• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻3011抗氧化系統(tǒng)和二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響

    2016-11-11 08:24:30王雪青
    食品科學(xué) 2016年1期
    關(guān)鍵詞:活力低溫抗氧化

    王 婷,趙 培,王雪青*

    低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻3011抗氧化系統(tǒng)和二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響

    王 婷,趙 培,王雪青*

    (天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

    以球等鞭金藻(Isochrysis galbana)3011為對(duì)象,通過(guò)研究降低培養(yǎng)溫度后其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性以及還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)含量的變化,以闡明低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和DHA含量的影響。用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光染色法測(cè)定低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響;并采用氣相色譜法檢測(cè)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA含量。結(jié)果表明:在21、18、15 ℃低溫環(huán)境處理下,球等鞭金藻細(xì)胞SOD、CAT和POD活性均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);溫度越低,峰值出現(xiàn)越早,且峰值越大,峰后酶活性下降越快;GSH含量的變化趨勢(shì)與上述酶活性的變化相似,MDA含量則持續(xù)增加;ROS水平隨著溫度的降低而呈現(xiàn)出較為復(fù)雜的變化,15 ℃和18 ℃誘導(dǎo)16 h出現(xiàn)ROS水平爆發(fā),20 h時(shí)達(dá)到峰值,分別為(14.11±0.11)%和(14.74±0.58)%(P<0.05);經(jīng)18 ℃低溫誘導(dǎo)24 h后,球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA含量為0.105 mg/g,比對(duì)照組高0.06 mg/g。因此,低溫環(huán)境可以作為提高代謝物產(chǎn)量的誘導(dǎo)子,使球等鞭金藻細(xì)胞產(chǎn)生主動(dòng)防御反應(yīng),引起清除活性氧相關(guān)的酶活性的升高,同時(shí)也提高了DHA產(chǎn)量。

    球等鞭金藻3011;抗氧化;低溫;活性氧;二十二碳六烯酸

    微藻是生活在海洋或者陸地中的微小生物,是最主要的初級(jí)生產(chǎn)者,對(duì)于穩(wěn)定海洋生態(tài)系統(tǒng)有著非常重要的作用。一些環(huán)境因子發(fā)生變化,如溫度除了能改變微藻的生長(zhǎng)和發(fā)育速率、調(diào)控某些酶的活性之外,還會(huì)影響細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)組成、營(yíng)養(yǎng)素的利用率等,以達(dá)到主動(dòng)適應(yīng)環(huán)境改變的目的[1]。有研究報(bào)道,低溫可以改變機(jī)體內(nèi)與抗氧化防御系統(tǒng)密切相關(guān)的酶的活性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基含量增加[2-4]。在植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)過(guò)程中,如青蒿、長(zhǎng)春細(xì)胞,一定量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)可充當(dāng)環(huán)境刺激信號(hào)的二級(jí)信使,通過(guò)細(xì)胞信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo),實(shí)現(xiàn)環(huán)境因子對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物含量和組成的調(diào)控[5-8]。

    球等鞭金藻屬于金藻門,普林藻綱,等鞭藻目,等鞭藻科。由于其個(gè)體小、無(wú)細(xì)胞壁、易消化、富含多糖及多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)等代謝產(chǎn)物,是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的開口餌料,同時(shí)也是生產(chǎn)DHA的潛力藻種。有研究顯示低溫可以促進(jìn)多不飽和脂肪酸的形成[9],因此通過(guò)低溫環(huán)境刺激來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)DHA含量是其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵步驟。然而關(guān)于球等鞭金藻受到低溫環(huán)境的刺激時(shí),其與ROS密切相關(guān)的酶的變化以及一些次生代謝產(chǎn)物的積累尚未見報(bào)道。

    本實(shí)驗(yàn)以適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境作為刺激因子,研究其對(duì)球等鞭金藻的抗氧化系統(tǒng)和DHA含量的影響,為提高球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA含量和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)DHA提供可行的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    球等鞭金藻(Isochrysis galbana)3011由中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)系實(shí)驗(yàn)室提供。

    超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(dichlorodihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA)、冰醋酸、磷酸鹽緩沖液、DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%) 美國(guó)Sigma公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司;TI-U倒置式熒光顯微鏡 日本尼康公司。

    1.3 方法

    1.3.1 球等鞭金藻的培養(yǎng)

