• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    茶提取物和納米表沒食子兒茶素沒食子酸酯對6-羥基多巴胺誘導的SH-SY5Y細胞保護作用

    2016-11-11 08:24:35閆敬娜羅理勇胡雅瓊
    食品科學 2016年1期
    關鍵詞:氨酸黃素存活率

    閆敬娜,羅理勇,2,胡雅瓊,3,曾 亮,2,*

    茶提取物和納米表沒食子兒茶素沒食子酸酯對6-羥基多巴胺誘導的SH-SY5Y細胞保護作用

    閆敬娜1,羅理勇1,2,胡雅瓊1,3,曾 亮1,2,*

    (1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.西南大學茶葉研究所,重慶 400715;3.中國民生銀行黃巖支行,浙江 臺州 318020)

    以6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導的SH-SY5Y細胞系作為帕金森?。≒arkinson’s disease,PD)體外細胞模型,探究茶提取物(L-茶氨酸、咖啡堿、茶多酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)、茶黃素、茶色素)和兩種納米EGCG對SH-SY5Y細胞的毒性和對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用的差異,綜合評價茶提取物治療PD的潛力。結(jié)果表明:茶提取物毒性作用由弱到強為茶多酚<L-茶氨酸<茶色素<咖啡堿<茶黃素<EGCG;保護作用由強到弱為茶黃素>EGCG>茶多酚>茶色素>咖啡堿>L-茶氨酸;茶黃素(0.2 μg/mL)和EGCG(0.9 μg/mL)預處理6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞,細胞存活率分別為(99.59±2.24)%和(95.84±2.50)%,保護作用明顯強于其他茶提取物;相較于EGCG,納米EGCG具有毒性作用更弱和保護作用更強的特點。由此可知,茶作為一種日常飲品,具有較好地治療PD的潛力。

    帕金森??;茶提取物;6-羥基多巴胺;SH-SY5Y細胞;納米表沒食子兒茶素沒食子酸酯

    帕金森?。≒arkinson’s disease,PD)是一種慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,是僅次于阿爾茨海默病之后的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病,患者多為中老年人,尤其是60 歲以上的老人[1]。PD病程較長,致殘率高,臨床表現(xiàn)以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直及姿勢平衡障礙為主要特征,還可能出現(xiàn)認知功能下降、情緒障礙等非運動癥狀[2]。目前PD的治療手段包括藥物、手術、細胞和基因治療[2-3],其中細胞和基因治療尚處于實驗階段。手術治療主要針對中晚期PD患者,采用腦深部電刺激法進行治療,但有報道稱這種方法可能產(chǎn)生認知功能減退的副作用[3]。藥物治療具有多靶點作用途徑、毒性相對較小、安全性好等潛在優(yōu)勢,因而受到越來越多的重視[4]。PD的治療藥物分為緩解癥狀和神經(jīng)保護兩大類[3],其中天然、高效的神經(jīng)保護性藥物開發(fā)已經(jīng)成為國際PD治療的研究熱點[2]。

    茶作為全球風靡的飲品之一,其消費量呈逐年增加的趨勢。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,F(xiàn)AO)的數(shù)據(jù)顯示,2010年全球茶葉消費量為400 萬t,增長率為5.6%;我國作 為世界最大茶葉消費國,2006、2010、2013年茶葉消費量分別為74.48、106、161.32 萬t[5-6]。茶含有豐富的生理活性物質(zhì),具有多種保健功能,如清除自由基、抗氧化、抗癌、抗誘變和抑菌等[7]。臨床研究表明,飲茶能降低PD的發(fā)病率,對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用[8];相較于其他神經(jīng)保護性藥物,茶的神經(jīng)保護作用具有多途徑、多靶點、低毒副作用和協(xié)同功效等優(yōu)點[9]。

    現(xiàn)已證實茶葉中的多種生理活性物質(zhì)具有神經(jīng)保護作用[10-12],但其神經(jīng)保護作用之間的差異性鮮見報道。此外,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)在生物體內(nèi)穩(wěn)定性差、利用率低[13-14];本實驗室前期研究表明納米EGCG較EGCG具有穩(wěn)定性高、靶向性強、生物利用率高等優(yōu)點[15]。本實驗以6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞系作為PD體外細胞模型[16-17],比較6 種茶提取物(L-茶氨酸、咖啡堿、茶多酚、EGCG、茶黃素、茶色素)和納米EGCG對SH-SY5Y細胞毒性作用和對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用的差異,綜合評價茶提取物治療PD的潛力,篩選出高效、低毒副作用的茶葉功能性物質(zhì)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞系 中國科學院細胞庫;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS) 美國Gibco公司;胰蛋白酶、杜氏磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline,PBS) 美國HyClone公司;4-羥乙基哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyerhyl) piperazine-1-erhaesulfonic acid,HEPES)、牛胰島素、亞甲基藍、戊二醛、L-茶氨酸(純度>98%)、咖啡堿(純度>98%) 美國Sigma公司;青鏈霉素混合液(雙抗) 北京鼎國生物技術有限責任公司;兒茶素(catechin,C)、表兒茶素(epicatechin,EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯((?)-gallocatechingallate,GCG)、茶黃素(theaflavin,TF1)、茶黃素-3-沒食子酸酯(theaflavin-3-gallate,TF-3G)、茶黃素-3’-沒食子酸酯(theaflavin-3’-gallate,TF-3’G)、茶黃素雙沒食子酸酯(theaflavin-3,3’-digallate,TFDG) 成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;茶多酚(純度>99.5%)、EGCG(純度>95%)、茶黃素(純度為54.017%,其中TF1含量為8.248%、TF-3G含量為11.438%、TF-3’G含量為5.062%、TFDG含量為29.269%) 長沙華誠生物科技有限公司;殼聚糖(chitosan,CS) 浙江奧興生物技術有限公司;葉酸(folic acid,F(xiàn)A)、三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate,TPP) 上海晶純生化科技股份有限公司;甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酸酯(methoxypolyethyleneglycol-succinimidyl-propionic acid ester,mPEG-SPA)、NH2-PEG-COOH 嘉興博美生物技術有限公司;普洱熟茶經(jīng)典系列7572 大益茶業(yè)集團。

    納米EGCG(實驗室自制)[18]:以CS、TPP為載體,并以FA和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)作靶向性修飾,采用離子凝膠技術制備兩種納米EGCG,即(FA+PEG)-EGCG-NPs-1和(FA+PEG)-EGCG-NPs-2。

    茶色素(實驗室自制):普洱熟茶7572以茶水比1∶20(m/V)的沸水浸提10 min,趁熱過濾,冷卻至室溫。濾液以水-乙醇為洗脫液,過大孔樹脂進行梯度洗脫,收集目標產(chǎn)物茶色素,冷凍干燥,-80 ℃條件下儲存?zhèn)溆谩=?jīng)檢測茶色素主要成分包括C(0.98%)、EC(3.31%)、EGC(6.67%)、ECG(0.56%)、EGCG(0.98%)、沒食子酸(43.48%)、咖啡堿(4.86%)、氨基酸(3.12%)、可溶性糖(10.55%)。

