高脂喂養(yǎng)聯(lián)合免疫損傷建立兔動脈粥樣硬化模型及評價

唐　曦　楊　松　茍　博　吳少平　江　亮　劉　洪.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像系，四川成都60500；.成都醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院內(nèi)科，四川成都60500

高脂喂養(yǎng)聯(lián)合免疫損傷建立兔動脈粥樣硬化模型及評價

唐曦1楊松1茍博1吳少平1江亮1劉洪2
1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像系，四川成都610500；2.成都醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院內(nèi)科，四川成都610500

目的利用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合免疫損傷建立兔實驗性動脈粥樣硬化模型，改進(jìn)兔實驗性動脈粥樣硬化模型建立方法。方法選擇雄性新西蘭大白兔45只，分為三組。正常對照組（15只兔）給予飼普通飼料；高脂飼料模型組（15只兔）給予高脂飼料（88.5%普通飼料+7.5%蛋黃粉+6%膽固醇+4%豬油）；高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組（15只兔）喂養(yǎng)方式與高脂飼料模型組相同，并每周肌內(nèi)注射胎牛血清蛋白，劑量250mg/kg。在喂養(yǎng)12周時，對每組兔進(jìn)行血清采集、超聲股動脈探查，解剖兔的主動脈并進(jìn)行病理學(xué)HE染色檢查，分析兔血脂Ⅰ指標(biāo)、超聲探查股動脈結(jié)果、兔主動脈粥樣斑塊、HE染色改變。結(jié)果與正常對照組比較，高脂飼料模型組、高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組兔血脂Ⅰ檢測的生化指標(biāo)總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯升高（P＜0.01）。高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組在大體解剖上顯示粥樣斑塊病變較高脂飼料模型組、正常對照組明顯增多；同時，超聲檢查股動脈表明，高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組血管病變較正常對照組和高脂飼料模型組明顯。HE染色顯示，高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組血管內(nèi)皮下見更多吞噬脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和纖維斑塊形成。結(jié)論高脂喂養(yǎng)復(fù)合免疫損傷建立兔實驗性動脈粥樣硬化模型具有可行性，可更快速形成更成熟的動脈粥樣硬化斑塊。

動脈粥樣硬化；免疫損傷；超聲檢查；高脂喂養(yǎng)

動脈粥樣硬化是一組稱為動脈硬化的血管病中最常見、最重要的一種，可累及冠狀動脈、頸動脈、主動脈、腎動脈等大中動脈血管，并最終引發(fā)心、腦、腎血管疾病，而后者是老年人死亡的常見病因，因此加強對動脈粥樣硬化的研究具有重要的臨床價值，但實驗研究最初的步驟即是要高效地建立動脈粥樣硬化模型。各種動脈硬化的共同特點是動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小。粥樣硬化病變的形成是動脈對內(nèi)膜損傷做出的炎癥-纖維增生性反應(yīng)的結(jié)果［1］。因此，模擬此病理過程建立兔動脈粥樣硬化模型對疾病的實驗研究具有重要的實用意義。本實驗對比了高脂喂養(yǎng)、高脂喂養(yǎng)加免疫損傷建立動脈粥樣硬化模型的效果，以期提高兔動脈粥樣硬化模型的建立成功率。

1　對象與方法

1.1實驗動物

純種健康雄性新西蘭大白兔45只，約2月齡，體重1.5～2.0 kg，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供［許可證號：SCXK（川）2013-14］。每只兔單籠適應(yīng)性喂養(yǎng)普通兔顆粒飼料1周后，空腹12 h，耳緣靜脈取血，測定血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，血脂水平差異大者不作為實驗用兔。實驗兔隨機分組，分為正常對照組（15只）、高脂飼料模型組（15只）、高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組（15只）。每日觀察動物的精神狀態(tài)，進(jìn)食、飲水及大小便情況，每周測體重，根據(jù)體重和進(jìn)食情況及時調(diào)整給予飼料的總量。

1.2方法

1.2.1喂養(yǎng)方法及建模方法正常對照組飼普通飼料。高脂飼料模型組飼高脂飼料（88.5%普通飼料+7.5%蛋黃粉+1%膽固醇+3%豬油），蛋黃粉開始足量，膽固醇和豬油逐次增加（每次各增加0.5%），若兔子無腹瀉，進(jìn)食量可增加，約3 d加膽固醇和豬油1次，直至目標(biāo)劑量（88.5%普通飼料+7.5%蛋黃粉+6%膽固醇+ 4%豬油）。高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組喂養(yǎng)方式與高脂飼料模型組相同，另外每周對該組兔子肌內(nèi)注射胎牛血清蛋白，劑量為250mg/kg。三組兔子連續(xù)喂養(yǎng)12周。

