急性STEMI患者血同型半胱氨酸與Kv1.3通道、肌鈣蛋白關(guān)系的研究

王玉嶺，馮建宇，曾祥飛，楊紹兵，嚴(yán)寧，賈紹斌

急性STEMI患者血同型半胱氨酸與Kv1.3通道、肌鈣蛋白關(guān)系的研究

王玉嶺1，2，馮建宇3，曾祥飛2，楊紹兵2，嚴(yán)寧2，賈紹斌4△

目的探討急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平與淋巴細(xì)胞電壓門控性鉀通道（Kv1.3通道）、Kv1.3通道與心肌肌鈣蛋白I（cTnI）水平的相關(guān)性。方法80例STEMI患者根據(jù)血漿Hcy水平分為STEMI合并高同型半胱氨酸血癥（Hhcy）組（STEMI+Hhcy組，Hcy＞15 μmol/L，n=41）和對照組（STEMI組，Hcy≤15 μmol/L，n=39）。抽取血標(biāo)本后全自動生化儀測定Hcy、cTnI及血脂等指標(biāo)，密度梯度離心法提取淋巴細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Kv1.3 mRNA表達(dá)，Western blot檢測Kv1.3蛋白表達(dá)。結(jié)果STEMI+Hhcy組cTnI水平高于STEMI組（μg/L:22.997±5.880 vs.12.881±6.343；P＜0.01）。多元線性回歸分析顯示年齡、性別、高血壓病、糖尿病、吸煙史、家族史、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）對Hcy無明顯影響（P＞0.05）。STEMI+Hhcy組Kv1.3通道m(xù)RNA和蛋白相對表達(dá)量（1.35±0.14和0.85±0.12）較STEMI組升高（1.00±0.07和0.64±0.05，P＜0.05）。Hcy水平與Kv1.3通道m(xù)RNA和蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（r分別為0.299、0.542，P＜0.05）；Kv1.3通道蛋白表達(dá)水平與cTnI水平呈正相關(guān)（r=0.644，P＜0.05）。結(jié)論Hcy可能對淋巴細(xì)胞Kv1.3通道表達(dá)起著一定的作用，導(dǎo)致血漿cTnI水平升高。

心肌梗死；高同種半胱氨酸血癥；Kv1.3鉀通道；淋巴細(xì)胞；肌鈣蛋白I；急性ST段抬高型心肌梗死

大量臨床與基礎(chǔ)研究已明確同型半胱氨酸（Hcy）是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。Akyurek等［2］發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者血漿Hcy水平明顯高于不穩(wěn)定型心絞痛和穩(wěn)定型心絞痛患者，但Hcy促動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚不完全清楚。淋巴細(xì)胞浸潤貫穿于動脈粥樣斑塊形成及穩(wěn)定斑塊發(fā)展為易損斑塊的全過程，電壓門控性鉀通道（Kv1.3通道）優(yōu)勢表達(dá)于T淋巴細(xì)胞等免疫系統(tǒng)細(xì)胞上，通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞膜電位和胞內(nèi)鈣信號，分泌多種促炎性因子引發(fā)血管壁免疫炎癥反應(yīng)，促使粥樣斑塊破裂，導(dǎo)致急性心肌梗死發(fā)生［3］。有研究認(rèn)為Hcy促斑塊破裂與其促淋巴細(xì)胞炎癥反應(yīng)作用有關(guān)，但其具體機(jī)制尚不清楚［4］。臨床廣泛檢測的心肌肌鈣蛋白I（cTnI）是診斷急性心肌梗死最特異和敏感的指標(biāo)［5］，Hcy、cTnI與淋巴細(xì)胞活化的關(guān)鍵通道Kv1.3之間的關(guān)系，目前鮮有報(bào)道。本研究通過測定我院住院的急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者血漿Hcy水平，觀察Hcy、cTnI水平與Kv1.3通道m(xù)RNA和蛋白表達(dá)水平之間的關(guān)系，探討Hcy在STEMI中可能的致病機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2015年1月—11月在我院心臟中心住院的急性STEMI患者80例，其中男51例，女29例，平均年齡（60.52±11.31）歲，急性冠狀動脈綜合征（ACS）診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國心臟病協(xié)會（AHA）、美國心臟病學(xué)會（ACC）指南［5］。以血漿Hcy＞15 μmol/L作為高同型半胱氨酸血癥（Hhcy）的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，將患者分為STEMI合并Hhcy組（STEMI+Hhcy組，Hcy＞15 μmol/L，n=41）和STEMI組（Hcy≤15 μmol/L，n=39）。所有患者排除心源性休克、重度心力衰竭、嚴(yán)重室性心律失常，嚴(yán)重肝、腎功能異常，各種急、慢性感染，惡性腫瘤、其他免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)疾病，近期服用葉酸、B族維生素藥物，以及懷孕或哺乳期婦女。