    1.2 儀器與設備

    SW-CJ-2FDA超潔凈細胞實驗工作臺 美國Airtech公司;3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱、LEGEND MACH 1.6R離心機、MULTISKAN GO酶標儀 美國Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡 日本Nikon公司;MX100-4A微孔板振蕩器 杭州奧盛儀器有限公司;PWC124分析天平(0.1 mg級) 上海京工實業(yè)有限公司;TOMY ES-315高壓蒸汽滅菌鍋 上海艾高德生物科技有限公司;85-2A磁力攪拌器 金壇市精達儀器制造廠;FD-1A-50真空冷凍干燥機 深圳邁瑞醫(yī)療國際股份有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)[19]

    SH-SY5Y細胞以高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 μg/mL青霉素)為細胞生長所需的完全培養(yǎng)基,無菌條件下,于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 d更換一次培養(yǎng)液,每3~5 d傳代一次。

    1.3.2 PD體外細胞模型的建立[20-21]

    取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞接種到96 孔板中,細胞濃度調(diào)節(jié)為1×105個/mL,無菌條件下,于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8~16 h,至細胞完全貼壁后,移除培養(yǎng)基。實驗組分別加入100 μL含不同濃度(10、50、100、150、200、300 μmol/L)6-OHDA的完全培養(yǎng)基,空白組僅添加完全培養(yǎng)基,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,采用亞甲基藍染色法檢測細胞存活率,并通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。

    1.3.3 茶提取物和納米EGCG對SH-SY5Y細胞的毒性作用[20-21]

    具體方法同1.3.2節(jié)。實驗組分別加入100 μL不同質(zhì)量濃度的茶提取物,分別為5、18、90、175、350 μg/mL的L-茶氨酸;2、10、20、40、80、200 μg/mL的咖啡堿;0.2、2、10、25、50、100 μg/mL的茶黃素;10、50、100、200、300、500 μg/mL的茶色素;10、50、100、200、500、1000 μg/mL的茶多酚;0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL的EGCG;(FA+PEG)-EGCG-NPs-1和(FA+PEG)-EGCG-NPs-2載有的EGCG質(zhì)量濃度為0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL,空白組僅添加完全培養(yǎng)基。采用亞甲基藍染色法檢測細胞存活率。當細胞存活率≥90%時說明樣品對細胞無毒性作用,反之則對細胞有毒性作用。

    1.3.4 茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用[20-21]

    以1×105個/mL濃度接種對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞于96 孔板中,無菌條件下,于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8~16 h,至細胞完全貼壁后,移除培養(yǎng)基。分為3 組:空白組、對照組和實驗組。實驗組添加100 μL含不同質(zhì)量濃度茶提取物或納米EGCG的完全培養(yǎng)基,空白組和對照組分別添加100 μL完全培養(yǎng)基,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后,移除培養(yǎng)基,實驗組和對照組添加100 μL含100 μmol/L 6-OHDA的完全培養(yǎng)基,空白組添加100 μL完全培養(yǎng)基,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后,采用亞甲基藍染色法檢測細胞存活率。

    茶提取物的質(zhì)量濃度分別為:5、18、90、175、 350 μg/mL L-茶氨酸;2、10、20、40、80 μg/mL咖啡堿;0.2、2、10、25、50 μg/mL茶黃素;10、50、100、200、300 μg/mL茶色素;10、50、100、200、500 μg/mL茶多酚;0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL EGCG;(FA+PEG)-EGCG-NPs-1和(FA+PEG)-EGCG-NPs-2載有的EGCG質(zhì)量濃度為0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL。

    1.3.5 亞甲基藍染色法檢測細胞存活率[22]

    取經(jīng)樣品處理后的 細胞懸液,移除培養(yǎng)基,并用PBS漂洗。每孔加入50 μL亞甲基藍溶液(含有0.6%亞甲基藍和1.25%戊二醛的HBSS),于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h對細胞進行染色。染色完畢后,去除亞甲基藍溶液,并用超純水漂洗干凈。每孔加入100 μL洗脫液(含有50%乙醇、49% PBS和1%乙酸),室溫條件下將96 孔板放置在水平搖床上保持20 min,至細胞完全溶解。采用酶標儀(570 nm)檢測每孔光密度(OD570nm)值,按照下式計算不同樣品處理后的細胞存活率。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    每個樣品均設3 次重復。表和圖中數(shù)據(jù)均表示為±s,方差分析和差異性分析(P<0.05)采用SPSS 19.0軟件進行運算,處理間平均值的比較用最小顯著差異法。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同濃度6-OHDA對SH-SY5Y細胞的影響

    采用不同濃度6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞24 h,篩選出建立PD體外細胞模型的最佳6-OHDA誘導濃度。由圖1可知,隨著6-OHDA濃度的增大,SH-SY5Y細胞存活率降低,且呈明顯的劑量依賴性;經(jīng)計算分析可知IC50為128.95 μmol/L。由圖2可知,空白組(6-OHDA濃度為0 μmol/L)的SH-SY5Y細胞生長良好,呈扁平多邊形或梭形,細胞數(shù)量較多;隨著6-OHDA濃度增大,SH-SY5Y細胞皺縮,呈圓形或橢圓形,細胞數(shù)量逐漸減少。有文獻報道6-OHDA誘導的PD體外細胞模型研究中,SH-SY5Y細胞存活率一般為30%~66%[16,21,23-24]。Guo Shuhong[20]和Tian[21]等在研究過程中采用100 μmol/L 6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞構(gòu)建PD體外研究模型時,其存活率分別為30%、35%;Lopes[16]和王莉莉[25]等在研究過程中分別采用35、15、100 μmol/L 6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞構(gòu)建PD體外研究模型時,其細胞存活率為50%;Tiong等[23]在研究過程中采用50 μmol/L 6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞構(gòu)建PD體外研究模型時,其細胞存活率約為58%。本實驗選取了0、10、50、100、150、200、300 μmol/L 6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞24 h,其中100 μmol/L 6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞24 h后細胞存活率為(59.75±1.32)%(圖1),且細胞形態(tài)基本正常,呈扁平多邊形或梭形(圖2C)。因此后續(xù)的實驗采用100 μmol/L 6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞構(gòu)建PD體外研究模型。

    圖1 不同濃度6-OHDA對SH-SY5Y細胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of 6-OHDA on SH-SY5Y cell viability

    圖2 不同濃度6-OHDA對SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響Fig.2 Morphology of SH-SY5Y cells treated with 6-OHDA

