人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響

王　凊　張　博　車緒春▲.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗科，天津30005；.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070

人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響

王凊1張博2車緒春2▲
1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗科，天津300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070

目的研究人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（hAD-MSC）的基本生物學(xué)特征及對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響。方法貼壁法從人脂肪組織分離獲得hAD-MSC，完成鑒定；分別用脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)其向脂肪和成骨細(xì)胞分化；hAD-MSC與人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231共培養(yǎng)，Transwell小室法觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和遷移、侵襲能力。結(jié)果從人脂肪組織中成功培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，其具有較強的體外增殖和自我更新能力。共培養(yǎng)之后的MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力增強。結(jié)論從人脂肪組織中可分離培養(yǎng)出具有多分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，并可促進乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞；乳腺癌；共培養(yǎng)；轉(zhuǎn)移

乳腺癌是女性最常罹患的惡性腫瘤之一，腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移亦是主要的致死因素。間充質(zhì)干細(xì)胞（mes enchymal stem cells，MSC）對腫瘤的生長扮演著雙重角色［1］。明確MSC與腫瘤細(xì)胞的相互作用是MSC在腫瘤進展及治療研究中的關(guān)鍵［2］。人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（human adipose derived MSC，hAD-MSC）具有跟骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）類似的生物學(xué)特性，并且來源充足，易于分離，取材途徑更易于供體接受［3］。本研究從人脂肪組織中培養(yǎng)獲得hAD-MSC，對其生物學(xué)特性進行研究，并觀察其對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1人脂肪組織2015年1～12月收集2例天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院乳腺癌手術(shù)患者的乳腺癌脂肪組織?；颊吆炇鹩舍t(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)的患者知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

1.1.2乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.3主要儀器和試劑流式細(xì)胞儀（型號：FACSAriaⅡ，BD公司）；Ⅰ型膠原酶（Gibco公司）；Oricell人MSC成骨和脂肪分化培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)公司）；FITC標(biāo)記的抗人CD34、CD44、CD90、HLA-DR、CD105抗體，F(xiàn)ITCmouse IgG1κ同型對照抗體（Biolegend公司）。

1.2hAD-MSC的分離培養(yǎng)

將脂肪組織用D-Hank液沖洗，剪碎后，0.1%的Ⅰ型膠原酶37℃下消化1 h，1000×g離心10 min，棄上清后將細(xì)胞重懸，尼龍網(wǎng)過濾。再次洗滌，離心獲得單細(xì)胞懸液。計數(shù)細(xì)胞濃度為1×106/mL，培養(yǎng)基為10%FBSDMEM/F12，37℃5%CO2下進行貼壁培養(yǎng)。24 h后洗掉未黏附細(xì)胞，更換新鮮培基。之后傳代培養(yǎng)，實驗均選擇3～15代的子代細(xì)胞，鑒定后備用［4-5］。

1.3hAD-MSC免疫表型鑒定

取對數(shù)生長期hAD-MSC細(xì)胞懸液100μL（濃度為5×106/mL），分別加入FITC-抗人CD34、CD44、CD90、HLA-DR、CD105抗體以及FITCmouse IgG1κ同型對照抗體20μL，避光4℃孵育30min。PBS洗滌，500×g離心5 min，重懸細(xì)胞后篩網(wǎng)過濾。流式細(xì)胞儀檢測，CELLQUEST軟件采集數(shù)據(jù)［6］。

1.4hAD-MSC的成骨和脂肪分化

1.4.1成骨分化調(diào)整hAD-MSC細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種于培養(yǎng)板中，37℃5%CO2培養(yǎng)。24 h后，棄去原培養(yǎng)基，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含谷氨酰胺、抗壞血酸、磷酸甘油、地塞米松），分化培養(yǎng)2周后，固定細(xì)胞，茜素紅（Alizarin red）染色鑒定。

1.4.2脂肪分化細(xì)胞準(zhǔn)備同上述步驟。棄去hAD-MSC原培養(yǎng)基后，加入脂肪誘導(dǎo)培基A（含IBMX、吲哚美辛、地塞米松）；3 d后，換為脂肪誘導(dǎo)培基B（不含IBMX、吲哚美辛、地塞米松）；24 h后，再換成培基A。如此進行培基A和B的輪換，3個循環(huán)后完成誘導(dǎo)。最后培基B培養(yǎng)1周。固定細(xì)胞，油紅O進行染色鑒定［7］。

1.5hAD-MSC與腫瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231（細(xì)胞濃度為2× 105/mL），加入到Transwell小室上層，每孔500μL。常規(guī)培養(yǎng)hAD-MSC后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，1.5 mL/孔，加入到小室下方，以單純hAD-MSC培養(yǎng)基作為對照。37℃、5%CO2孵育72 h。