1.2 主要試劑與儀器淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶公司；Trizol購自美國Life Technologies公司；反轉(zhuǎn)錄及SYBR Green qPCR試劑購自美國Thermo公司；全蛋白提取試劑盒及BCA蛋白定量檢測試劑盒均購自凱基生物公司；Kv1.3和GAPDH引物由上海生工生物工程公司合成；鼠抗人Kv1.3單克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）購自北京中杉金橋生物科技有限公司；熒光定量PCR儀、蛋白電泳、轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；Hcy檢測儀（德國拜耳公司ADVIA2400）；肌鈣蛋白檢測儀（美國ABBOTT公司AXSYM）；血脂檢測儀（日本奧林巴斯公司OLYMPUSAU640）。

1.3 研究方法

1.3.1 危險(xiǎn)因素的評估詳細(xì)記錄研究對象臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、冠心?。–HD）家族史、高血壓病史、糖尿病史等。對實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)分析，包括Hcy、cTnI、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）等指標(biāo)。

1.3.2 血漿Hcy和各項(xiàng)生化指標(biāo)測定受檢者入院即刻抽取靜脈血4 mL檢測cTnI。于次日清晨空腹（禁食、禁飲8 h以上）采取靜脈血7 mL，2 mL置于含有2%乙二胺酸二鈉抗凝試管中，于我院檢驗(yàn)科測定Hcy；5 mL置于不含抗凝劑的試管中，采用氧化酶法檢測TC、TG、HDL-C，LDL-C用Friedewald公式法計(jì)算:LDL-C=TC－（HDL-C+TG/2.2）。

1.3.3 淋巴細(xì)胞的分離及提取抽取受檢者入院次日晨肘正中靜脈血5 mL，常規(guī)肝素鈉抗凝。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。生理鹽水1∶1稀釋抗凝血后緩慢加于等體積的淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min離心20 min，收集第2層細(xì)胞再次加入生理鹽水充分混勻后，2 000 r/min離心20 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，取含淋巴細(xì)胞的上清液，以去除貼壁單核細(xì)胞。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Kv1.3 mRNA表達(dá)采用TRIzol reagent操作方法提取淋巴細(xì)胞總RNA。檢測RNA純度及濃度后，嚴(yán)格按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA。將cDNA行PCR反應(yīng)鑒定是否特異擴(kuò)增目的片段。內(nèi)參基因GAPDH引物上游5′-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′，下游5′-ACTGTGGTCATGAGCCACGAGAAAT-3′，產(chǎn)物大小135 bp；Kv1.3引物上游5′-GGGATTGCTCATCTTCTTCCT-3′，下游5′-TATCGCCGTAACCCACTGTT-3′，產(chǎn)物大小155 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系:SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，Nuclease-Free Water補(bǔ)足反應(yīng)體系至25 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，采用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，mRNA表達(dá)水平以2－ΔΔCt值表示。

1.3.5 Western blot檢測Kv1.3蛋白表達(dá)采用全蛋白提取試劑盒行淋巴細(xì)胞全蛋白的提取，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)樣品，以4∶1體積比加入5×上樣緩沖液，混勻后100℃煮沸變性5 min。每孔加入20 μL樣品于10%SDSPAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉（TBST稀釋）封閉，室溫?fù)u床2 h。加入稀釋于脫脂奶粉中的鼠抗Kv1.3單克隆抗體（1∶300）和鼠抗β-actin單克隆抗體（1∶5000），置于4℃搖床過夜。取出膜用TBST于室溫下洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶5 000），室溫孵育1 h。再次TBST洗膜后，將加強(qiáng)型ECL試劑A、B等體積混勻后滴到膜上約1 min，暗室曝光3 min，洗膠片。Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，首先進(jìn)行組間均衡性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Hcy影響因素采用多元線性回歸分析。Pearson線性相關(guān)分析法計(jì)算相關(guān)系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12 組間一般臨床資料比較STEMI+Hhcy組cTnI、Hcy水平明顯高于STEMI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），2組其余指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 Hcy影響因素的回歸分析以Hcy為因變量，對分類變量進(jìn)行賦值:性別，男=1，女=0；高血壓病史，有=1，無=0；糖尿病史，有=1，無=0；CHD家族史，有=1，無=0；吸煙史，有=1，無=0，與TG、TC、HDL-C、LDL-C等作為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示，以上因素對Hcy無明顯影響（P＞0.05），見表2。

2.3 淋巴細(xì)胞Kv1.3 mRNA表達(dá)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增后，于2%瓊脂糖電泳，經(jīng)紫外線下掃描分析，GAPDH為135 bp，Kv1.3為155 bp，符合設(shè)計(jì)的片段長度。STEMI+Hhcy組Kv1.3mRNA相對表達(dá)水平（1.35±0.14）高于STEMI組（1.00±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.035，P＜0.05）。