    2.2 茶提取物和納米EGCG對SH-SY5Y細胞的毒性作用

    采用不同質(zhì)量濃度的茶提取物和納米EGCG處理SH-SY5Y細胞24 h,確定其對SH-SY5Y細胞無毒性劑量范圍,以此作為SH-SY5Y細胞氧化損傷保護劑量范圍。如圖3所示,茶提取物和納米EGCG對SH-SY5Y細胞的無毒性劑量范圍分別是:L-茶氨酸,0~350 μg/mL;咖啡堿,0~80 μg/mL;茶黃素,0~50 μg/mL;茶色素,0~300 μg/mL;茶多酚,0~500 μg/mL;EGCG,0~45 μg/mL;(FA+PEG)-EGCG-NPs-1和(FA+PEG)-EGCG-NPs-2,0~140 μg/mL。由此可知,茶提取物對SH-SY5Y細胞的毒性作用由弱到強為茶多酚<L-茶氨酸<茶色素<咖啡堿<茶黃素<EGCG;納米EGCG對SH-SY5Y細胞的毒性作用較EGCG弱。

    圖3 茶提取物和納米EGCG對SH-SY5Y細胞存活率的影響Fig.3 Effect of different tea extracts on SH-SY5Y cell viability

    L-茶氨酸是茶葉中特有的一種氨基酸,占茶葉干質(zhì)量的1%~2%[26]。L-茶氨酸具有多種生理功能,如使人情緒穩(wěn)定和注意力集中、提高學習和記憶能力、抗疲勞、降血壓、抑制由谷氨酸引起的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元死亡、促進神經(jīng)系統(tǒng)的成熟、幫助完善大腦功能等[27]。本實驗結(jié)果表明,L-茶氨酸對SH-SY5Y細胞的無毒性劑量范圍是0~350 μg/mL。van der Pijl等[28]報道人體飲用含100 mg L-茶氨酸的茶,血漿中L-茶氨酸質(zhì)量濃度將在50 min后達到最大值,為4.4 μg/mL,由此推測,人體血漿中L-茶氨酸質(zhì)量濃度為350 μg/mL,需飲用含7.95 g L-茶氨酸的茶。已有報道顯示,茶氨酸的半數(shù)致死量(LD50)>5 g/kg(小鼠,18~20 g)[29]和最大耐受劑量為4 g/kg(大鼠,172~226 g)[30],根據(jù)人與動物間按體表面積折算的等效劑量比值表可知,人體內(nèi)L-茶氨酸半數(shù)致死量和最大耐受劑量分別為37 g和29.7 g,遠遠大于本實驗中最大無毒性劑量所需食用的L-茶氨酸量(7.95 g)。此外,我國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會通過2014年15號公告批準茶葉氨基酸為新食品原料[31];日本已經(jīng)確認L-茶氨酸為安全物質(zhì),在使用中不作限制用量規(guī)定[27,29]。茶多酚是一類存在于茶樹中的多元酚混合物,其主要成分是兒茶素(約占70%~80%)[26];經(jīng)檢測本實驗所用茶多酚的主要成分包括EGCG(47.3%)、EC(1.78%)、ECG(11.75%)、EGC(5.15%)、GCG(3.48%)。Guo Shuhong等[20]在研究中發(fā)現(xiàn),EGCG、ECG、EC均能提高SH-SY5Y細胞存活率,其中ECG濃度為400 μmol/L(177 μg/mL)時,細胞存活率達到170%;本實驗結(jié)果表明,茶多酚對SH-SY5Y細胞的最大無毒性劑量為500 μg/mL,其內(nèi)含EGCG、ECG的質(zhì)量濃度分別為236.5、58.75 μg/mL;EGCG單獨作用于SH-SY5Y細胞時,最大無毒性劑量為45 μg/mL。由此推測,茶多酚對SH-SY5Y細胞的毒性作用弱,是由于EGCG、ECG或其他物質(zhì)的協(xié)同作用減弱了毒性作用。茶色素是從普洱熟茶7572中提取的一種混合物,其主要成分是沒食子酸(43.48%)。Lu Zhongbing等[32]的研究表明,沒食子酸單獨作用于SH-SY5Y細胞的無毒性劑量范圍為0~150 μmol/L(即0~25.5 μg/mL)。本實驗結(jié)果表明,茶色素對SH-SY5Y細胞的最大無毒性劑量為300 μg/mL,其內(nèi)含沒食子酸質(zhì)量濃度為130.44 μg/mL,遠遠大于沒食子酸單獨作用的無毒性劑量范圍;咖啡堿、EGCG、ECG的質(zhì)量濃度分別為14.58、2.94、1.68 μg/mL,均處于無毒性劑量范圍內(nèi),且有增大細胞存活率的趨勢(圖3)。由此推測,茶色素對SH-SY5Y細胞的毒性作用弱是由于沒食子酸、咖啡堿、EGCG和ECG的協(xié)同作用減弱了毒性作用。

    本實驗中,EGCG質(zhì)量濃度為140 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率為(59.93±4.30)%,EGCG表現(xiàn)出了明顯的毒性作用;相同EGCG質(zhì)量濃度下,F(xiàn)A和PEG修飾的納米EGCG(FA約為30 μg/mL)對SH-SY5Y細胞沒有毒性作用。Budni等[33]研究表明,F(xiàn)A單獨作用于SH-SY5Y細胞的無毒性劑量范圍為1~300 μmol/L(即0~132 μg/mL),且1 μmol/L FA作用于SH-SY5Y細胞時,細胞存活率約為110%。張景燕等[34]也曾報道經(jīng)FA處理的SH-SY5Y細胞存活率是對照組的1.45 倍。由此推測,納米EGCG對SH-SY5Y細胞的毒性作用較EGCG弱,是因為FA和EGCG的協(xié)同作用減弱了毒性作用。為了在相同EGCG質(zhì)量濃度范圍內(nèi),比較EGCG與納米EGCG對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用的差異,在后續(xù)實驗中EGCG與納米EGCG的劑量均采用0~140 μg/mL。