    采用f/2培養(yǎng)基對(duì)球等鞭金藻進(jìn)行培養(yǎng),按體積分?jǐn)?shù)10%接種,培養(yǎng)溫度24~26 ℃,明/暗周期為14 h/10 h,光照度為4 500 lx,于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

    1.3.2 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

    取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期的球等鞭金藻,經(jīng)分瓶后分別在24、21、18、15 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h(每組3 個(gè)平行,其中24 ℃作為對(duì)照組),每6 h定時(shí)測(cè)定球等鞭金藻細(xì)胞的SOD、POD、CAT活力以及GSH、MDA含量。

    1.3.2.1 粗酶液的提取及蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

    取培養(yǎng)11 d至對(duì)數(shù)末期的球等鞭金藻液40 mL,8 000 r/min離心10 min,棄上清液,收獲球等鞭金藻細(xì)胞。用4 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)重懸細(xì)胞,冰浴條件下超聲破碎30 次(功率400 W、時(shí)間3 s、間隔3 s),4 ℃靜置1 h,12 000 r/min離心20 min,上清液即為酶粗提液。取粗酶液1 mL并加入考馬斯亮藍(lán)溶液3 mL,在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo),蛋白質(zhì)含量(mg/mL)為縱坐標(biāo),根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛血清白蛋白所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.105 6x-0.034 4(R2=0.995),計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。

    1.3.2.2 SOD活力測(cè)定

    黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶催化下產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-?),當(dāng)反應(yīng)體系中有SOD時(shí),O2-?可被氧化生成H2O2,其可氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色,通過(guò)測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出SOD活力,設(shè)3 個(gè)平行組,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下,抑制1 mL反應(yīng)液中O2-?氧化后將氧化羥胺轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁},并與顯色劑反應(yīng)后形成紫紅色絡(luò)合物所需要的酶量。按照公式(1)計(jì)算SOD活力。

    式中:0.5為說(shuō)明書所提供的參數(shù);對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣。

    1.3.2.3 POD活力測(cè)定

    POD催化過(guò)氧化氫和愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生醌類化合物,此化合物進(jìn)一步縮合成有顏色的化合物,通過(guò)測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出POD活力,設(shè)3 個(gè)平行組,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下,在30 min內(nèi)以1 mL反應(yīng)液中愈創(chuàng)木酚為底物催化過(guò)氧化氫形成醌類化合物進(jìn)一步縮合成有色化合物所需要的酶量。按照公式(2)計(jì)算POD活力。

    式中:12、1 000為說(shuō)明書提供參數(shù);1為比色光徑系數(shù);30為反應(yīng)時(shí)間/min;對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣。

    1.3.2.4 CAT活力測(cè)定

    CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過(guò)加入鉬酸銨而迅速終止,剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種黃色的絡(luò)合物,通過(guò)測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出CAT活力,設(shè)3 個(gè)平行組,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下,在60 min內(nèi)分解1 mL反應(yīng)液中H2O2所需要的酶量。按照公式(3)計(jì)算CAT活力。

    式中:271為說(shuō)明書提供參數(shù);60為反應(yīng)時(shí)間/min;對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣。

    1.3.2.5 GSH含量測(cè)定

    二硫代二硝基甲苯與巰基化合物反應(yīng)產(chǎn)生黃色絡(luò)合物,通過(guò)測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出GSH含量,設(shè)3 個(gè)平行組,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。按照公式(4)計(jì)算GSH含量。

    式中:307為GSH的摩爾質(zhì)量/(g/mol);對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣;空白組為以試劑盒中的試劑1替代待測(cè)樣。

    1.3.2.6 MDA含量測(cè)定

    MDA與硫代巴比妥酸縮合形成紅色產(chǎn)物,通過(guò)測(cè)定532 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出MDA含量,設(shè)3 個(gè)平行組,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。按照公式(5)計(jì)算MDA含量。

    式中:對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣;10 nmol/mL為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度;標(biāo)準(zhǔn)組為以10 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品替代待測(cè)樣;空白組為以無(wú)水乙醇替代待測(cè)樣。

