成年期社會隔離對雄性BALB/C小鼠神經(jīng)行為學的影響

馬　雪　董瑩瑩　劉　鵬　唐　靈　黨永輝.西安交通大學啟德書院，陜西西安7006；.西安交通大學第一附屬醫(yī)院精神心理衛(wèi)生科，陜西西安7006；.西安交通大學醫(yī)學部法醫(yī)學院，陜西西安7006

成年期社會隔離對雄性BALB/C小鼠神經(jīng)行為學的影響

馬雪1董瑩瑩2劉鵬3唐靈1黨永輝3
1.西安交通大學啟德書院，陜西西安710061；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院精神心理衛(wèi)生科，陜西西安710061；3.西安交通大學醫(yī)學部法醫(yī)學院，陜西西安710061

目的探討成年期社會隔離對雄性BALB/C小鼠神經(jīng)行為學的影響。方法8周齡的雄性BALB/C小鼠隨機分為群養(yǎng)組（GH組，n=16）和社會隔離組（SI組，n=16）。群養(yǎng)組作為對照，每籠飼養(yǎng)4只小鼠；社會隔離組單只單籠飼養(yǎng)。在40 d的社會隔離后進行一系列行為學測試，包括開放曠場實驗（OFT）、新異物體辨別實驗（NORT）、高架十字迷宮實驗（EPMT）、強迫游泳測試（FST）、T迷宮（TMT）、社會互動測試（SIT）和入侵者誘發(fā)攻擊實驗（IEAT）。比較兩組各測試結(jié)果。結(jié)果在FST中，社會隔離組的不動時間顯著短于群養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在EPMT中，社會隔離組在開臂停留的時間顯著長于群養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在TMT中，社會隔離組的正確率顯著高于群養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在SIT中，社會隔離組的社會交往行為的時間顯著長于群養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論雄性BALB/C小鼠成年期社會隔離對其可能具有抗抑郁、抗焦慮、提高學習記憶能力和增加社會交往行為的作用。

社會隔離；成年期；神經(jīng)行為學；BALB/C小鼠

各種因素造成的長期社會隔離（social isolation，SI）是社會應激的一種類型，比如留守兒童、空巢老人、某些特殊患者在住院期間被迫與人群分離等。社會隔離在某種程度上全部或部分剝奪了人的社會化過程，阻礙了人性的正常形成與發(fā)展過程，有可能參與各種精神障礙的發(fā)生過程［1］。目前關于社會隔離的動物模型主要集中于嚙齒類動物的幼年期和青少年期，研究結(jié)果表明社會隔離會引起動物在新環(huán)境中自主活動增多［2-8］、焦慮樣行為［1-2，4-6，8］、前脈沖抑制降低［1，4，8-9］、攻擊行為增加［1，6，10］、學習和記憶能力下降［1，3-4，6，11-12］，還會導致其成年期在新環(huán)境中的自主活動增加［13］、焦慮樣行為［13-15］、酒精攝取和偏愛增加［14，16］、條件性恐懼反射減弱［14］、潛伏抑制降低［13，17］、以及學習和記憶能力下降［17］。目前關于成年期社會隔離的研究較少，且其對小鼠行為學影響的研究結(jié)論有所不同［18-21］。為進一步探討成年期社會隔離對于嚙齒類動物行為學的影響。本研究選取8周齡的雄性BALB/C小鼠建立社會隔離模型，然后通過一系列情緒和認知行為學實驗對小鼠進行行為學測試，現(xiàn)報道如下：

1　材料與方法

1.1實驗動物

8周齡雄性BALB/C小鼠32只，體重（20±4）g，購自西安交通大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（陜）2012-003。本實驗已獲西安交通大學實驗動物管理委員會批準，并按動物實驗管理條例進行小鼠飼養(yǎng)和管理。飼養(yǎng)條件：室溫（23±1）℃，濕度（55±5）%，光暗周期12 h/12 h（光照時間為7∶00～19∶00），動物自由獲取水和食物。

1.2實驗方法

32只雄性BALB/C小鼠適應環(huán)境3 d后，隨機分為群養(yǎng)組（GH組，n=16）和社會隔離組（SI，n=16），社會隔離40 d，隨機挑選GH組8只和SI組8只，依次進行：開放曠場實驗（open field test，OFT），高架十字迷宮實驗（elevated plusmaze test，EPMT），強迫游泳測試（forced swimming test，F(xiàn)ST），新異物體辨別實驗（novel object recognition test，NORT）。隨機挑選GH組8只和SI組8只，依次進行：T迷宮（T-maze test，TMT），社會互動測試（social interaction test，SIT），入侵者誘發(fā)攻擊實驗（intruder-evoked aggressive test，IEAT）。采用15周齡CD1雄性小鼠16只，購自北京維通利華有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。將其作為陌生鼠，用于行為測試中的社會互動測試與入侵者誘發(fā)攻擊實驗。每籠4只，飼養(yǎng)條件與BALB/C小鼠相同。測試的順序以其對于小鼠的應激從小到大進行，相鄰兩個測試的間隔時間為2 d。