    2.3 茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞的保護作用

    采用不同質(zhì)量濃度的茶提取物和納米EGCG處理SH-SY5Y細胞3 h,再經(jīng)6-OHDA 誘導3 h,評價茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用。由圖4可知,經(jīng)茶提取物或納米EGCG預處理的SH-SY5Y細胞存活率顯著高于對照組的SH-SY5Y細胞存活率,表明茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞具有一定的保護作用,可顯著抑制6-OHDA對SH-SY5Y細胞的毒性作用。隨著茶提取物質(zhì)量濃度的增大,SH-SY5Y細胞存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,并未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當?shù)陀诩毎婊盥首畲笾祵馁|(zhì)量濃度時,茶提取物或納米EGCG對SH-SY5Y細胞的保護作用隨著質(zhì)量濃度的增大而增強;高于此質(zhì)量濃度時,保護作用隨著質(zhì)量濃度的增大而減弱。已有的神經(jīng)保護性藥物研究如鉤藤提取物[35]、黃苓素[36]、槲皮素[37]、側(cè)柏乙醇提取物[24]也有相似的趨勢。由圖4可知,茶黃素 質(zhì)量濃度為50 μg/mL和EGCG質(zhì)量濃度>70 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率等于或者小于對照組的SH-SY 5Y細胞存活率, 說明高于 一定質(zhì)量濃度,茶提取物或納米EGCG會加重6-OHDA對SH-SY5Y細胞的毒性作用。王莉莉等[25]在研究中也發(fā)現(xiàn),高濃度EGCG(20~400 μmol/L)加重了6-OHDA對SH-SY5Y細胞的損害作用,導致細胞存活率(對照組15.3%~21.4%)下降。

    圖4 茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導的SH-SYY55YY細胞存活率的影響Fig.4 Effect of different tea extracts on 6-OHDA-induced SH-SY5Y cell viability

    由圖4可知,不同茶提取物和納米EGCG預處理6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞,其細胞存活率最大值不同,分別表現(xiàn)為:L-茶氨酸質(zhì)量濃度為350 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率為(86.38±3.17)%;咖啡堿質(zhì)量濃度為40 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率為(86.78±2.04)%;茶黃素質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率為(99.59±2.24)%;茶色素質(zhì)量濃度為200 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率為(92.92±2.47)%;茶多酚質(zhì)量濃度為100 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率為(94.92±2.76)%;EGCG質(zhì)量濃度為0.9 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率為(95.84±2.50)%;(FA+PEG)-EGCG-NPs-1質(zhì)量濃度為0.9 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率為(103.40±2.16)%;(FA+PEG)-EGCG-NPs-2質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL時,SH-SY5Y細胞存活率為(104.17±4.30)%。由此可知,茶提取物對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用由強到弱為:茶黃素>EGCG>茶多酚>茶色素>咖啡堿>L-茶氨酸;納米EGCG和EGCG對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞的保護作用由強到弱為(FA+PEG)-EGCG-NPs-2≥(FA+PEG)-EGCG-NPs-1>EGCG。Owen等[38]的研究表明,L-茶氨酸和咖啡堿的共同作用有利于改善人的認知能力;Horie等[39]也曾報道,EC和EGCG的協(xié)同作用能夠誘導胃癌細胞株MKN-45細胞的凋亡。由此推測,茶對SH-SY5Y細胞以及神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用是多種茶提取物協(xié)同作用的結(jié)果。

    已研究的神經(jīng)保護性藥物如鉤藤提取物[35]、黃芩素[36]、槲皮素[37]和側(cè)柏乙醇提取物[24]預處理6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞,細胞存活率最大值分別為79%、82%、80%、82%,其所對應的藥物質(zhì)量濃度分別為200、3.4、15.1、10 μg/mL。本實驗中,茶提取物預處理6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞,其細胞存活率最大值可達(86.38±3.17)%~(99.59±2.24)%,表明茶提取物對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞的保護作用較強;且達到細胞存活率最大值對應的茶黃素質(zhì)量濃度(0.2 μg/mL)和EGCG質(zhì)量濃度(0.9 μg/mL)遠遠低于其他茶提取物和神經(jīng)保護藥物的質(zhì)量濃度,說明茶黃素和EGCG具有較強的神經(jīng)保護作用。此外,茶黃素和EGCG是茶葉中常見且量大的功能性成分,可以通過飲茶的方式快速、便捷獲取這些茶葉活性物質(zhì)。

    本實驗中,納米EGCG實驗組SH-SY5Y細胞存活率最大值略高于EGCG實驗組,而且在高質(zhì)量濃度下,納米EGCG實驗組SH-SY5Y細胞存活率下降速率較EGCG實驗組慢,這可能與FA對SH-SY5Y細胞的保護作用有關[33-34],F(xiàn)A與EGCG的協(xié)同作用使納米EGCG較EGCG具有更強的保護作用。本實驗室在研究不同修飾納米EGCG對人乳腺癌MCF-7細胞的影響中發(fā)現(xiàn),F(xiàn)A的靶向性作用增強了納米EGCG的抗增殖能力,F(xiàn)A和PEG的協(xié)同作用促進了納米EGCG的抗腫瘤屬性[18]。由此推測,F(xiàn)A的靶向性作用、FA和PEG的協(xié)同作用也是導致納米EGCG較EGCG具有更強神經(jīng)保護作用的原因。由圖4可知,兩種納米EGCG對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用也有差異。SH-SY5Y細胞存活率達到最大值時,(FA+PEG)-EGCG-NPs-1和(FA+PEG)-EGCG-NPs-2的質(zhì)量濃度分別為0.9 μg/mL和2.5 μg/mL,這可能是兩種納米EGCG的制備方式不同導致的。(FA+PEG)-EGCG-NPs-1的制備是采用離子交聯(lián)法形成EGCG-NPs,將FA和PEG枝接到EGCG-NPs上;(FA+PEG)-EGCG-NPs-2的制備是將FA和PEG枝接到殼聚糖上形成FA-PEG-CS,再采用離子交聯(lián)法使FA-PEG-CS與TPP、EGCG形成(FA+PEG)-EGCG-NPs-2[18]。

    3 結(jié) 論

    SH-SY5Y細胞是一種分化程度較低的腫瘤細胞,與正常神經(jīng)細胞具有相似的細胞形態(tài)和生理生化特征,現(xiàn)已被廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病機制和藥物篩選研究[40]。6-OHDA是神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的羥基化衍生物,作用于多巴胺能神經(jīng)元導致神經(jīng)細胞變性、死亡,黑質(zhì)-紋狀體多巴胺系統(tǒng)功能減退,產(chǎn)生類似帕金森病的癥狀[40]。6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞是較成熟的PD體外細胞模型[16-17]。本實驗中采用100 μmol/L 6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞制備PD體外細胞模型,細胞存活率為(59.75±1.32)%,細胞形態(tài)基本正常,呈扁平多邊形或梭形。

    研究表明,低質(zhì)量濃度茶提取物對SH-SY5Y細胞沒有毒性作用; 高質(zhì)量濃度茶提取物對SH-SY5Y細胞表現(xiàn)出毒性作用。在茶提取物對SH-SY5Y細胞無毒性劑量范圍內(nèi),研究茶提取物對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用,發(fā)現(xiàn)茶黃素對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用最強,其次為EGCG、茶多酚、茶色素、咖啡堿、L-茶氨酸。低質(zhì)量濃度EGCG和茶黃素預處理6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞,細胞存活率≥95%,其保護作用明顯強于其他茶提取物及已研究的神經(jīng)保護性藥物[24,35-36],表明EGCG和茶黃素具有較好的治療PD潛力。EGCG是綠茶的主要成分,約占綠茶干質(zhì)量的9%~13%;茶黃素是紅茶的主要成分,約占紅茶干質(zhì)量的1%~3%[26],由此可推斷常飲綠茶和紅茶對神經(jīng)保護有一定的功效。茶作為三大無醇飲料之一,在中國產(chǎn)量大、價格較低,且是一種方便快捷、易獲得的飲品,這為以茶為原材料的神經(jīng)保護功能食品的開發(fā)提供了便利性。

