干擾 ATM基因表達增強胃癌細胞 AGS的放射敏感性

鄭 旭　劉 丹　劉大偉　劉 帆

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤放射治療科　沈陽 110032）

干擾 ATM基因表達增強胃癌細胞 AGS的放射敏感性

鄭 旭劉 丹劉大偉劉 帆

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤放射治療科沈陽 110032）

為探討RNA干擾共濟失調(diào)毛細血管擴張性突變（Ataxia-telangiectasia mutated， ATM）基因表達后對胃癌細胞AGS放射敏感性的影響，通過構(gòu)建ATM基因RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AGS細胞，獲得干擾效率高的克隆細胞AGS-Ri-ATM，并采用RT-PCR和Western blot分別檢測mRNA和蛋白表達水平，平板克隆形成實驗觀察細胞經(jīng)放射后對細胞生長的影響，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡情況。檢測結(jié)果顯示其ATM基因表達被干擾下調(diào)。經(jīng)X射線照射至不同吸收劑量，AGS-Ri-ATM平板克隆形成數(shù)量/率遠低于AGS-Vector的平板克隆形成數(shù)量/率，差異顯著（p＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。流式細胞術(shù)檢測顯示當(dāng)吸收劑量為4 Gy時，AGS-Ri-ATM被阻滯在G1期，同時在12 h后出現(xiàn)明顯的凋亡想象。結(jié)果表明，ATM基因被干擾后可以誘導(dǎo)細胞周期的阻滯，以及凋亡的增加而增強AGS細胞的放射敏感性。

毛細血管擴張共濟失調(diào)突變基因，RNA干擾，胃癌，放射敏感性

CLCQ691， TL7

胃癌是我國的常見腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位于所有癌癥的第二和第三位［1］，嚴重威脅著我國人民的身心健康。目前胃癌的治療通常首選手術(shù)，但大多數(shù)國內(nèi)就診的患者一經(jīng)查出胃癌已達中晚期無法進行手術(shù)。有很多患者需要通過化療、放療或放化療結(jié)合的方式進行治療，但是胃癌放療效果不佳的問題一直困擾著醫(yī)務(wù)人員和患者。

大量的研究報道表明，輻照后誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，尤其是DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力會使腫瘤細胞對放化療產(chǎn)生耐受抵抗力［2］。其中，共濟失調(diào)毛細血管擴張性突變（Ataxia-telangiectasia mutated，ATM）基因主要參與細胞周期調(diào)控、DNA損傷的識別與修復(fù)過程，可以感知輻射誘導(dǎo)的受損DNA雙鏈斷裂，通過激活p53和p21等基因來激活G1/S期檢測點等的方式，使損傷細胞停止在周期特定節(jié)點，并對其DNA進行修復(fù)［3-4］。本研究的目的是探討ATM蛋白對胃癌細胞在放療過程中的影響。

1　材料與方法

1.1材料

人胃癌細胞系 AGS購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞庫；TRizol、LipofectaminTM2000購自Invitrogen （Life science）公司；ATM 干擾表達質(zhì)粒購自上海吉凱基因設(shè)計構(gòu)建合成，并提供細胞篩選所用的嘌呤霉素；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；ATM、β-actin引物有大連TaKaRa生物公司合成；逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自全式金（Transgen）公司；ATM、β-actin抗體購自ProteinTech公司，山羊抗兔二抗購自中杉金橋生物公司，Western Blot使用的PAGE膠配制試劑均購自Genestar公司。

1.2細胞培養(yǎng)

AGS細胞采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（Gibco公司），培養(yǎng)液中加入青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）。細胞按常規(guī)置37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.3脂質(zhì)體介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染

實驗使用脂質(zhì)體Lipofectimine 2000（Invitrogen公司），轉(zhuǎn)染前1 d將細胞接種至35 mm培養(yǎng)皿，調(diào)整細胞密度至說明書推薦密度，按照Lipofectimine 2 000使用說明書將10 μL脂質(zhì)體和4 μg質(zhì)粒分別加入到250 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育5 min，后將兩者混合均勻，靜置放置20 min后將其加入預(yù)先用磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline， PBS）清洗過并加有2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基的細胞內(nèi)，4～6 h后更換 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，48 h后收集細胞提取蛋白，Western Blot檢測瞬時轉(zhuǎn)染效果；同時經(jīng)含2 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選，獲取穩(wěn)定干擾ATM表達的克隆。