1.2.2血脂Ⅰ號檢測喂養(yǎng)滿12周時，所有兔經(jīng)腹腔麻醉滿意后，經(jīng)耳緣靜脈取血，用全自動生化分析儀測定動物血脂Ⅰ號：TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.2.3血管超聲檢查血管超聲在適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束時及喂養(yǎng)12周時分別對各組兔進(jìn)行股動脈的探查，留下影像資料。

1.2.4大體解剖觀察主動脈所有兔采用耳緣靜脈注射過量水合氯醛處死，剖開胸腹腔，游離主動脈全長，剝離外膜脂肪組織，將主動脈從根部分離至股動脈，離斷并縱行剖開，生理鹽水沖洗干凈，鋪平攝像，觀察并記錄大體標(biāo)本的情況。圖像分析各組兔主動脈粥樣硬化斑塊面積。

1.2.5主動脈組織學(xué)標(biāo)本取降主動脈粥樣硬化斑塊區(qū)的多塊組織，保存于4%多聚甲醛溶液中，用于HE染色。應(yīng)用倒置生物顯微鏡采集圖像，采用Image-Pro Plus多媒體彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，經(jīng)灰度變換將陽性染色與背景分開進(jìn)行自動測量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組兔血脂水平比較

飼養(yǎng)12周后取材，與正常對照組比較，其他兩組兔血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平明顯升高（P＜0.01）。見表1。

表1　三兔血脂水平比較（mmol/L，±s）

表1　三兔血脂水平比較（mmol/L，±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

組別TG TC HDL-C LDL-C正常對照組（n=15）高脂飼料模型組（n=15）高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組（n=15）1.09±0.25 1.20±0.11*1.46±0.23*1.03±0.12 3.03±0.25*3.15±0.28*0.23±0.22 0.59±0.11*0.88±0.12*0.11±0.03 1.16±0.03*1.45±0.10*

2.2兔主動脈大體解剖形態(tài)

肉眼下，正常對照組主動脈內(nèi)膜光滑，未見粥樣硬化斑塊；高脂飼料模型組主動脈內(nèi)膜的粥樣硬化斑塊融合成片，密布內(nèi)膜面，斑塊面積比約為60%；高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組粥樣斑塊融合分布，斑塊面積比約為75%，病變較正常對照組和高脂飼料模型組變化明顯。見圖1（封三）。

2.3 HE染色

正常對照組血管內(nèi)皮下可見少許吞噬脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞；高脂飼料模型組血管內(nèi)皮下可見較多吞噬脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞，其中見散在淋巴細(xì)胞和少量纖維斑塊；高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組血管內(nèi)皮下可見更多吞噬脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞，其中見散在淋巴細(xì)胞和大片狀纖維斑塊形成。見圖2（封三）。

2.4兔股動脈超聲探查情況

正常對照組股動脈超聲檢查未見粥樣硬化斑塊顯像；高脂飼料模型組和高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組股動脈均可見粥樣斑塊顯像，但高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組斑塊體積更大。見圖3（封三）。

3　討論

3.1高脂飼料配制方法

在本次實驗中，對于兔血脂的測定和飼喂飼料中豬油比例的控制對實驗的成敗有關(guān)鍵作用。本實驗中，高脂飼料配制方法如下：先稱取普通飼料的質(zhì)量為A（占所配高脂飼料M的88.5%），然后算出高脂飼料的質(zhì)量M（M=A/88.5%），接著按照目標(biāo)劑量再配制蛋黃粉（7.5%M）、膽固醇（6%M）、豬油（4%M），然后稱取并配制高脂飼料。兔對外源性膽同醇吸收率高（75%～90%），采用少量、多次添加飼料飼喂的方式較好，因而應(yīng)注意配制的飼料中膽固醇及其所占比例。如果飼料中沒有添加膽固醇或者是膽固醇所占比例過少，不易在短時間內(nèi)成功建立動脈粥樣硬化模型［2-3］。相反，如果膽固醇比例過大，有學(xué)者［4］在高脂飼料中添加膽固醇比例高達(dá)30%，雖然縮短了造模時間，但易造成兔腹瀉，死亡率增加，而且造模成功后的兔極易死亡。相關(guān)學(xué)者研究亦發(fā)現(xiàn)應(yīng)用高脂飼料法2～4個月可建立動脈粥樣硬化模型［5］。

