016）06（c）-0138-04

▲

（2016-02-12本文編輯：趙魯楓）