1.4細胞RNA提取

按照Trizol試劑一步法提取RNA。取對數(shù)生長期的細胞，棄除上清，按1 mL/10 cm2培養(yǎng)皿貼壁細胞加入相應(yīng)量的Trizol試劑，吹打數(shù)次使細胞裂解，再經(jīng)氯仿抽提（每1 mL Trizol加0.2 mL），異丙醇沉淀（每1 mL Trizol加入0.5 mL），75%乙醇（每1 mL Trizol加入1 mL）洗鹽，沉淀干燥后以適量DEPC-H2O溶解，1% Argrose膠鑒定，使用Thermo “NanoDrop 2000”微量紫外分光光度計進行濃度測定。

1.5RT-PCR檢測

取定量的總RNA 1 μg，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書逆轉(zhuǎn)合成cDNA。普通PCR反應(yīng)體系的總體積為20 μL，包括cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taq Mix（Transgen公司）10 μL，加雙蒸水至20 μL。擴增運行體系：95 ℃變性3 min，94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃延伸10 min。β-actin的表達水平作為內(nèi)參照，引物序列信息如下：ATM-F：'-CGTGCCAGAATGTGAACACC-3'，ATM-R：'-AGCCAATACTGGACTGGTGC-3'，擴增產(chǎn)物大小為152bp；β-actin-F：'-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3'，β-actin-R：5'-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'，擴增產(chǎn)物大小為150 bp。取10 μL LPCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。

1.6細胞蛋白免疫印跡實驗

待細胞長至80%～90%細胞密度時收集細胞，細胞裂解液裂解細胞，使用 NanoDrop儀器采用260/280 nm UV法測定蛋白濃度。將50 μg樣品加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，采用濕式電轉(zhuǎn)方法350 mA恒流冰浴轉(zhuǎn)膜（PVDF，Pharmacia公司）120 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加一抗后放入4 ℃冰箱中孵育過夜，ATM工作濃度為1∶500，β-actin工作濃度為1∶10 000稀釋；隔天后0.1% PBST洗膜液水平搖床清洗3次，10 min/次；加入辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（1∶2 000），室溫搖床緩慢作用1 h；0.1% PBST洗膜液水平搖床清洗3次，10 min/次，ECL發(fā)光液檢測，使用凝膠成像分析儀曝光拍照記錄。

1.7細胞照射方法

把細胞消化計數(shù)接種后，采用本院Varian2100C直線加速器6 MV X線為放射源。源皮距離100 cm照射，劑量率為200 cGy/min。照射時各孔培養(yǎng)液量相同，并根據(jù)實驗要求照射至不同吸收劑量。

1.8平板克隆形成實驗檢測細胞放射敏感性

將處于對數(shù)生長期的細胞消化成單細胞懸液后，接種500個細胞至60 mm培養(yǎng)皿中，經(jīng)X線照射至吸收劑量分別為0、2、4、6、8 Gy，每組重復(fù)3次。照射后置于恒溫37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d更換1次培養(yǎng)基；培養(yǎng)2周左右，待細胞克隆生長到一定大小時，去除培養(yǎng)基，終止培養(yǎng)，用冰甲醇固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染料染色15 min，PBS沖洗，晾干；使用高像素照相機拍攝細胞克隆形成，計數(shù)克隆個數(shù)，并按照“平板克隆形成率（%） =（細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）× 100%”計算。

1.9流式細胞術(shù)檢測細胞周期

將對數(shù)生長期的細胞用PBS清洗3次，胰酶消化細胞，接種至60 mm培養(yǎng)皿中。按0、6、12、24 h胰酶消化收集細胞，1 000 r/min離心5 min后，PBS重懸細胞后再次離心，留少量PBS液體，打散細胞，加入2 mL 70%乙醇4 ℃固定過夜；1 000 r/min離心5 min后去除乙醇，用PBS將細胞清洗兩次，加入Binding buffer溶液100 μL，再加入碘化丙啶溶液400 μL，混勻，避光反應(yīng)15 min即可使用流式細胞儀進行檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件，以配對t檢驗進行統(tǒng)計分析，p＜0.05為差異有顯著性。