3.2大體解剖及病理學(xué)觀察的對比結(jié)果

本實驗發(fā)現(xiàn)，高脂飼料模型組、高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組與正常對照組相比，動脈粥樣硬化斑塊主要累及胸、腹主動脈，主動脈分支受累較輕，高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組可見斑塊環(huán)繞管腔大部，且較單純性高脂飼料模型組的硬化斑塊密集、分布范圍廣。主動脈HE染色顯示，高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組斑塊更成熟，表現(xiàn)為明顯的脂紋、粥樣斑塊和纖維斑塊形成，內(nèi)膜下可見纖維組織，平滑肌細(xì)胞排列紊亂等，這與相關(guān)研究具有相似處［6-8］。注射異體血清蛋白（胎牛血清）誘發(fā)了兔血清反應(yīng)導(dǎo)致兔動脈內(nèi)膜損傷，促進(jìn)了泡沫細(xì)胞灶的形成和脂質(zhì)沉積，并促使脂質(zhì)向動脈壁轉(zhuǎn)運，促進(jìn)了兔動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組能在較短時期內(nèi)復(fù)制出穩(wěn)定的實驗兔動脈粥樣硬化斑塊模型，其主動脈局部病理特點與人類動脈粥樣硬化病理特點非常相似。單純高脂飼料模型組的脂質(zhì)沉積和纖維增生的程度較輕。

3.3血脂檢測的分析

脂代謝紊亂不僅影響正常的生理功能，還會導(dǎo)致動脈粥樣硬化、高脂血癥等疾病，并與高血壓、糖尿病等一系列心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系［9］，嚴(yán)重危害人類健康。有研究表明高，TC是冠心病的主要危險因素。TG不是冠心病的獨立危險因素，但高TG如合并有糖尿病、腎病綜合征等代謝疾病時，易誘發(fā)胰腺炎。HDL-C是肝臟和小腸合成的脂蛋白，它運輸內(nèi)源性膽固醇到肝臟處理，具有抗動脈粥樣硬化形成和抑制免疫炎癥反應(yīng)的作用［10］，它也是預(yù)測冠心病的重要因素之一。LDL-C是攜帶膽固醇的主要顆粒，它可直接將膽固醇轉(zhuǎn)運到組織和細(xì)胞內(nèi)，是動脈粥樣硬化的主要危險因素。美國國家膽固醇教育計劃成人治療專業(yè)組規(guī)定將LDL-C的水平作為高脂蛋白血癥治療決策及其需要達(dá)到的治療目標(biāo)。相關(guān)研究表明，LDL-C中含有大量的TC和膽固醇酯，可與動脈壁蛋白多糖結(jié)合產(chǎn)生不溶性沉淀，并促使纖維組織增生，使動脈壁增厚［11］。相關(guān)研究指出，血脂代謝異常血清中TG、TC和LDL-C的升高是誘發(fā)動脈粥樣硬化的首要因素之一，也是動脈粥樣硬化主要危險因素之一［12-15］。有學(xué)者認(rèn)為，LDL-C/HDL-C比值是反映動脈粥樣硬化程度最好的指標(biāo)，LDL-C、HDL-C有可能處于正常值范圍但其比例可能已變化，血脂比值能更早反映動脈粥樣硬化的發(fā)生，因此在評價動脈粥樣硬化的發(fā)生時可利用比值來進(jìn)行觀察［16-17］。本實驗兔喂養(yǎng)到第12周時，正常對照組血脂水平未見明顯異常，高脂飼料模型組、高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組血脂水平較正常對照組明顯增高，說明高脂喂養(yǎng)能建立動脈粥樣硬化模型。