    1.3.3 ROS水平測(cè)定

    采用流式細(xì)胞儀將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)末期的球等鞭金藻細(xì)胞在24、21、18、15 ℃條件下分別誘導(dǎo)不同的時(shí)間,每4 h以流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平,以倒置熒光顯微鏡鏡檢染色后細(xì)胞狀態(tài)。并設(shè)3 個(gè)平行組,具體操作步驟為:樣品以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗滌去雜質(zhì),10 000 r/min離心15 min,重復(fù)3 次,稀釋至106個(gè)/mL以下,各取1 mL在24 ℃條件下培養(yǎng)的細(xì)胞樣品作為對(duì)照,以0.5 μmol/L的終濃度進(jìn)行Fluo-3-AM(鈣離子熒光探針)染色,避光孵育15 min后上樣。流式細(xì)胞儀用氳離子激光激發(fā)光源,功率15 mW,發(fā)射光波長(zhǎng)488 nm,F(xiàn)luo-3-AM的綠色熒光用525 nm/30 nm帶通濾片收集,應(yīng)用Cellquest軟件收集、儲(chǔ)存、處理數(shù)據(jù)。將各組細(xì)胞樣品以相同濃度染料染色后涂于玻片上,立即置于倒置熒光顯微鏡下觀察,細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成的DCFH被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成的熒光性的DCF,可被倒置熒光顯微鏡檢測(cè)到,并照相記錄[10-12]。

    1.3.4 DHA含量測(cè)定

    采用氣相色譜法(gas chromatography,GC)測(cè)定DHA含量,具體操作步驟如下。

    1.3.4.1 多不飽和脂肪酸的提取

    以76 mL乙醇-氫氧化鉀溶液溶解1 g球等鞭金藻凍干粉,50 W超聲破碎20 min,70 ℃浸提1 h,抽濾,用乙醇洗滌濾餅,加入20 mL去離子水?dāng)U大體積,用正己烷萃取,HCl調(diào)整溶液pH值后,加入正己烷進(jìn)行皂化反應(yīng),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷,用尿素包埋溶液中的飽和脂肪酸或者單不飽和脂肪酸后-20 ℃冷凍保存2 h(此過(guò)程一直在氮?dú)獗Wo(hù)下進(jìn)行)。

    1.3.4.2 多不飽和脂肪酸甲酯化

    在1 g球等鞭金藻粉所得的多不飽和脂肪酸中,加入硫酸-甲醇溶液置于75 ℃條件下水浴甲酯化1 h,反應(yīng)結(jié)束后加入生理鹽水和正己烷,振蕩混勻,靜置分層,取上層溶液,加入適量的無(wú)水硫酸鈉離心10 min,取上層溶液并用正己烷定容至10 mL,置于-20 ℃條件下保存。

    1.3.4.3 DHA含量測(cè)定

    采用GC法測(cè)定DHA含量。操作條件如下:色譜柱為HP-88型石英毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm,0.20 μm);色譜柱溫度:210 ℃,恒溫20 min,以3 ℃/min升溫至240 ℃,維持20 min;進(jìn)樣口溫度:260 ℃;FID檢測(cè)器溫度:260 ℃;進(jìn)樣方式:分流,分流比10∶1;進(jìn)樣量:1 μL;載氣:高純氮?dú)猓?9.99%)。

    1.3.4.4 DHA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    取不同質(zhì)量濃度DHA-甲酯對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣1.0 μL,測(cè)定峰面積響應(yīng)值,分別以DHA-甲酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo),得到線性回歸方程y=947.32x-4 032.5(R2=0.999 1)。表明在DHA-甲酯質(zhì)量濃度為2 000~20 000 μg/mL范圍內(nèi),色譜峰面積與DHA-甲酯含量線性關(guān)系良好。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 球等鞭金藻在最適溫度下的生長(zhǎng)特性

    圖1 球等鞭金藻3011在24 ℃條件下的生長(zhǎng)曲線(n==33)Fig.1 Growth curve of Isochrysis galbana 3011 at 24 ℃(n = 3)

    圖1 為球等鞭金藻細(xì)胞在最適溫度(24 ℃)下培養(yǎng)測(cè)得的生長(zhǎng)曲線,該曲線的回歸方程為y=0.000 2x5-0.003 6x4-0.082 1x3+2.274 0x2-5.108 2x(R2= 0.993 5)。球等鞭金藻的生長(zhǎng)特點(diǎn)如下:第1~4天為生長(zhǎng)停滯期,第5~10天為指數(shù)生長(zhǎng)期,第11~13天為指數(shù)生長(zhǎng)末期,第14~18天為靜止期,第19天之后進(jìn)入細(xì)胞衰亡期。本研究選取生物量最高的指數(shù)末期(第11天)作為低溫誘導(dǎo)時(shí)間,同時(shí)后續(xù)實(shí)驗(yàn)將最適溫度(24 ℃)設(shè)置為對(duì)照組。