2　結(jié)果

2.1干擾ATM基因表達克隆的構(gòu)建

使用表達ATM基因的AGS細胞采用吉凱基因公司構(gòu)建的 GV248-Ri-ATM質(zhì)粒用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染細胞并經(jīng)含2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行篩選，約1個月后形成穩(wěn)定干擾ATM基因表達的單克隆?？寺〖毎麛U大培養(yǎng)后提取 RNA和蛋白分別經(jīng)PCR和Western Blot鑒定， 結(jié)果見圖1。圖1（a）顯示的mRNA水平的檢測結(jié)果，相比較空載細胞AGS-Vector，經(jīng)ATM基因干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染得到的克隆AGS-Ri-ATM的mRNA表達明顯減少。ATM基因的蛋白表達水平的檢測結(jié)果（圖1（b））與mRNA水平的結(jié)果基本一致，說明穩(wěn)定敲減 ATM基因表達的AGS細胞構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)的實驗。

2.2平板克隆形成實驗檢測結(jié)果

將空載細胞AGS-Vector和ATM基因干擾細胞AGS-Ri-ATM各500個，分別接種至直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，分別經(jīng)X射線照射至5個不同劑量后，繼續(xù)培養(yǎng)2周，結(jié)果如圖2所示。

在吸收劑量為 0 Gy時，AGS-Vector細胞和AGS-Ri-ATM細胞形成的克隆大小和數(shù)目基本無差異，但是隨著吸收劑量的升高，平板克隆形成的個數(shù)也隨著下降，但是干擾表達ATM細胞，在2、4、6、8 Gy劑量下形成的克隆個數(shù)和克隆形成率均要少于Vector細胞，經(jīng)統(tǒng)計分析，兩者存在明顯差異，p＜0.05，具體見表1。

表1　不同吸收劑量下細胞克隆形成數(shù)/率Table 1　The colonies formation numbers/ratios of Ri-ATM at different doses of radiation

2.3細胞周期檢查結(jié)果

用于細胞周期檢測的細胞在收集前進行拍照記錄，同時進行比較細胞形態(tài)學(xué)分析。當(dāng)輻照至吸收劑量4 Gy時，分別收集0、6、12、24 h時的AGS-Ri-ATM細胞。結(jié)果如圖3和圖4所示。其中，圖3流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，在12 h后細胞出現(xiàn)凋亡峰，24 h凋亡峰更為明顯，而AGS空載細胞并沒有明顯的凋亡峰存在，同時細胞被阻滯在G1期。

圖4中細胞拍照顯示，12 h后AGS-Ri-ATM細胞形態(tài)出現(xiàn)了凋亡的細胞碎片，且細胞較AGS-Vector稀疏，細胞不夠豐滿充實。

3　討論

腫瘤放化療的目的是殺傷腫瘤細胞，促進細胞凋亡，或者阻滯細胞周期進展，但是在腫瘤細胞中同時又存在逃避凋亡的機制。正常細胞受到損傷時，尤其是DNA損傷時，細胞可以激活Checkpoint相關(guān)蛋白，使細胞停滯前進，以保證DNA修復(fù)后再繼續(xù)下一個進程［5］。有很多報道ATM基因是細胞周期檢查點的主要成員之一［6］，本研究使用表達ATM基因的AGS細胞為模型，通過干擾ATM基因的表達對放射的應(yīng)答產(chǎn)生了明顯的影響。在平板集落形成上，ATM基因表達被干擾的克隆細胞經(jīng)過照射后形成的克隆個數(shù)明顯減少，說明 ATM基因的表達對放療有抵制力。這與前面有些報道基本一致［7-9］。