2.4 Kv1.3蛋白表達(dá)STEMI+Hhcy組Kv1.3蛋白相對表達(dá)水平（0.85±0.12）高于STEMI組（0.64± 0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.122，P＜0.05），見圖1。

Fig.1Western blot assay showing electrophoregram of Kv1.3 protein expression in two groups圖1 Western blot法檢測2組Kv1.3蛋白表達(dá)電泳圖

Tab.1Comparison of general clinical data between two groups表1 2組患者臨床基線資料比較

2.5 相關(guān)性分析結(jié)果Hcy水平與Kv1.3 mRNA和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（r分別為0.299、0.542，均P＜0.05）。Kv1.3蛋白表達(dá)水平與cTnI水平呈正相關(guān)（r=0.644，P＜0.05）。

3 討論

Hcy是一種含硫氨基酸，為蛋氨酸代謝過程中重要中間產(chǎn)物［1］。Nygard等［7］對納入4 000例研究對象的薈萃分析顯示，10%的CHD與Hcy升高有關(guān)。Wald等［8］研究分析表明，Hcy與心血管疾病間存在因果關(guān)系。Shenoy等［9］研究表明，Hcy水平與冠狀動脈疾病的嚴(yán)重程度具有良好的相關(guān)性。Liu等［10］的研究結(jié)果亦顯示，急性心肌梗死患者Hcy水平明顯高于不穩(wěn)定型心絞痛、穩(wěn)定型心絞痛和正常人群。本研究顯示血脂對Hcy無明顯影響。關(guān)于Hcy與血脂的關(guān)系，結(jié)論尚不一致，Hildebrandt等［11］認(rèn)為Hcy水平與TG、TC、HDL-C、LDL-C水平均無相關(guān)性，黃旭映等［12］認(rèn)為與TC、TG呈正相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。

動脈粥樣硬化是一種有免疫反應(yīng)成分參與的慢性炎性反應(yīng)［13］。近年的研究證明，淋巴細(xì)胞上的離子通道在免疫功能調(diào)節(jié)中具有重要的作用。外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)兩種類型的鉀離子通道，即電壓依賴性鉀通道和鈣激活鉀通道，其中Kv1.3通道在T淋巴細(xì)胞激活、炎癥因子分泌和細(xì)胞增殖中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［14］。Panyi等［15］研究表明在每個(gè)靜息態(tài)人效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（TEM）膜上約表達(dá)200～400個(gè)Kv1.3通道，經(jīng)抗原或有絲分裂原激活后通道數(shù)量上升至約1 500個(gè)。郭麗芬等［16］進(jìn)行的膜片鉗研究表明，ACS患者外周血淋巴細(xì)胞Kv1.3通道電流及Kv1.3蛋白表達(dá)均較對照組明顯升高。研究表明T淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后，Kv1.3通道活化，介導(dǎo)鉀離子外流增多，細(xì)胞膜的超極化為胞外鈣離子通過鈣釋放激活的鈣通道（CRAC通道）內(nèi)流提供驅(qū)動力，鈣離子進(jìn)一步通過級聯(lián)反應(yīng)激活核轉(zhuǎn)錄因子，如活化T細(xì)胞核因子（NFAT），促進(jìn)γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子（TNF）等炎性因子分泌［17］。這些炎性因子可激活巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，產(chǎn)生各種蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，抑制新的膠原蛋白合成，削弱纖維帽使其變薄，從而使斑塊易于破裂引起急性血栓形成［15］。

Zhang等［18］研究發(fā)現(xiàn)Hhcy可通過氧化應(yīng)激機(jī)制增強(qiáng)伴刀豆球蛋白介導(dǎo)的小鼠T淋巴增殖和IFN-γ和IL-2的分泌。Fefelova等［4］研究發(fā)現(xiàn)高濃度Hcy與離子型谷氨酸受體的相互作用可導(dǎo)致小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)的增加，并使血漿TNF-α、IFN-γ、IL-17等水平增高。Sun等［19］研究發(fā)現(xiàn)Hhcy患者血漿調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（RANTES）水平高于無Hhcy的對照組。本研究結(jié)果顯示，急性STEMI合并Hhcy患者較急性STEMI患者淋巴細(xì)胞Kv1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，且Hcy水平與Kv1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示心肌梗死患者Hcy水平與Kv1.3轉(zhuǎn)錄和翻譯水平關(guān)系密切。