    2.2 低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻抗氧化系統(tǒng)的影響

    2.2.1 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻SOD活性的影響

    圖2 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻SOD活性的影響Fig.2 Effect of low temperature on SOD activity

    不同溫度對(duì)球等鞭金藻SOD活性的影響見圖2。當(dāng)?shù)蜏卣T導(dǎo)時(shí)間少于18 h時(shí),與對(duì)照組比較,其他處理組的球等鞭金藻SOD活力均顯著提高,而且誘導(dǎo)溫度越低,SOD活力提高程度越大。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),15、18、21 ℃處理組的球等鞭金藻SOD活力又依次開始下降,這3 個(gè)處理組球等鞭金藻SOD活力的最大值分別為1 079.63、1 009.2、849.27 U/mg,比對(duì)照組分別提高了179%、168%和141%。

    2.2.2 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻CAT活性的影響

    不同溫度對(duì)球等鞭金藻CAT活性的影響見圖3。球等鞭金藻經(jīng)過(guò)較短時(shí)間(少于18 h)的低溫誘導(dǎo)時(shí),與對(duì)照組比較,球等鞭金藻的CAT活力顯著提高,而且誘導(dǎo)溫度越低,CAT活力提高程度越大。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),15 ℃處理組的球等鞭金藻CAT活性在18 h后開始下降,18 ℃處理組則發(fā)生在24 h之后,而21 ℃處理組在30 h之后才開始有緩慢下降。15、18、21 ℃處理組球等鞭金藻CAT活力的最大值分別為332.05、318.90、282.47 U/mg,比對(duì)照組分別提高了1.73、1.67、1.47 倍。

    圖3 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻CAT活性的影響Fig.3 Effect of low temperature on CAT activity

    2.2.3 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻POD活性的影響

    圖4 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻POD活性的影響Fig.4 Effect of low temperature on POD activity

    低溫對(duì)球等鞭金藻POD活性的影響如圖4所示,在低溫誘導(dǎo)18 h內(nèi),與對(duì)照組相比,球等鞭金藻POD酶活力有明顯提高,并且誘導(dǎo)溫度越低,POD活力提高程度越大。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過(guò)18 h時(shí),15 ℃處理組的球等鞭金藻POD活力開始下降,6 h后(24 h時(shí))18 ℃處理組POD活力也開始下降,當(dāng)?shù)蜏卣T導(dǎo)至30 h時(shí),21 ℃處理組的POD活力開始緩慢下降。48 h時(shí),15、18 ℃處理組的POD活力已經(jīng)低于對(duì)照組。15、18、21 ℃處理組球等鞭金藻的POD活力最大值分別為217.40、214.67、202.33 U/mg,比對(duì)照組分別提高了152%、150%、142%。

    2.2.4 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻GSH含量的影響

    圖5 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻GSH含量的影響Fig.5 Effect of low temperature on GSH content

    如圖5所示,3 個(gè)低溫誘導(dǎo)處理組的球等鞭金藻GSH含量均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),但與上述3 種酶的區(qū)別在于48 h內(nèi),3 個(gè)低溫誘導(dǎo)處理組的球等鞭金藻GSH含量始終高于對(duì)照組。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間少于18 h時(shí),與對(duì)照組相比,GSH含量明顯提高,而且溫度越低,GSH含量增加速率越快。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),15 ℃處理組的球等鞭金藻GSH含量在18 h時(shí)開始下降,18 ℃處理組在24 h時(shí)GSH含量下降, 21 ℃處理組在30 h之后才開始緩慢下降。21、18、15 ℃處理組球等鞭金藻的GSH含量最大值分別為613.65、773.68、782.76 mg/g pro,比對(duì)照組分別提高了1.53、1.93、1.95 倍。

    2.2.5 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻MDA含量的影響

    圖6 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻MDA含量的影響Fig.6 Effect of low temperature on MDA content