    本實驗中經(jīng)FA和PEG修飾的納米EGCG較EGCG具有較低的細胞毒性和更好的細胞保護作用。已有的研究表明,納米EGCG較EGCG具有生物活性高、生物利用率高和細胞內(nèi)靶向性強等優(yōu)點[15]。納米EGCG為高效低毒副作用的神經(jīng)保護性藥物開發(fā)提供了新途徑,但將其應用于動物實驗或臨床實驗的效果還需要進一步探究。茶黃素是一類具有苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)的化合物的總稱[26],但各茶黃素單體對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞的保護作用和協(xié)同作用尚待研究。不同茶提取物對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞具有不同程度的保護作用,且不同的茶類中所富含的這些功能成分(茶提取物)含量不同,因此在后續(xù)實驗中還將研究不同的茶類對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞保護作用,為茶在神經(jīng)保護作用方面的進一步開發(fā)利用提供基礎數(shù)據(jù)。

    [1] SHEARD J M, ASH S, SILBURN P A, et al. Prevalence of malnutrition in Parkinson’s disease: a systematic review[J]. Nutrition Reviews, 2011, 69(9): 520-532. DOI:10.1111/j.1753-4887.2011.00413.x.

    [2] 張麗娟, 邵海濤, 王躍秀, 等. 帕金森病研究進展[J]. 生命科學, 2014, 26(6): 560-570. DOI:10.13376/j.cbls/2014081.

    [3] 畢涌, 張旭. 帕金森病的治療進展[J]. 臨床內(nèi)科雜志, 2011, 28(12): 807-810. DOI:10.3969/j.issn.1001 9057.2011.12.004.

    [4] 陳生弟, 王剛, 劉軍, 等. 帕金森病發(fā)病機制與診治的基礎與臨床研究進展[J]. 上海交通大學學報(醫(yī)學版), 2012, 32(9): 1221-1226. DOI:10.3969/j.issn.1674-8115.2012.09.019.

    [5] Food and Agriculture Organization (2014). Firm tea prices set to continue[EB/OL]. (2014-10) [2015-04-05]. http://www.fao.org/news/ story/en/item/124221/icode/.

    [6] 管曦, 楊江帆. 基于二階段的中國茶葉消費行為分析[J]. 中國茶葉, 2015(2): 9-10.

    [7] 何小維, 王雪霞, 許文玲. 淺談茶的保健功能及茶保健品的發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工(學刊), 2006 (4): 62-64. DOI:10.3969/j.issn.1671-9646-B.2006.04.021.

    [8] 劉丹, 蔣知新, 張清華, 等. 帕金森病與飲茶的病例對照研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志, 2004, 3(3): 181-184. DOI:10.3760/cma. j.issn.1671-8925.2004.03.007.

    [9] 李大祥, 鮮殊, 楊衛(wèi), 等. 茶葉的神經(jīng)保護作用研究進展[J]. 茶葉科學, 2011, 31(2): 79-86.

    [10] 李巍巍, 李俊發(fā), 郭安臣, 等. 植物多酚神經(jīng)保護作用的研究進展[J]. 中國卒中雜志, 10(2): 141-146. DOI:10.3969/ j.issn.1673-5765.2015.02.008.

    [11] ANANDHAN A, TAMILSELVAM K, RADHIGA T, et al. Theaflavin, a black tea polyphenol, protects nigral dopaminergic neurons against chronic MPTP/probenecid induced Parkinson’s disease[J]. Brain Research, 2012, 1433: 104-113. DOI:10.1016/j.brainres.2011.11.021.

    [12] KAKUDA T. Neuroprotective effects of the green tea components theanine and catechins[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2002, 25(12): 1513-1518. DOI:10.1248/bpb.25.1513.

    [13] SIDDIQUI I A, ADHAMI V M, BHARALI D J, et al. Introducing nanochemoprevention as a novel approach for cancer control: proof of principle with green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate[J]. Cancer Research, 2009, 69(5): 1712-1716. DOI:10.1158/0008-5472. CAN-08-3978.

    [14] HENNING S M, NIU Y, LEE N H, et al. Bioavailability and antioxidant activity of tea flavanols after consumption of green tea, black tea, or a green tea extract supplement[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2004, 80(6): 1558-1564.

    [15] 溫旭燁. 茶葉提取物及納米 EGCG對人乳腺癌MCF-7細胞生長增殖的影響[D]. 重慶: 西南大學, 2014: 5-12.

    [16] LOPES F M, SCHR?DER R, da FROTA JúNIOR M L C, et al. Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies[J]. Brain Research, 2010, 1337: 85-94. DOI:10.1016/j.brainres.2010.03.102.

    [17] 馮波, 王蓉, 盛樹力. 神經(jīng)退行性疾病研究中擬神經(jīng)細胞模型: 人神經(jīng)母細胞瘤株SH-SY5Y的來源特性及應用[J]. 中國臨床康復, 2006, 10(6): 121-123. DOI:10.3321/j.issn:1673-8225.2006.06.054.

    [18] 蔣潔琳. 納米EGCG制備及其對MCF-7腫瘤細胞的抑制功效評價[D].重慶: 西南大學, 2013: 2-19.

    [19] 吳波拉, 虞希沖, 杜冠華. L-茶氨酸減輕疊氮鈉誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞線粒體損傷[J]. 基礎醫(yī)學與臨床, 2013, 33(11): 1465-1469.

    [20] GUO S, BEZARD E, ZHAO B. Protective effect of green tea polyphenols on the SH-SY5Y cells against 6-OHDA induced apoptosis through ROS-NO pathway[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2005, 39(5): 682-695. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2005.04.022.

    [21] TIAN L L, ZHOU Z, ZHANG Q, et al. Protective effect of (±) isoborneol against 6-OHDA-induced apoptosis in SH-SY5Y cells[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2007, 20(6): 1019-1032. DOI:10.1159/000110682.

    [22] FELICE D L, SUN J, LIU R H. A modified methylene blue assay for accurate cell counting[J]. Journal of Functional Foods, 2009, 1(1): 109-118. DOI:10.1016/j.jff.2008.09.014.

    [23] TIONG C X, LU M, BIAN J S. Protective effect of hydrogen sulphide against 6-OHDA-induced cell injury in SH-SY5Y cells involves PKC/ PI3K/Akt pathway[J]. British Journal of Pharmacology, 2010, 161(2): 467-480. DOI:10.1111/j.1476-5381.2010.00887.x.