1.3行為學測試

1.3.1OFT測定新環(huán)境中的自主活動。將小鼠放入曠場實驗箱的正中格，讓其自由探索1 h。具體實驗方法同參考文獻所述［10］，記錄包括活動的總距離、前10 min進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)和前10min在中央?yún)^(qū)域停留的時間。

1.3.2EPMT用于檢測焦慮樣行為。裝置包括兩個開臂和兩個上部敞開的閉臂，開臂和閉臂呈十字交叉狀，交叉中心為開闊平臺，整個迷宮距地面50 cm。具體實驗方法同參考文獻所述［10］，記錄動物在開、閉臂停留的時間，以及分別進入開、閉臂的次數(shù)及其總次數(shù)。

1.3.3 FST用于檢測抑郁樣行為。裝置為一透明有機玻璃桶，水溫恒定。具體實驗方法同文獻［10］所述，記錄小鼠6min內(nèi)的累計不動時間。

1.3.4NORT用于檢測再認記憶。實驗裝置為一敞箱。測試分三個階段：適應，訓練，保持。具體實驗方法同文獻［10］所述，記錄每只動物探究每一物體（面對、觸或嗅）的時間，分別為T1、T2；記錄保持階段小鼠探究新?lián)Q的和原有的物體的時間，分別為T3、T4。小鼠的物體識別能力以分辨指數(shù)來評價，計算公式為：DI=（T3-T4）/（T3+T4）［10］。

1.3.5SIT用于檢測社會交往行為。測試前，原住雄性BLAB/C小鼠在測試籠中單獨飼養(yǎng)2 d。具體實驗方法同文獻［10］所述，記錄社會交往行為：緊隨、審視等行為持續(xù)的時間。

1.3.6IEAT用于檢測沖動/攻擊行為。用尚未對同伴表現(xiàn)出攻擊行為的雄性CD1小鼠作為入侵鼠。具體實驗方法同文獻［10］所述，記錄分析打斗、撕咬行為持續(xù)的時間和豎尾的次數(shù)。

1.3.7TMT控制進食，使體重保持在非禁食小鼠體重的85%。具體實驗過程同文獻［22］所述。最后記錄16次延遲位置匹配訓練中正確的次數(shù)（n），正確率為n/16［22］。

1.4統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1社會隔離對小鼠自主活動的影響

在OFT中，群養(yǎng)組和社會隔離組活動的總距離、前10 min進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)和前10min在中央?yún)^(qū)域停留的時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1　兩組小鼠在曠場實驗中的探索活動和自發(fā)活動路程結(jié)果（±s）

表1　兩組小鼠在曠場實驗中的探索活動和自發(fā)活動路程結(jié)果（±s）

組別動物只數(shù)總距離（cm）前10min進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)前10min在中央?yún)^(qū)域停留的時間（s）群養(yǎng)組社會隔離組t值P值7 6 12136.59±977.25 13291.22±842.93 0.900 0.392 16.00±7.58 10.50±2.52 0.688 0.532 4.43±2.03 2.52±0.86 0.988 0.352

2.2社會隔離對小鼠抑郁樣行為的影響

在FST中，群養(yǎng)組小鼠的在6 min內(nèi)不動時間顯著長于社會隔離組小鼠［（20.57±5.90）比（5.17±2.86）s］，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.224，P=0.048）。

2.3社會隔離對小鼠焦慮樣行為的影響

在EPMT中，群養(yǎng)組和社會隔離組進入開臂次數(shù)和進入閉臂次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩組在閉臂停留的時間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。社會隔離組在開臂停留的時間顯著性長于群養(yǎng)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），社會隔離組進入閉臂和開臂的總次數(shù)顯著性高于群養(yǎng)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.4社會隔離對小鼠學習記憶的影響

在NORT中，在訓練和測試階段，群養(yǎng)組和社會隔離組對物體探索時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組辨別指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在TMT中，社會隔離組的正確率顯著性高于群養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.5社會隔離對小鼠社會交往行為的影響