    圖6 顯示了由低溫所引起的球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量的變化,與對(duì)照組比較,各處理組球等鞭金藻在短時(shí)間(24 h內(nèi))的低溫誘導(dǎo)處理下的MDA含量并無(wú)差異(P>0.05)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),在30 h 時(shí)15 ℃處理組的球等鞭金藻MDA含量最先開始增加,6 h后(36 h 時(shí))18 ℃處理組的MDA含量也出現(xiàn)了顯著增加,而21 ℃處理組則是在48 h時(shí)才檢測(cè)到MDA含量的存在。15、18、21 ℃處理組球等鞭金藻在48 h時(shí)的MDA含量分別為2.987、2.477、1.00 nmol/mg pro。

    總之,球等鞭金藻3011經(jīng)低溫誘導(dǎo),其細(xì)胞內(nèi)SOD、POD和CAT活力以及GSH含量均顯著提高。副產(chǎn)物MDA的水平受誘導(dǎo)溫度和時(shí)間的雙重影響,低溫長(zhǎng)時(shí)環(huán)境中MDA水平增加明顯。因此,誘導(dǎo)溫度越低,處理時(shí)間越長(zhǎng),對(duì)球等鞭金藻的正常生理代謝影響越大,引起細(xì)胞膜的損傷程度越高,從而導(dǎo)致球等鞭金藻細(xì)胞偏離正常水平生長(zhǎng)。而合適的環(huán)境刺激(有效的低溫和適當(dāng)?shù)臅r(shí)間)能使細(xì)胞有足夠強(qiáng)烈的防御響應(yīng),誘導(dǎo)其加強(qiáng)合成DHA,同時(shí)對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞本身的損傷較小。為此,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了不同溫度和時(shí)間誘導(dǎo)下球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,以確定適合DHA積累的最佳溫度和時(shí)間。

    2.3 低溫誘導(dǎo)下球等鞭金藻的ROS水平

    ROS為具有化學(xué)活性的含氧分子,主要包括超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫和羥自由基,因?yàn)楹送馕磁鋵?duì)電子的存在,ROS具有很強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性[13]。伴隨著機(jī)體正常呼吸代謝過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生一定量的ROS,這些ROS很快被細(xì)胞中的抗氧化酶或還原性物質(zhì)清除掉。然而,當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境(例如低溫)影響時(shí),ROS的生成量會(huì)急劇增多,超過(guò)機(jī)體自身的清除能力,過(guò)多的ROS可以使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞。圖7是球等鞭金藻細(xì)胞在18 ℃條件下誘導(dǎo)4、20 h時(shí)ROS的產(chǎn)生狀況。而球等鞭金藻在不同的低溫條件下誘導(dǎo)不同時(shí)間,其細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化情況見表1。當(dāng)受到較短時(shí)間的低溫誘導(dǎo)(少于12 h)時(shí),低溫處理組與對(duì)照組(24 ℃處理組)的ROS水平差異不顯著。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),ROS水平呈現(xiàn)出不同程度地增加,21 ℃處理組的球等鞭金藻ROS含量緩慢增加,在24 h時(shí)出現(xiàn)最大值為(9.18±0.52)%;15、18 ℃處理組誘導(dǎo)16 h時(shí)出現(xiàn)明顯的ROS水平爆發(fā),與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05),這兩組在20 h時(shí)球等鞭金藻的ROS水平出現(xiàn)最大值分別為(14.11±0.11)%和(14.74±0.58)%。

    圖7 18 ℃誘導(dǎo)4 h(a)和20 h(b)球等鞭金藻3011的DCFH-DA染色熒光結(jié)果Fig.7 DCFH-DA staining fluorescence of Isochrysis galbana 3011 induced at 18 ℃ for 4 (a) and 20 h (b)

    表1 溫度對(duì)球等鞭金藻3011 ROS水平的影響Table 1 Effect of low temperature on ROS level of Isochrysis galbana 3011

    2.4 低溫誘導(dǎo)下球等鞭金藻的DHA產(chǎn)量

    18 ℃誘導(dǎo)24、48 h后,球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的DHA水平分別為0.105、0.092 mg/g,而對(duì)照組(24 ℃,24 h)的DHA水平為0.045 mg/g。即經(jīng)過(guò)18 ℃誘導(dǎo)24 h后球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的DHA含量比對(duì)照組高出1 倍多。因此,低溫誘導(dǎo)是提高球等鞭金藻DHA產(chǎn)量的十分有效的方法。