3.4超聲檢測的分析

喂養(yǎng)到第12周時，正常對照組兔股動脈超聲探查均未見明顯異常，而高脂飼料模型組、高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組較正常對照組均見明顯異常，高脂飼料復(fù)合免疫損傷模型組較高脂飼料模型組股動脈超聲異常明顯。頸動脈粥樣硬化斑塊容易發(fā)生在分叉部，因為該區(qū)血流易產(chǎn)生渦流，對血管壁的沖擊力加大，因此在超聲對動脈粥樣硬化斑塊檢測時要多注意分叉處。虞旭東等［18］研究顯示，股動脈斑塊對研究動脈粥樣硬化的準(zhǔn)確度高于頸動脈斑塊。通過本實驗的超聲檢查發(fā)現(xiàn)兔腸道冗長，結(jié)腸粗大，腸內(nèi)積氣明顯，經(jīng)腹前壁進(jìn)行觀察腹主動脈時易受氣體影像，觀察腸道后方的腹主動脈效果差。兔肋骨排列密集，由后上方向前下方走行的傾斜度大，超聲難避開胸骨和肋骨的骨質(zhì)影響，因此超聲對后縱隔胸主動脈的觀察效果差。兔頸部較短，超聲探頭放置和掃查進(jìn)行移動和進(jìn)行扇形掃描時有困難。兔股動脈位置表淺，股部內(nèi)側(cè)組織較平坦，超聲探頭在此部位進(jìn)行掃查較容易，圖像較清晰。在人類動脈粥樣硬化的超聲檢查中，動脈內(nèi)膜中層厚度測定是超聲檢查的首選定量檢測方法，但兔的動脈各層次結(jié)構(gòu)在本實驗的超聲檢測中難進(jìn)行區(qū)別，所以針對兔的動脈形態(tài)學(xué)觀察主要是對血管壁的厚度、管腔內(nèi)徑和管壁情況進(jìn)行了檢測。目前超聲新技術(shù)如脈搏波傳導(dǎo)速度、血管回聲跟蹤技術(shù)、速度向量成像技術(shù)及二維應(yīng)變技術(shù)、超聲彈性成像、超聲射頻數(shù)據(jù)處理和分子成像等可檢測動脈功能，且數(shù)據(jù)的異常早于動脈形態(tài)學(xué)改變，對動脈疾病的早期診斷具有重要意義。但新技術(shù)缺乏統(tǒng)一的測量及診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此新技術(shù)在血管疾病中的診斷作用將是后期的研究方向。

本實驗使用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合免疫損傷建模方式，能較好模擬人類動脈粥樣硬化疾病的炎性和內(nèi)膜脂質(zhì)沉積纖維增生等改變，動物死亡率低，動脈粥樣硬化模型成功率高。因此，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合免疫損傷是一種成本低、成功率高的動脈粥樣硬化建模方法。

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Establishment and evaluation of rabbit atherosclerosis model associated w ith high fat feeding and imm une injury

TANG Xi1YANG Song1GOU Bo1WU Shaoping1JIANG Liang1LIU Hong2
1.Department of Medical Imageology，the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Sichuan Province，Chengdu 610500，China；2.Department of Internal Medicine，Hospital of Chengdu Medical College，Sichuan Province，Chengdu 610500，China

Ob jective To establish the experimental rabbit atherosclerosis plaque formation model by high fat feeding and immune injury，in order to improve the rabbit experimental atherosclerosismodel.M ethods 45 male New Zealand white rabbitswere randomly divided into three groups.Normal control group（15 rabbits）was given ordinary feed；the high fat dietmodel group（15 rabbits）was given high fat forage（88.5%ordinary feed+7.5%egg yolk powder+6% cholesterol+4%lard）；the high-fat diet combined immune injury group（15 rabbits）was fed the same as high fat feedingmodel group，while rabbitswere given intramuscular injection of fetal bovine serum protein（250 mg/kg）per week. Rabbit serum was collected for lipidⅠindexes detection and femoral artery was probed with ultrasound for atherosclerotic aortic plaque detection at 12 weeks of feeding，then the rabbit aorta was taken out for pathological analysis by HE staining.Resu lts Compared to normal control group，high fat dietmodel group and high fat diet combined immune injury model group increased significantly in serum biochemical indicators of total cholesterol，triglyceride，high density lipoprotein cholesterol，and low density lipoprotein cholesterol（P＜0.01）.The high fat diet combined immune injury model group showed larger pathological morphology compared with the high fat dietmodel group and normal control group，meanwhile femoral artery ultrasound showed more significant difference of lesions compared with the high fat dietmodel group and the normal control group.HE staining showed that，the high fat diet combined immune injury model group had more lipid foam cells，lymphocytes and fiberpatches formation in subcutaneous tissue.Conclusion The establishment of high fat diet combined immune injury model is feasible，withmoremature formation of atherosclerotic plaque.

Atherosclerosis；Immune injury；Ultrasonography；High fat feeding

R543

A

1673-7210（2016）06（c）-0021-04

四川省衛(wèi)生廳科研課題資助項目（120472）；四川省教育廳科研課題資助項目（15ZB0251）；成都醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實驗計劃項目（CXJS201314，CXJS201317）。

唐曦（1981-），女，碩士；研究方向：骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)影像診斷。

劉洪（1981-），男，漢族，四川遂寧人，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

（2016-02-26本文編輯：程銘）