    [24] JU M S, LEE P, KIM H G, et al. Protective effects of standardized Thuja orientalis leaves against 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity in SH-SY5Y cells[J]. Toxicology in Vitro, 2010, 24(3): 759-765. DOI:10.1016/j.tiv.2009.12.026.

    [25] 王莉莉, 徐勝利, 陳彪. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對6-OHDA導致的多巴胺能神經(jīng)細胞損傷的保護作用[J]. 中國行為醫(yī)學科學, 2007, 16(4): 311-314. DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-6554.2007.04.008.

    [26] 宛曉春, 茶葉生物化學[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006: 26-53.

    [27] 帥玉英, 張濤, 江波, 等. 茶氨酸的研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 34(11):117-123.

    [28] van der PIJL P C, CHEN L, MULDER T P J. Human disposition of L-theanine in tea or aqueous solution[J]. Journal of Functional Foods, 2010, 2(4): 239-244. DOI:10.1016/j.jff.2010.08.001.

    [29] JUNEJA L R, CHU D C, OKUBO T, et al. L-theanine: a unique amino acid of green tea and its relaxation effect in humans[J]. Trends in Food Science & Technology, 1999, 10(6): 199-204. DOI:10.1016/S0924-2244(99)00044-8.

    [30] BORZELLECA J F, PETERS D, HALL W. A 13-week dietary toxicity and toxicokinetic study with L-theanine in rats[J]. Food and Chemical Toxicology, 2006, 44(7): 1158-1166. DOI:10.1016/j.fct.2006.03.014.

    [31] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 關于批準茶葉茶氨酸為新食品原料等的公告(2014年 第15號)[EB/OL]. (2014-07-18) [2015-04-20]. http://www.moh.gov.cn/sps/s7890/201407/d388b72707 fa4e978bea6a222b920cbf.shtml.

    [32] LU Z B, NIE G, BELTON P S, et al. Structure-activity relationship analysis of antioxidant ability and neuroprotective effect of gallic acid derivatives[J]. Neurochemistry International, 2006, 48(4): 263-274. DOI:10.1016/j.neuint.2005.10.010.

    [33] BUDNI J, ROMERO A, MOLZ S, et al. Neurotoxicity induced by dexamethasone in the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line can be prevented by folic acid[J]. Neuroscience, 2011, 190: 346-353. DOI:10.1016/j.neuroscience.2011.05.053.

    [34] 張景燕, 陳娟, 王蓉, 等. 葉酸和維生素B12對人神經(jīng)母細胞瘤株SH-SY5Y細胞的保護作用[J]. 首都醫(yī)科大學學報, 2013, 33(6): 776-778. DOI:10.3969/j.issn.1006-7795.2012.06.014.

    [35] SHI Z H, LU Z B, ZHAO Y S, et al. Neuroprotective effects of aqueous extracts of uncaria tomentosa: insights from 6-ohda induced cell damage and transgenic Caenorhabditis elegans model[J]. Neurochemistry International, 2013, 62(7): 940-947. DOI:10.1016/ j.neuint.2013.03.001.

    [36] LEE H J, NOH Y H, KIM Y S, et al. Baicalein attenuates 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity in SH-SY5Y cells[J]. European Journal of Cell Biology, 2005, 84(11):897-905. DOI:10.1016/j.ejcb.2005.07.003.

    [37] OSSOLA B, K??RI?INEN T M, RAASMAJA A, et al. Timedependent protective and harmful effects of quercetin on 6-OHDA-induced toxicity in neuronal SH-SY5Y cells[J]. Toxicology, 2008, 250(1): 1-8. DOI:10.1016/j.tox.2008.04.001.

    [38] OWEN G N, PARNELL H, de BRUIN E A, et al. The combined effects of L-theanine and caffeine on cognitive performance and mood[J]. Nutritional Neuroscience, 2008, 11(4): 193-198. DOI:10.1179/147683008X301513.

    [39] HORIE N, HIRABAYASHI N, TAKAHASHI Y, et al. Synergistic effect of green tea catechins on cell growth and apoptosis induction in gastric carcinoma cells[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28(4): 574-579. DOI:10.1248/bpb.28.574.

    [40] 王丹萍. 6-羥基多巴 胺誘導的SH-SY5Y細胞帕金森病模型差異蛋白質(zhì)組學研究[D]. 長春: 吉林大學, 2010: 3-9.

    Protective Effects of Tea Extracts and Nano-EGCG against 6-OHDA-Induced Cell Injury in SH-SY5Y Cells

    YAN Jingna1, LUO Liyong1,2, HU Yaqiong1,3, ZENG Liang1,2,*
    (1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Tea Research Institute, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. Huangyan Branch of China Minsheng Bank, Taizhou 318020, China)

    Human neuroblastoma cell line SH-SY5Y challenged with 6-hydroxydopamine (6-OHDA) was used as an in vitro model of Parkinson’s disease (PD), and the cytotoxicity of tea extracts including L-theanine, caffeine, tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), theaflavins, tea pigment, and two kinds of nano-EGCG on SH-SY5Y cells were investigated, and their protective effects on 6-OHDA-induced SH-SY5Y cells were compared to evaluate their potentials for the treatment of PD. The results showed that the cytotoxicity was in the following order: tea polyphenol < L-theanine <tea pigment < caffeine < theaflavins < EGCG; the protective effects were in the following order: theaflavins > EGCG > tea polyphenol > tea pigment > caffeine > L-theanine. Theaflavins (0.2 μg/mL) and EGCG (0.9 μg/mL) were more effective than other tea extracts in preventing SH-SY5Y cells from 6-OHDA-induced damage, restoring cell viability to (99.59 ± 2.24)% and (95.84 ± 2.50)%, respectively. Compared to EGCG, nano-EGCG had weaker cytotoxicity and stronger protective effect. Based on our results, tea, as a natural daily drink, has better potential for the treatment of PD.