在SIT中，社會隔離組的5 min內(nèi)社會交往行為的時間顯著性長于群養(yǎng)組［（48.58±6.96）比（26.39± 4.84）s］，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.707，P＜0.05）。

表2　兩組小鼠在高架十字迷宮實驗中探索活動結(jié)果（±s）

表2　兩組小鼠在高架十字迷宮實驗中探索活動結(jié)果（±s）

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表3　新異物體辨別實驗和T迷宮實驗結(jié)果（±s）

表3　新異物體辨別實驗和T迷宮實驗結(jié)果（±s）

組別動物只數(shù)T迷宮實驗正確率（n=8）新異物體辨別實驗訓練階段探索時間（s）測試階段探索時間（s）辨別指數(shù)群養(yǎng)組社會隔離組t值P值7 6 26.2±6.30 28.37±2.82 0.297 0.422 32.25±6.54 24.95±5.55 0.835 0.772 0.17±0.20 0.51±0.16 1.293 0.223 0.32±0.04 0.46±0.04 2.292 0.041

2.6社會隔離對小鼠攻擊行為的影響

在IEAT中，群養(yǎng)組和社會隔離組攻擊行為時間［（0.63±0.42）比（0.24±0.24）s］和豎尾次數(shù)［（14.63± 2.56）比（10.33±1.48）次］比較，差異無統(tǒng)計學意義（t= 0.474，P=0.474；t=1.454，P=0.174）。

3　討論

本研究目的是探究成年期社會隔離對雄性BALB/C小鼠行為學的影響。在FST中，社會隔離組小鼠6 min內(nèi)的不動時間顯著減少（P＜0.05），說明社會隔離具有抗抑郁樣行為的作用。在EPMT中，社會隔離組在開臂停留的時間顯著性長于群養(yǎng)組（P＜0.05），說明社會隔離具有抗焦慮樣行為的作用；社會隔離組進入開臂和閉臂的總次數(shù)顯著性多于群養(yǎng)組（P＜0.05），說明社會隔離組的活動性高于群養(yǎng)組。在TMT中，社會隔離組的正確率顯著性高于群養(yǎng)組（P＜0.05），說明社會隔離組的空間學習記憶能力提高。在SIT中，社會隔離組的社會交往行為顯著性多于群養(yǎng)組（P＜0.05），說明社會隔離具有增加其社會交往行為的作用。在NORT中，兩組辨別指數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但有趨勢說明社會隔離組的辨別指數(shù)高于群養(yǎng)組。對于攻擊行為，在IEAT實驗中，社會隔離組和群養(yǎng)組的攻擊行為都很少，二者之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明社會隔離對于其攻擊行為的影響較小。綜上可知，成年期社會隔離對雄性小鼠可能具有抗抑郁樣、焦慮樣行為、提高空間學習記憶能力、以及增加社會交往行為的作用。這與以往對C57BL/6品系成年小鼠和Sprague-Dawley品系成年大鼠的研究結(jié)果有所不同［18，20］。

以往的成年期社會隔離的研究結(jié)果表明，對7～8周齡的Sprague-Dawley大鼠進行10～12周的社會隔離后，發(fā)現(xiàn)SD大鼠會產(chǎn)生焦慮樣和快感缺乏樣行為［18］，以及對8周齡的雌性C57BL/6小鼠進行8周的社會隔離后，發(fā)現(xiàn)社會隔離會使小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為、PPI降低等異常行為學［20］。對12周齡的C57BL/6小鼠進行3個月的社會隔離后，可發(fā)現(xiàn)被隔離小鼠中腦表觀遺傳學的改變［19］。而對于成年Wistar大鼠單獨隔離30～31 d后，活動性增強，但是其在中央?yún)^(qū)域所經(jīng)路徑占總路徑之比與對照組相比，無明顯差異，提示成年大鼠隔離后與對照組有著類似的焦慮水平，而且社會隔離組的大鼠氧化代謝明顯受到抑制［21］。在對成年斑馬魚90 d的社會隔離后，結(jié)論表明社會隔離對其有抗焦慮作用，暗示標準密度的生活環(huán)境對斑馬魚可能是一種不良的應激源，而且其5-HT水平有所下降［23］。這說明成年期社會隔離對動物的影響存在品系和性別的差異。