    3 結(jié)論與討論

    正常情況下,機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除是處于平衡狀態(tài)的,此時(shí)機(jī)體ROS含量較低,對(duì)機(jī)體不會(huì)造成任何傷害。當(dāng)受到環(huán)境脅迫(如低溫)時(shí),細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低,并產(chǎn)生大量ROS,發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化,導(dǎo)致MDA的積累。最初ROS被認(rèn)為是氧化代謝中具很強(qiáng)毒性作用的副產(chǎn)物[14],但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)ROS在動(dòng)植物的許多生理代謝過(guò)程中均具有害和有利的雙重功能[15],適量的ROS可以作為生物開啟防御機(jī)制的重要信號(hào),誘導(dǎo)許多參與防衛(wèi)功能的次生代謝產(chǎn)物的生物合成及相關(guān)基因的表達(dá)。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)低溫誘導(dǎo)后,球等鞭金藻的抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化的還原性物質(zhì)(GSH)水平均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),且酶活性以及含量均高于對(duì)照組,此結(jié)果與他人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[16-21]。短時(shí)間低溫條件下,這些酶的活性和抗氧化物質(zhì)含量迅速增加,通過(guò)協(xié)同作用減輕由于ROS含量增加所引起的脂質(zhì)過(guò)氧化,維持細(xì)胞的正常代謝。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),抗氧化物質(zhì)能量逐漸減小,酶活性逐漸下降,引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用。因此,過(guò)量的ROS較長(zhǎng)時(shí)間地作用于細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞而言是一種傷害。因此,當(dāng)在恰當(dāng)?shù)牡蜏貤l件下作用適當(dāng)?shù)臅r(shí)間時(shí),一方面可以誘導(dǎo)細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生ROS,另一方面ROS作用于逆境信號(hào),激活機(jī)體的防御響應(yīng),同時(shí)通過(guò)提高抗氧化酶的活性和還原性物質(zhì)的含量來(lái)消除ROS對(duì)機(jī)體自身的不良影響。已有實(shí)驗(yàn)表明,適當(dāng)?shù)牡蜏乜梢源龠M(jìn)多不飽和脂肪酸的積累[22-23]。但長(zhǎng)時(shí)間的低溫誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致ROS的過(guò)度積累,使多不飽和脂肪酸的雙鍵發(fā)生過(guò)氧化作用[24],產(chǎn)生MDA。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示,球等鞭金藻經(jīng)過(guò)18 ℃誘導(dǎo)24 h后,其細(xì)胞內(nèi)DHA水平比對(duì)照組提高了0.06 mg/g,延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間或是降低誘導(dǎo)溫度均會(huì)導(dǎo)致DHA含量下降,這也與他人的研究結(jié)果相似[25]。

    現(xiàn)如今關(guān)于ROS、抗氧化酶以及DHA對(duì)低溫的防御機(jī)理有兩種理論:1)低溫誘導(dǎo)引起ROS水平爆發(fā),抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行主動(dòng)防御,適量的ROS作為信號(hào)分子引起相關(guān)去飽和酶基因的表達(dá),提高了脂肪酸的不飽和度,恢復(fù)細(xì)胞膜脂質(zhì)的流動(dòng)性,以保持其正常的生理功能,提高對(duì)低溫的耐受能力;2)DHA作為非酶促小分子抗氧化物質(zhì),與抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)共同作用,清除低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS[26-27]。在受到低溫誘導(dǎo)時(shí),細(xì)胞膜首先受到傷害,其通透性下降,并發(fā)生膜相變,同時(shí)引起ROS水平的爆發(fā),抗氧化系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)可以進(jìn)行主動(dòng)防御,消除ROS過(guò)量積累引起的傷害,適量ROS的積累可以作為信號(hào)分子誘導(dǎo)細(xì)胞防御基因的表達(dá),激活信號(hào)通對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行重新修飾[28],使機(jī)體脂類代謝、次生代謝、激素合成及代謝等相關(guān)基因的表達(dá)有明顯改變[29-30],保證機(jī)體對(duì)低溫的適應(yīng)性,促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累。但是當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),ROS的產(chǎn)生量過(guò)多,且抗氧化酶活性下降,會(huì)造成次生代謝產(chǎn)物的積累下降,同時(shí)MDA含量增加。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性與溫度成負(fù)相關(guān),隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),酶的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),溫度越低,MDA越早出現(xiàn)。ROS水平爆發(fā)最早出現(xiàn)在15 ℃和18 ℃誘導(dǎo)16 h時(shí),18 ℃誘導(dǎo)20 h有(14.74±0.58)%的細(xì)胞發(fā)生ROS水平爆發(fā),與對(duì)照組比較均具有顯著差異(P<0.05)。18 ℃誘導(dǎo)24 h的球等鞭金藻DHA產(chǎn)量比24 ℃誘導(dǎo)24 h高0.06 mg/g。