    Parkinson’s disease (PD); tea extracts; 6-hydroxydopamine (6-OHDA); SH-SY5Y cell; nano-epigallocatechin-3-gallate

    10.7506/spkx1002-6630-201601029

    TS218

    A

    1002-6630(2016)01-0163-08

    閆敬娜, 羅理勇, 胡雅瓊, 等. 茶提取物和納米表沒食子兒茶素沒食子酸酯對6-羥基多巴胺誘導的SH-SY5Y細胞保護作用[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 163-170. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601029. http:// www.spkx.net.cn

    YAN Jingna, LUO Liyong, HU Yaqiong, et al. Protective effects of tea extracts and nano-EGCG against 6-OHDA-induced cell injury in SH-SY5Y cells[J]. Food Science, 2016, 37(1): 163-170. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx10 02-6630-201601029. http://www.spkx.net.cn

    2015-05-28

    國家自然科學基金青年科學基金項目(31100500);重慶市科委自然科學基金計劃項目(CSTC,2013jcyjA80021);

    中央高?;究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(XDJK2013B036)

    閆敬娜(1988—),女,碩士研究生,主要從事茶資源綜合利用研究。E-mail:308703119@qq.com

    *通信作者:曾亮(1980—),女,副教授,博士,主要從事茶資源綜合利用研究。E-mail:zengliangbaby@126.com

    猜你喜歡
    氨酸黃素存活率
    蒜氨酸抗菌機制研究
    園林綠化施工中如何提高植樹存活率
    損耗率高達30%,保命就是保收益!這條70萬噸的魚要如何破存活率困局?
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預計年產(chǎn)3.5萬斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    穿越時光的黃素石樓
    海峽姐妹(2019年8期)2019-09-03 01:01:02
    當藥黃素抗抑郁作用研究
    當藥黃素對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用
    漆黃素固體分散體的制備
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:32
    高羊毛氨酸硒提高豬肌肉中硒沉積
    廣東飼料(2016年7期)2016-12-01 03:43:36
    蒜氨酸的分離純化研究進展
    午夜精品在线福利| 亚洲美女视频黄频| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产成+人综合+亚洲专区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久久久久午夜电影| 高清毛片免费观看视频网站| xxx96com| 久久久久久人人人人人| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 高清在线国产一区| 精品不卡国产一区二区三区| 精品乱码久久久久久99久播| 麻豆av在线久日| 国产单亲对白刺激| 欧美高清成人免费视频www| 久久国产精品影院| 国产亚洲av高清不卡| 精品欧美国产一区二区三| 天天添夜夜摸| 90打野战视频偷拍视频| 中亚洲国语对白在线视频| 久久久国产成人免费| x7x7x7水蜜桃| 成人18禁在线播放| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲在线自拍视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 一边摸一边做爽爽视频免费| www.自偷自拍.com| 亚洲色图av天堂| 天堂影院成人在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品野战在线观看| 黑人操中国人逼视频| 曰老女人黄片| 全区人妻精品视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久中文看片网| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品九九99| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品 国内视频| 91国产中文字幕| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| xxx96com| 韩国av一区二区三区四区| 波多野结衣高清无吗| videosex国产| 很黄的视频免费| 久久精品国产综合久久久| 日韩精品青青久久久久久| 久久久久久大精品| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 精华霜和精华液先用哪个| 男女之事视频高清在线观看| www.精华液| 老司机在亚洲福利影院| 久久天堂一区二区三区四区| 久久香蕉激情| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲av电影在线进入| 久久这里只有精品19| 亚洲国产欧美网| 午夜福利在线在线| 岛国在线免费视频观看| 精品第一国产精品| www.自偷自拍.com| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 在线观看www视频免费| 免费电影在线观看免费观看| 午夜福利视频1000在线观看| 一级毛片高清免费大全| www日本黄色视频网| 国产成人精品无人区| 国产激情久久老熟女| 亚洲av五月六月丁香网| 国产欧美日韩一区二区三| 麻豆av在线久日| xxx96com| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久精品91无色码中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲av五月六月丁香网| 看片在线看免费视频| 国产亚洲精品av在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 此物有八面人人有两片| 一个人免费在线观看的高清视频| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲成av人片在线播放无| av天堂在线播放| 免费观看人在逋| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩精品中文字幕看吧| 99久久精品热视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美性长视频在线观看| 久久久久久久久久黄片| 夜夜夜夜夜久久久久| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精华一区二区三区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 一区二区三区高清视频在线| a级毛片a级免费在线| 首页视频小说图片口味搜索| 国产亚洲av高清不卡| 天堂√8在线中文| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 婷婷亚洲欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| cao死你这个sao货| 日韩有码中文字幕| 九色国产91popny在线| 黄色毛片三级朝国网站| 国产探花在线观看一区二区| 婷婷亚洲欧美| 亚洲美女黄片视频| 国产av不卡久久| 麻豆成人午夜福利视频| 久久人妻av系列| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲av五月六月丁香网| 白带黄色成豆腐渣| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 黄色 视频免费看| 男女床上黄色一级片免费看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美中文日本在线观看视频| 成人一区二区视频在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 999久久久国产精品视频| 免费无遮挡裸体视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产高清激情床上av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 最近最新免费中文字幕在线| 99热6这里只有精品| 最新美女视频免费是黄的| 久久 成人 亚洲| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久久久久人人人人人| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 少妇粗大呻吟视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲九九香蕉| 美女 人体艺术 gogo| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 九色成人免费人妻av| 一级片免费观看大全| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲 国产 在线| 亚洲七黄色美女视频| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲精品一区av在线观看| 69av精品久久久久久| 久久国产精品人妻蜜桃| 婷婷精品国产亚洲av在线| 岛国在线免费视频观看| 麻豆一二三区av精品| av国产免费在线观看| 禁无遮挡网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲av美国av| 久久草成人影院| 久久香蕉精品热| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美国产日韩亚洲一区| 91字幕亚洲| av视频在线观看入口| 欧美大码av| 午夜免费成人在线视频| 日韩高清综合在线| 不卡av一区二区三区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 黄色丝袜av网址大全| 又粗又爽又猛毛片免费看| 69av精品久久久久久| 中文字幕久久专区| 两个人免费观看高清视频| bbb黄色大片| 曰老女人黄片| 丝袜美腿诱惑在线| 久久人妻av系列| 一级毛片女人18水好多| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 91国产中文字幕| 亚洲午夜理论影院| 1024香蕉在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费电影在线观看免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美三级亚洲精品| 成人永久免费在线观看视频| www.自偷自拍.com| 深夜精品福利| 国产区一区二久久| 国产一区二区三区视频了| 国产黄色小视频在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品久久视频播放| netflix在线观看网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 在线看三级毛片| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久久久久午夜电影| 91老司机精品| 日本 av在线| 日本一区二区免费在线视频| 成年版毛片免费区| 国产伦人伦偷精品视频| 日日夜夜操网爽| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 90打野战视频偷拍视频| svipshipincom国产片| 午夜福利在线在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 老司机在亚洲福利影院| 黄频高清免费视频| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲男人天堂网一区| 久久草成人影院| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产精品av久久久久免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 人人妻人人澡欧美一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美在线黄色| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲成人久久性| 色精品久久人妻99蜜桃| 757午夜福利合集在线观看| 黄色视频不卡| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲美女视频黄频| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| bbb黄色大片| 亚洲熟女毛片儿| 性色av乱码一区二区三区2| 怎么达到女性高潮| 