Tab.2The regression analysis of influence factors of Hcy表2 Hcy影響因素的回歸分析

當(dāng)心肌壞死時(shí)，肌鈣蛋白的出現(xiàn)和增高是反映心肌急性壞死的關(guān)鍵指標(biāo)，尤其在心肌梗死早期范圍很局限，無心電圖的改變時(shí)，急性心肌梗死的診斷主要依靠檢測肌鈣蛋白。Korkmaz等［20］通過對244例發(fā)作急性胸痛的患者的研究發(fā)現(xiàn)，在肌鈣蛋白陽性組中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值（NLR）明顯升高。Arbel等［21］研究提示NLR可作為評估冠狀動脈病變程度的臨床指標(biāo)。Sari等［22］對180例行冠狀動脈造影術(shù)的患者結(jié)果對比分析表明，NLR與SYNTAX積分和GENSINI積分具有顯著正相關(guān)性。本研究進(jìn)一步對淋巴細(xì)胞膜離子通路進(jìn)行觀察，Kv1.3表達(dá)水平與cTnI水平之間具有正相關(guān)性，提示高濃度Hcy可通過上調(diào)Kv1.3通道的表達(dá)，引起淋巴細(xì)胞分泌更多的炎性物質(zhì)，這可能是其促使動脈粥樣硬化斑塊破裂，導(dǎo)致血清cTnI升高、急性STEMI發(fā)生的機(jī)制之一。

近年來對于T細(xì)胞介導(dǎo)的多發(fā)性硬化癥［23］、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［24］等自身免疫性疾病的研究中，已證實(shí)應(yīng)用Kv1.3通道阻滯劑四氨基吡啶（4-AP）、四乙銨（TEA）可阻斷Kv1.3通道，抑制TEM細(xì)胞的激活，從而減輕免疫損傷。結(jié)合本研究，Kv1.3通道可能成為冠心病伴Hhcy患者新的治療靶點(diǎn)。但由于本研究樣本量較小，關(guān)于Hcy如何實(shí)現(xiàn)對淋巴細(xì)胞細(xì)胞Kv1.3通道表達(dá)的調(diào)控，需要進(jìn)一步探討。

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（2016-03-07收稿2016-07-21修回）

（本文編輯李國琪）

Study on relationship between plasma homocysteine，Kv1.3 channel and troponin in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction

WANG Yuling1，2，F(xiàn)ENG Jianyu3，ZENG Xiangfei2，YANG Shaobing2，YAN Ning2，JIA Shaobin4△
1 Maternal and Child Health Hospital of Luochuan County，Yanan 727400，China；2 Ningxia Medical University；3 Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University；4 Department of Cardiology，General Hospital of Ningxia Medical University△

ObjectiveTo investigate the relationship between plasma homocysteine（Hcy），Kv1.3 channel and cardiac troponinI（cTnI）in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction（STEMI）.MethodsAccording to the level of Hcy，80 STEMI patients were divided into STEMI with Hhcy group（Hcy＞15 μmol/L，n=41）and control group（STEMI group，Hcy≤15 μmol/L，n=39）.The Hcy，blood lipid and cTnI were detected with automatic biochemistry analyzer，respectively.Peripheral lymphocytes were isolated by ficoll density gradient centrifugation.Real-time PCR was used to detect mRNA expression of Kv1.3，and Western blot assay was used to detect protein expression of Kv1.3.ResultscTnI concentrations were obviously higher in STEMI with Hhcy group than those in STEMI group（μg/L:22.997±5.880 vs. 12.881±6.343；P＜0.01）.Multiple linear regression analysis showed that age，gender，hypertension，diabetes mellitus，smoking，family history，total cholesterol（TC），triglyceride（TG），high density lipoprotein-cholesterol（HDL-C）and low density lipoprotein-cholesterol（LDL-C）had no obvious influence on Hcy（P＞0.05）.The relative expression levels of Kv1.3 mRNA and protein were significantly higher in STEMI with Hhcy group（1.35±0.14，0.85±0.12）than those in STEMI group（1.00±0.07，0.64±0.05，P＜0.05）.Moreover，there was a positive relation between Hcy level and the mRNA and proteinexpression of Kv1.3 channel（r=0.299，r=0.542，P＜0.05）.There was a positive relation between protein expression levels of Kv1.3 channel and cTnI（r=0.644，P＜0.05）.ConclusionOur results support that Hcy could exacerbate the concentration of cTnI through playing an important role in the Kv1.3 mRNA and protein expression in lymphocytes.

myocardial infarction；hyperhomocysteinemia；Kv1.3 potassium channel；lymphocytes；troponin I；acute ST-segment elevation myocardial infarction

R541.4

A

10.11958/20160128

寧夏醫(yī)科大學(xué)優(yōu)勢學(xué)科群建設(shè)科研項(xiàng)目（xy2014016）

1延安，洛川縣婦幼保健院（郵編727400）；2寧夏醫(yī)科大學(xué)；3第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心臟外科；4寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心

王玉嶺（1981），女，碩士在讀，主要從事動脈粥樣硬化機(jī)制研究

△通訊作者E-mail:jsbxn@163.com