1.6體外細(xì)胞遷移和侵襲實驗

1.6.1遷移實驗Transwell小室4℃預(yù)冷，25μL的趨化因子FN（0.2 mg/mL）涂在小室底部，風(fēng)干。將共培養(yǎng)后的MDA-MB-231細(xì)胞，用0.1%BSA RPMI-1640調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，100μL/室，加入到底部已涂有趨化因子FN的小室上層，以未與hAD-MSC共培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞作為對照。小室下方加入10%FBS RPMI-1640 600μL/孔，37℃、5%CO2孵育24 h。用棉棒擦去微孔濾膜上未遷移的細(xì)胞，HE染色，中性樹膠封片。100倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)膜上下左右中5個視野穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)。

1.6.2侵襲實驗25μL的Matrigel膠（0.2mg/mL）包被Transwell小室上層。其余實驗步驟均同遷移實驗［8］。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0進行分析，組間比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1hAD-MSC貼壁法分離結(jié)果

細(xì)胞貼壁后多為多邊形，細(xì)胞核居中，多為單核；早期細(xì)胞生長緩慢，第3天數(shù)量明顯增加。傳至3代后，細(xì)胞形態(tài)基本一致，為成纖維細(xì)胞樣，核清晰、胞質(zhì)顆粒明顯，生長速度穩(wěn)定，分裂周期約為48 h，提示具有旺盛的體外增殖能力。傳至第15代時，未見形態(tài)有異常改變，提示所得細(xì)胞具有較強的自我更新能力。見圖1。

圖1　貼壁法分離人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞

2.2hAD-MSC免疫表型鑒定

流式分析結(jié)果顯示，hAD-MSC具有較高的純度。該細(xì)胞群高表達CD44、CD73、CD90、CD105，而CD34、CD45呈陰性。見圖2。

2.3hAD-MSC的成骨和脂肪分化

hAD-MSC成骨誘導(dǎo)完成后采用茜素紅染色，觀察到細(xì)胞胞漿中有紅色的鈣結(jié)節(jié)，呈明顯陽性；脂肪分化采用油紅O染色，觀察到細(xì)胞胞漿有紅色的脂肪滴，呈明顯陽性。結(jié)果顯示，本研究分離獲得的hAD-MSC具有多向分化潛能。見圖3。

2.4MDA-MB-231細(xì)胞與hAD-MSC共培養(yǎng)后遷移和侵襲能力的變化

共培養(yǎng)72 h后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強，遷移細(xì)胞數(shù)目為（100.2±13.0）個，與對照組［（58.6±12.5）個］比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；侵襲細(xì)胞數(shù)目為（118.7±15.2）個，與對照組［（63.3±11.0）個］比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

3　討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，大部分乳腺癌患者死于癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。明確MSC與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用對于治療研究至關(guān)重要［9］。有報道，與BM-MSC共培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)和表型的改變，MSC可被腫瘤細(xì)胞募集至原發(fā)腫瘤的基質(zhì)表面，從而促進其侵襲和轉(zhuǎn)移［10］。本研究采用hAD-MSC進行研究，其已知具有跟BM-MSC類似的生物學(xué)特性，包括多向分化潛能、自我更新、高度增殖能力，并且具有易于分離、取材途徑更易于供體接受等特點，hAD-MSC已然成為MSC研究的新熱點［11］。本研究對象取自于患者乳腺癌腫瘤脂肪組織，能更好地模擬乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的MSC和癌細(xì)胞之間的相互作用，為研究腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移過程以及臨床上預(yù)防腫瘤提供極其重要的依據(jù)。

圖2　人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記

圖3　人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和脂肪分化

圖4　MDA-MB-231細(xì)胞與hAD-MSC共培養(yǎng)后遷移和侵襲能力的變化

本研究采用貼壁法分離hAD-MSC。觀察細(xì)胞形態(tài)一致，大部分為紡錘形或梭形細(xì)胞，與成纖維樣細(xì)胞形態(tài)類似。細(xì)胞增殖穩(wěn)定，傳代至10～15代，并未見異常形態(tài)改變，說明本研究獲得的hAD-MSC體外增殖及更新能力良好。對MSC進行鑒定的重要方面之一是其重要的表面分子標(biāo)志。CD90、CD105、CD73和CD44分子是公認(rèn)在間充質(zhì)干細(xì)胞表面穩(wěn)定表達的分子。CD90又稱Thy-1，它是早期造血干細(xì)胞的標(biāo)志，并已被確定在非淋巴組織的多種干細(xì)胞中均有不同程度的表達。CD105主要表達在血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征性表型之一。CD73是目前公認(rèn)的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物之一，它有可能通過抑制針對腫瘤細(xì)胞的保護性免疫反應(yīng)或者干擾化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的方式促進腫瘤的發(fā)生［12］。CD44是另外一個腫瘤干細(xì)胞常見標(biāo)志物，主要參與細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)之間的黏附。本研究對分離所得的hAD-MSC進行了CD105、CD90、CD13、CD44分子的流式鑒定。研究結(jié)果顯示，這4種分子在hAD-MSC上都呈陽性表達，陽性率均在99%以上，而CD45、CD34在MSC表面呈陰性表達。CD45是在白細(xì)胞表面廣泛表達的分子，CD34主要表達于原始的造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，本研究中分離的細(xì)胞群，D45和CD34呈陰性表達，陽性率不超過2%，說明本研究獲得的hAD-MSC純度較高。