社會隔離對小鼠行為的影響與大腦的不同發(fā)育階段密切相關。大腦突觸和受體的產(chǎn)生及消除主要發(fā)生在從兒童期、青春期向成年期轉(zhuǎn)變的過程，這也是大腦發(fā)育最為關鍵和敏感的階段，應激在這些階段對大腦的作用表現(xiàn)出與對成熟大腦不同的影響和作用規(guī)律。相對于成年動物，環(huán)境應激對未成年動物的行為和神經(jīng)生理產(chǎn)生更為強烈和持久的影響［24］，但在成年期，大腦突觸和受體的產(chǎn)生和消除仍存在，所以環(huán)境應激會對成年動物的行為學造成一定的影響［25］。目前關于社會隔離的研究主要集中于幼年期（斷乳后21 d）和青少年期，實驗動物被隔離的時間集中于4～6周，也有短期隔離為2周［24］。所以，本研究選取成年雄性BALB/C小鼠的社會隔離進行了相關研究，此項研究對社會隔離這一研究起到一定的補充作用。本研究進行社會隔離的時間為40 d，相比于以往的研究，社會隔離的時間較短，且選取的動物品系、性別有所不同［18-21］，所以實驗結(jié)論有所差異。曾有研究表明，富足的生活條件對于接受慢性溫和應激的青少年期雌性BALB/C小鼠的行為和神經(jīng)可塑性有保護作用［26］。本研究組分析可能是因為實驗動物成年后長期處于單養(yǎng)環(huán)境，食物、飲水供給充分，這有可能會對嚙齒類的天性產(chǎn)生一定的影響，一定程度上掩蓋了其尋求維持自己生存條件的本能，同時造成動物對于社會交往的需求有所增加。此外，單籠飼養(yǎng)的相對富足生活條件使成年小鼠更易獲得食物，減少了與同伴之間的競爭，可能會對小鼠的情緒和認知有促進作用。關于產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能的分子機制目前研究較少，接下來本研究組將會嘗試這方面的研究。

［1］殷盛明，李崧，于德欽，等.社會隔離對實驗動物行為的影響［J］.中華行為醫(yī)學與腦科學雜志，2011，20（10）：952-954.

［2］Ago，Y，Takahashi K，Nakamura S，et al.Anxiety-like and exploratory behaviors of isolation-reared mice in the staircase test［J］.Journal of Pharmacological Sciences，2007，104（2）：153-158.

［3］Bianchi，M，F(xiàn)one KF，Azmi N，et al.Isolation rearing induces recognition memory deficits accompanied by cytoskeletal alterations in rat hippocampus［J］.The European Journal of Neuroscience，2006，24（10）：2894-2902.

［4］Fone KC，Porkess MV.Behavioural and neurochemical effects of post-weaning social isolation in rodents-relevance to developmental neuropsychiatric disorders［J］.Neuroscience and BiobehavioralReviews，2008，32（6）：1087-1102.

［5］Hellemans KG，Benge LC，Olmstead MC.Adolescent enrichment partially reverses the social isolation syndrome［J］. Developmental Brain Research，2004，150（2）：103-115.

［6］Koike H，IbiD，Mizoguchi H，et al.Behavioral abnormality and pharmacologic response in social isolation-reared mice［J］.Behavioural Brain Research，2009，202（1）：114-121.

［7］Voikar V，Polus A，Vasar E，et al.Long-term individual housing in C57BL/6Jand DBA/2mice：assessment of behavioral consequences［J］.Genes，Brain，and Behavior，2005，4（4）：240-252.

［8］Wilkinson LS，Killcross SS，Humby T，et al.Social isolation in the rat produces developmentally specific deficits in prepulse inhibition of the acoustic startle response without disrupting latent inhibition［J］.Neuropsy Chopharmacology，1994，10（1）：61-72.

［9］Day-Wilson KM，Jones DN，Southam E，et al.Medial prefrontal cortex volume loss in rats with isolation rearinginduced deficits in prepulse inhibition ofacoustic startle［J］. Neuroscience，2006，141（3）：1113-1121.

［10］Dang YH，Liu P，Ma R，et al.HINT1 is involved in the behavioral abnormalities induced by social isolation rearing［J］.Neuroscience Letters，2015，607：40-45.

［11］Ibi D，Takuma K，Koike H，et al.Social isolation rearing-induced impairment of the hippocampal neurogenesis is associated with deficits in spatial memory and emotion-related behaviors in juvenile mice［J］.Journal of Neurochemistry，2008，105（3）：921-932.

［12］Leser N，Wagner S.The effects of acute social isolation on long-term social recognitionmemory［J］.Neurobiology of Learning and Memory，2015，124：97-103.

［13］Shao F，Jin J，Meng Q，et al.Pubertal isolation alters latent inhibition and DA in nucleus accumbens of adult rats［J］.Physiology&Behavior，2009，98（3）：251-257.