    適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境可以作為誘導(dǎo)子引起球等鞭金藻的ROS相關(guān)酶活性的升高,ROS的適量積累可促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物合成。本研究為提高球等鞭金藻細(xì)胞DHA產(chǎn)量和利用球等鞭金藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)DHA提供了參考依據(jù)。

    [1] 周筱娟. 低溫誘導(dǎo)的植物抗凍基因研究進(jìn)展[J]. 紹興文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 24(9): 65-69. DOI:10.3969/j.issn.1008-293X.2004.09.017.

    [2] 宰學(xué)明, 吳國(guó)榮, 陸長(zhǎng)梅, 等. 低溫預(yù)處理對(duì)大豆萌芽活力及其活性氧代謝的影響[J]. 大豆科學(xué), 2001, 20(3): 163-166. DOI:10.3969/ j.issn.1000-9841.2001.03.002.

    [3] 朱素琴. 高鹽/低溫脅迫下水稻葉細(xì)胞內(nèi)ASC的氧化還原狀態(tài)和外源ABA的作用研究[D]. 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2011: 12.

    [4] WINSTON S W, DIGIULIO R T. Prooxidant and antioxidant mechanisms in aquatic organisms[J]. Aquatic Toxicology, 1991, 19(2): 137-161. DOI:10.1016/0166-445X(91)90033-6.

    [5] YOSHIOKA H, ASAI S, YOSHIOKA M, et al. Molecular mechanisms of generation for nitric oxide and reactive oxygen species, and role of the radical burst in plant immunity[J]. Molecules and Cells, 2009, 28(4): 321-329. DOI:10.1007/s10059-009-0156-2.

    [6] TAMAS L, MISTRIK I, HUTTOVA J, et al. Role of reactive oxygen species generating enzymes and hydrogen peroxide during cadmium mercury and osmotic stresses in barley root tip[J]. Planta, 2010, 231(2): 221-231. DOI:10.1007/s00425-009-1042-z.

    [7] PU G B, MA D M, CHEN J L, et al. Salicylic acid activates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.[J]. Plant Cell Reports, 2009, 28(7): 1127-1135. DOI:10.1007/s00299-009-0713-3.

    [8] ZHAO J, HU Q, GUO Y Q, et al. Elicitor-induced indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus cell cultures is related to Ca2+influx and the oxidative burst[J]. Plant Science, 2001, 161(3): 423-431. DOI:10.1016/S0168-9452(01)00422-8.

    [9] 林武杰, 吳云輝. 海洋微藻多不飽和脂肪酸研究進(jìn)展[J]. 福建水產(chǎn), 2013, 35(1): 78-82. DOI:10.3969/j.issn.1006-5601.2013.01.014.

    [10] 趙培, 王雪青, 陳慶森, 等. Zn2+對(duì)球等鞭金藻3011細(xì)胞膜電位和膜通透性的影響[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(5): 66-70.

    [11] 趙培, 王雪青, 彭博麗, 等. 熒光分析法檢測(cè)金藻對(duì)Zn2+的利用[J]. 食品研究與開發(fā), 2011, 32(8): 87-90. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2011.08.027.

    [12] 趙培, 王雪青, 魏丹, 等. 赤霉素對(duì)球等鞭金藻3011生物量、細(xì)胞形態(tài)與不同生長(zhǎng)時(shí)期群體細(xì)胞活性的影響[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2011, 28(5): 383-386.

    [13] 王海波, 黃雪梅, 張昭其. 植物逆境脅迫中活性氧和鈣信號(hào)的關(guān)系[J].北方園藝, 2010(22): 189-194.

    [14] 張怡, 路鐵鋼. 植物中的活性氧研究概述[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2011, 1(4): 242-248.

    [15] ZHOU D, SHAO L, SPITZ D R. Reactive oxygen species in normal and tumor stem cells[J]. Advances in Cancer Research, 2014, 122: 1-67. DOI:10.1016/B978-0-12-420117-0.00001-3.