多向分化潛能是MSC的基本生物學(xué)特征之一［13］，也是MSC鑒定的最重要指標(biāo)。本研究采用間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)基對hAD-MSC進行誘導(dǎo)分化。茜素紅和油紅O分別進行染色，均表現(xiàn)出陽性，這提示hAD-MSC可完成向成骨和脂肪細(xì)胞的分化，證明本研究獲得的hAD-MSC具有良好的定向分化能力。

MSC強大的分化和增殖能力促使其參與腫瘤組織的構(gòu)建；通過多種趨化因子作用引起腫瘤細(xì)胞表型變化，促進腫瘤惡性行為；MSC具有類似“免疫豁免”效應(yīng)，可對各主要類型的免疫細(xì)胞產(chǎn)生增殖和活化抑制作用，有助于腫瘤細(xì)胞逃逸；表達于MSC表面的多種生長因子和細(xì)胞因子可協(xié)同促進腫瘤血管和淋巴管生成，參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。MSC尚具有惡變潛能，在某些條件下可自發(fā)轉(zhuǎn)化為致瘤干細(xì)胞［14］。為進一步研究腫瘤微環(huán)境中的MSC和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，本研究將人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231與hAD-MSC進行共培養(yǎng)，采用Transwell方法檢測共培養(yǎng)后的乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Karnoub等［15］于2007年首次證明骨髓來源的MSC能夠促進乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，MSC與乳腺癌細(xì)胞按一定比例混合后共同接種入裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)MSC能顯著促進乳腺癌細(xì)胞的運動性、侵襲能力及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。將綠色熒光蛋白標(biāo)記的人乳腺癌細(xì)胞系（MCF/Ras、MDA-MB-231、MDA-MB-435、HMLER）與間充質(zhì)干細(xì)胞以1∶3的比例共同移植到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進四株人乳腺癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)與MSC能顯著促進乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲能力。

綜上所述，本研究從人乳腺癌脂肪組織中分離出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞一致性好，純度高，對MSC進行進一步探討，本研究觀察了乳腺癌細(xì)胞與MSC共培養(yǎng)之后腫瘤特性的變化，發(fā)現(xiàn)MSC能顯著促進乳腺癌細(xì)胞在體外的遷移、侵襲能力，初步探索了腫瘤微環(huán)境中MSC對乳腺癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制，從而為腫瘤治療提供新的靶點。

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Effect of hum an adipose derived m esenchymal stem cells on metastasis of breast cancer

WANG Qing1ZHANG Bo2CHE Xuchun2▲
1.Department of Clinical Laboratory，General Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China；2.School of Basic Medicine，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China

Ob jective To study the biological characteristics of human adipose derived mesenchymal stem cells（hADMSC），and its effectonmetastasis of breast cancer.M ethods hAD-MSCwere isolated from adipose tissue by adherence to plastic；hAD-MSC were induced into adipocytes and osteoblasts by adipose induced medium and osteogenesis induced medium；after breast cancer cells（MDA-MB-231）were co-cultured with hAD-MSC，the changes ofmorphology，migration and invasive capacity of tumor cellswere observed by Transwell system.Results hAD-MSCwas successfully obtained from human adipose tissue.They showed strong abilitiesof proliferation in vitro and self-renewal.Themigration and invasive capacity of MDA-MB-231 after co-cultured was significantly enhanced.Conclusion hAD-MSC with multipotent differentiation potential can be obtained from human adipose tissue，and it can promote themetastasis of breast cancer.

Human adipose derived mesenchymal stem cells；Breast cancer；Co-culture；Metastasis

R737.9

A

1673-7210（2016）06（c）-0025-04

天津醫(yī)科大學(xué)科學(xué)基金面上項目（2015KYZM12）。

王凊（1978.5-），女，碩士；研究方向：抗腫瘤。

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（2016-02-26本文編輯：張瑜杰）