王莉等［9］檢測了幾種胃癌細胞系中 ATM基因的表達情況，并對 ATM基因的功能進行了研究，觀察到ATM基因可以保護BGC823細胞抵制DNA損傷劑對其造成凋亡。本研究同樣使用了細胞周期流式細胞術(shù)實驗，發(fā)現(xiàn)AGS細胞中干擾ATM基因表達后可以明顯增強放射對其造成的凋亡，從實時拍攝的細胞圖片上也能清晰地觀察到，干擾細胞在照射12 h后已經(jīng)有凋亡細胞的跡象存在，細胞變得更加稀疏和上漂現(xiàn)象，表明已有細胞死亡。而表達ATM基因的AGS細胞則生長良好，沒有明顯的凋亡跡象。由此可見，ATM基因突變或者缺失時，會嚴重影響細胞損傷后的及時修復(fù)，導(dǎo)致細胞凋亡，同時也會表現(xiàn)出對放射或電離輻射的敏感性增強特性，因此，研究 ATM基因?qū)δ[瘤的影響有著非常重要的意義，同時對那些ATM基因正常表達的腫瘤細胞如何改造影響其對放化療的敏感性是非常有幫助的。

放射敏感性是放射治療腫瘤必須重視的一個問題，也是決定放療效果的關(guān)鍵所在，已有的報道中，甲基黃嘌呤被證實可以抑制 ATM基因路徑，從而增強腫瘤細胞的放射敏感性［10］。除此之外，還有另一種較有發(fā)展前景的放射增敏劑7-羥基星狀孢菌素（UCN-01），它可以抑制Chk1激酶的活性，作用于ATM基因下游的DNA損傷監(jiān)測點，從而提高腫瘤細胞敏感性［11］。在腫瘤治療過程中，如果能有更多有效的，毒性小的藥物或其他方式將細胞的 ATM基因喪失或阻滯，使其無法行使相應(yīng)的功能，則會增加腫瘤細胞對放射和輻射的敏感性［12］。對 ATM基因更加深入的研究將為腫瘤的預(yù)防、治療和放化療藥物敏感性問題提供更多的途徑和靶點。尤其對那些非手術(shù)治療的胃癌患者提供了治療的可能性。

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9王莉， 尹芳， 杜昱蕾， 等. ATM在人胃癌細胞系的表達及其在細胞 DNA損傷中的作用［J］. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010， 18（3）： 433-436. DOI： 10.3969/j.issn.1672-4992. 2010.03.001. WANG Li， YIN Fang， DU Yulei， et al. Expression of ATM gene in human gastric carcinoma cell lines and cellular responses to DNA damage［J］. Journal of Modern Oncology， 2010， 18（3）： 433-436. DOI： 10.3969/j.issn. 1672-4992.2010.03.001.

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Interference of ATM gene expression increasing the radiosensitivity of AGS cells

ZHENG XuLIU DanLIU DaweiLIU Fan
（Department of Radiation Oncology， the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110032， China）

To investigate the interference effect of ataxia-telangiectasia mutated （ATM） gene expression on the radiosensitivity of human gastric cancer AGS cells， the plasmid of interfering RNA was used to transfect AGS cells. The mRNA and protein expression levels of ATM gene were measured by RT-PCR and Western blot， respectively. The effect on cell growth after irradiation was analyzed by using the colonies formation assay. Cell cycle and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. The RNA interference plasmid of ATM gene was transfected into AGS cells and AGS-Ri-ATM cells were obtained successfully. The RT-PCR and Western blot results demonstrated that the expression of ATM gene was down-regulated in the AGS-Ri-ATM cells. The colonies formation numbers/ratios of AGS-Ri-ATM cells were less than those of AGS-Vector. The flow cytometry demonstrated that G1 arrest was induced and apoptosis appeared in AGS-Ri-ATM cells after irradiation at 4 Gy for 12 h， which was not observed in AGS-Vector cells. Interference of ATM expression increased the radiosensitivity of human gastric cancer AGS cells.

Ataxia-telangiectasia mutated （ATM） gene， RNA interference， Gastric cancer， Radiosensitivity

ZHENG Xu （male） was born in August 1984， and received his bachelor degree of radiation medicine from Jilin University in 2008. Now he is a physicist in Department of Radiation Oncology， the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University. E-mail： zhengxu19840826@163.com

27 April 2016； accepted 3 June 2016

Q691，TL7

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.050202

鄭旭，男，1984年8月出生，2008年于吉林大學(xué)獲放射醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位，現(xiàn)為中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤放射治療科物理師，從事腫瘤放射物理工作，E-mail： zhengxu19840826@163.com

初稿2016-04-27；修回2016-06-03