［14］Skelly MJ，Chappell AE，Carter E，et al.Adolescent social isolation increases anxiety-like behavior and ethanol intake and impairs fear extinction in adulthood：Possible role of disrupted noradrenergic signaling［J］.Neuropharmacology，2015，97：149-159.

［15］Teo，AR，Lerrigo R，Rogers MA.The role of social isolation in social anxiety disorder：a systematic review and meta-analysis［J］.Journal of Anxiety Disorders，2013，27（4）：353-364.

［16］Advani T，Hensler JG，Koek W.Effect of early rearing conditions on alcohol drinking and 5-HT1A receptor function in C57BL/6Jmice［J］.The International Journal of Neuropsychopharmacology，2007，10（5）：595-607.

［17］Shao F，Han X，Shao S，et al.Adolescent social isolation influences cognitive function in adult rats［J］.Neural Regeneration Research，2013，8（11）：1025-1030.

［18］Wallace DL，Han MH，Graham DL，et al.CREB regulation of nucleus accumbens excitability mediates social isolation-induced behavioral deficits［J］.Nature Neuroscience，2009，12（2）：200-209.

［19］Siuda D，Wu Z，Chen Y，et al.Social isolation-induced epigenetic changes inmidbrain of adultmice［J］.Journal of Physiology and Pharmacology，2014，65（2）：247-255.

［20］Martin AL，Brown RE.The lonelymouse：verification of a separation-induced modelofdepression in femalemice［J］. Behavioural Brain Research，2010，207（1）：196-207.

［21］Zhuravliova E，Barbakadze T，Zaalishvili E，et al.Social isolation in rats inhibits oxidative metabolism，decreases the content of mitochondrial K-Ras and activatesmitochondrial hexokinase［J］.Behavioural Brain Research， 2009，205（2）：377-383.

［22］吳俊芳，劉惠.現(xiàn)代神經(jīng)科學研究方法［M］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2006：700-702.

［23］Shams S，Chatterjee D，Gerlai R.Chronic social isolation affects thigmotaxis and whole-brain serotonin levels in adult zebrafish［J］.Behavioural Brain Research，2015，292：283-287.

［24］王前，殷盛明，李盛龍，等.社會隔離對于小鼠空間和非空間認知功能的影響［J］.中華行為醫(yī)學與腦科學雜志，2011，20（9）：793-795.

［25］Hall FS.Social deprivation of neonatal，adolescent，and adult rats has distinct neurochemical and behavioral consequences［J］.Critical Reviews in Neurobiology，1998，12（1-2）：129-162.

［26］Vega-Rivera NM，Ortiz-Lopez L，Gomez-Sanchez A，etal. The neurogenic effects of an enriched environment and its protection against the behavioral consequences of chronic mild stress persistent after enrichment cessation in six-month-old female Balb/C mice［J］.Behavioural Brain Research，2016，301：72-83.

Effects of social isolation on neuroethology in adultmale BALB/C m ice

MA Xue1DONG Yingying2LIU Peng3TANG Ling1DANG Yonghui3
1.Qide College，Xi＇an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi＇an 710061，China；2.Department of Psychiatry，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Xi＇an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi＇an 710061，China；3.College of Medicine and Forensics，Health Science Center of Xi＇an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi＇an 710061，China

Ob jective To investigate effects of social isolation on neuroethology in adultmale BALB/C mice.M ethods 8 weeks old male BLAB/Cmicewere randomly separated into housed group group（GH group，n=16）and social-isolated group（SIgroup，n=16）.GH group were as control，4 mice in each cage，and mice of SIgroup were amouse in single cage.A series of behavioral testswere performed after 40 d，including open field test（OFT），novel object recognition test（NORT），elevated plusmaze test（EPMT），forced swimming test（TST），T-maze test（TMT），social interaction test（SIT）and intruder-evoked aggressive test（IEAT）.The results of two groups were compared.Results In the FST，the immobility time of the SIgroup was significantly less than that of the GH group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.In the EPMT，the duration time in the open arms of SI group was significantly more than GH group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.In the TMT，SIgroup exhibited higher accuracy than GH group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.In the SIT，SI group displayed more social interaction than GH group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Social isolation in adulthood may have antidepressant，antianxiety，improving cognitive function and enhancing social interaction behaviors effect on adult male BALB/Cmice.

Social isolation；Adultmice；Neuroethology；BALB/Cmice

R338

A

1673-7210（2016）06（c）-0013-05

國家自然科學基金資助項目（81371473）。

黨永輝（1974-），男，博士，副教授；研究方向：神經(jīng)科學。

（2016-03-20本文編輯：蘇暢）