亚洲精品色激情综合| 成熟少妇高潮喷水视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲全国av大片| 日韩高清综合在线| av福利片在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲18禁久久av| 99热这里只有精品一区 | 久久亚洲精品不卡| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 91字幕亚洲| 1024视频免费在线观看| 免费观看精品视频网站| 一区二区三区高清视频在线| 成人三级黄色视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产野战对白在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av成人精品一区久久| 国产爱豆传媒在线观看 | 国内精品一区二区在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜影院日韩av| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久久精品国产欧美久久久| 悠悠久久av| 免费观看人在逋| 精品久久久久久久久久久久久| 黄色 视频免费看| 舔av片在线| 精品久久久久久成人av| 亚洲电影在线观看av| 视频区欧美日本亚洲| 首页视频小说图片口味搜索| 小说图片视频综合网站| 色综合站精品国产| 99热这里只有精品一区 | 久久午夜综合久久蜜桃| 18禁观看日本| 母亲3免费完整高清在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美一区二区精品小视频在线| 99国产综合亚洲精品| 国产人伦9x9x在线观看| 精品电影一区二区在线| 欧美日韩乱码在线| 国产人伦9x9x在线观看| 97碰自拍视频| 成人午夜高清在线视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜免费成人在线视频| 最近最新免费中文字幕在线| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品久久视频播放| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲片人在线观看| 一本一本综合久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产91精品成人一区二区三区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 成人国产综合亚洲| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产区一区二久久| 小说图片视频综合网站| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产精品永久免费网站| 成人国产一区最新在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 怎么达到女性高潮| 搡老岳熟女国产| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 一本大道久久a久久精品| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 婷婷精品国产亚洲av| 久久久久久国产a免费观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久精品91蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 观看免费一级毛片| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品久久久av美女十八| 高清毛片免费观看视频网站| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美激情久久久久久爽电影| 床上黄色一级片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲专区中文字幕在线| 日本免费a在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 一本一本综合久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲男人天堂网一区| 免费看日本二区| 国产午夜福利久久久久久| 黄频高清免费视频| 亚洲 欧美一区二区三区| av在线播放免费不卡| 麻豆国产av国片精品| 国内精品一区二区在线观看| 91成年电影在线观看| 成人18禁在线播放| 国产三级在线视频| 后天国语完整版免费观看| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久久久国产a免费观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日本五十路高清| 久久午夜亚洲精品久久| 一本大道久久a久久精品| 变态另类丝袜制服| 亚洲avbb在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费人成视频x8x8入口观看| 正在播放国产对白刺激| 嫩草影视91久久| 国产精品久久视频播放| 老司机深夜福利视频在线观看| 黄色视频不卡| svipshipincom国产片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 香蕉国产在线看| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲人成77777在线视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久午夜亚洲精品久久| 国产黄片美女视频| 成在线人永久免费视频| 丁香六月欧美| 国产主播在线观看一区二区| 在线看三级毛片| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲五月天丁香| 一本综合久久免费| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲avbb在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在线观看免费午夜福利视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久精品国产综合久久久| 变态另类丝袜制服| 九色国产91popny在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成人18禁在线播放| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一二三四社区在线视频社区8| 色播亚洲综合网| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 美女午夜性视频免费| 日本一二三区视频观看| 怎么达到女性高潮| 村上凉子中文字幕在线| 久久亚洲真实| 精品一区二区三区av网在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 色综合站精品国产| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 免费电影在线观看免费观看| 国产视频内射| av免费在线观看网站| 久久久久久久午夜电影| 国产精品永久免费网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 久99久视频精品免费| 国产成人系列免费观看| cao死你这个sao货| 国产午夜精品论理片| 久久精品国产清高在天天线| 在线看三级毛片| 欧美一区二区精品小视频在线| 午夜免费激情av| 国产精品亚洲一级av第二区| av超薄肉色丝袜交足视频| 成人国产综合亚洲| 免费看美女性在线毛片视频| 一级毛片高清免费大全| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 热99re8久久精品国产| 免费在线观看影片大全网站| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 色综合站精品国产| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久久久久久久黄片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国内精品久久久久久久电影| 国产午夜福利久久久久久| a级毛片在线看网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产免费男女视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 黑人操中国人逼视频| 丰满的人妻完整版| 天天添夜夜摸| 在线播放国产精品三级| 美女免费视频网站| 国产97色在线日韩免费| 神马国产精品三级电影在线观看 | 精品久久久久久久久久久久久| av天堂在线播放| 日韩高清综合在线| 在线a可以看的网站| 夜夜爽天天搞| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品九九99| 国产激情欧美一区二区| 日韩欧美三级三区| 制服人妻中文乱码| 亚洲片人在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜老司机福利片| 亚洲全国av大片| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 制服诱惑二区| 日本黄大片高清| 亚洲成av人片免费观看| 久久精品91蜜桃| 成人手机av| 不卡一级毛片| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久香蕉精品热| 桃红色精品国产亚洲av| 久久香蕉精品热| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美日韩黄片免| 最近在线观看免费完整版| 身体一侧抽搐| 欧美成狂野欧美在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 高清毛片免费观看视频网站| 又紧又爽又黄一区二区| 久久精品91无色码中文字幕| 在线观看免费视频日本深夜| 日韩大码丰满熟妇| 久久久久久免费高清国产稀缺| 91国产中文字幕| 国产一区二区三区视频了| 操出白浆在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲专区中文字幕在线| 美女 人体艺术 gogo| 国产av在哪里看| 免费看日本二区| 草草在线视频免费看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品一区二区三区四区久久| 脱女人内裤的视频| 亚洲中文av在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 一级毛片高清免费大全| 天天添夜夜摸| 日本熟妇午夜| 91av网站免费观看| 国内精品一区二区在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜激情av网站| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 一本一本综合久久| 男人舔女人的私密视频| 成年免费大片在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 老司机福利观看| 久久99热这里只有精品18| 欧美大码av| 国产精品av视频在线免费观看| 久久热在线av| 久久精品综合一区二区三区| 国产熟女xx| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久精品91蜜桃| 一本久久中文字幕| ponron亚洲| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久久精品大字幕| 国产精品日韩av在线免费观看| 一本综合久久免费| 国产高清有码在线观看视频 | 一进一出好大好爽视频| 91老司机精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美性长视频在线观看| cao死你这个sao货| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产三级在线视频| 欧美中文日本在线观看视频| 好男人电影高清在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 90打野战视频偷拍视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久这里只有精品中国| 成年女人毛片免费观看观看9| 97碰自拍视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久国产精品影院| 成在线人永久免费视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产成年人精品一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲欧美日韩无卡精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 人妻夜夜爽99麻豆av| 嫁个100分男人电影在线观看| 精品福利观看| 午夜亚洲福利在线播放| 一级毛片高清免费大全| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一本精品99久久精品77| 五月伊人婷婷丁香| 久久久国产成人精品二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 69av精品久久久久久|