    [16] 毛永強(qiáng). 低溫下脅迫螺旋藻(節(jié)旋藻)幾種氧化還原酶的研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古師范大學(xué), 2007: 3-17.

    [17] 劉娟妮, 王雪青, 龐廣昌. 溫度和光照對(duì)極大螺旋藻多糖含量和SOD酶活力的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(9): 132-134.

    [18] RADY A A, EI-SHEEKH M M, MATKOVICS B. Temperature shift induced changes in the antioxidant enzyme system of Cyanobacterium ynechocystis PCC 6803[J]. International Journal of Biochemistry, 1994, 26(3): 433-435. DOI:10.1016/0020-711X(94)90064-7.

    [19] 闞光鋒. 南極冰藻Chlamydomona sp. L4的逆境適應(yīng)性及其抗逆蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2005: 26-33.

    [20] 丁燏, 繆錦來(lái), 王全富, 等. 溫度對(duì)南極衣藻ICE-L(Chlamydomonas sp. ICE-L)谷胱甘肽含量及其相關(guān)酶活性的影響[J]. 海洋與湖沼, 2006, 37(2): 154-161. DOI:10.3321/j.issn:0029-814X.2006.02.009.

    [21] 夏利花, 何劍鋒, 高巖, 等. 三種北極微藻對(duì)不同溫度的適應(yīng)性研究[J].極地研究, 2009, 21(4): 279-287.

    [22] 郭兵, 龔陽(yáng), 萬(wàn)霞, 等. 光強(qiáng)和溫度對(duì)球等鞭金藻(Isochrysis sphaerica)生長(zhǎng)及其脂肪酸的影響[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2011, 33(3): 295-301.

    [23] CONVERTI A, CASAZZA A A, ORTIZ E Y, et al. Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production[J]. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 2009, 48(6): 1146-1151. DOI:10.1016/ j.cep.2009.03.006.

    [24] CAI Fang, DUPERTUIS Y M, PICHARD C. Role of polyunsaturated fatty acids and lipid peroxidation on colorectal cancer risk and treatments[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care, 2012, 15(2): 99-106. DOI:10.1097/MCO.0b013e32834feab4.

    [25] 蔣漢明, 翟靜, 張媛英, 等. 溫度對(duì)海洋微藻生長(zhǎng)及脂肪酸組成的影響[J]. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(6): 9-12. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2005.06.003.

    [26] FISARAKIS I, CHARTZOULAKIS K, STAVRAKAS D. Response of Sultana vines (V. vinifera L.) on six rootstocks to NaCl salinity exposure and recovery[J]. Agricultural Water Management, 2001, 51(1): 13-27. DOI:10.1016/S0378-3774(01)00115-9.

    [27] 范博. 低溫脅迫下ABA誘導(dǎo)冬小麥抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的研究[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 6.

    [28] 程艷麗, 宋純鵬. 植物細(xì)胞H2O2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[J]. 中國(guó)科學(xué): 生命科學(xué), 2005, 35(6): 480-489. DOI:10.3321/ j.issn:1006-9259.2005.06.001.

    [29] GECHEV T, WILLEKENS H, van MONTAGU M, et al. Different responses of tobacco antioxidant enzymes to light and chilling stress[J]. Journal of Plant Physiology, 2003, 160(5): 509-515. DOI:10.1078/0176-1617-00753.

    [30] SUZUKI N, SEJIMA H, TAM R, et al. Identification of the MBF1 heat-response regulon of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal, 2011, 66(5): 844-851. DOI:10.1111/j.1365-313X.2011.04550.x.

    Effect of Low Environmental Temperature on Antioxidant System and DHA Content in Isochrysis galbana 3011

    WANG Ting, ZHAO Pei, WANG Xueqing*
    (Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

    Effects of low environmental temperature on the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT), and the contents of glutathione peroxidase (GSH), malondialdehyde (MDA), docosahexaenoic acid (DHA) and reactive oxygen species (ROS) in Isochrysis galbana 3011 were investigated for exploring the relationship among antioxidant enzyme activities, ROS levels and DHA contents at different temperatures. The enzyme activities were determined by corresponding kits. ROS levels were detected by flow cytometry and inverted fluorescence microscope, and DHA contents were determined by gas chromatography (GC). The results showed that activities of SOD, CAT and POD increased firstly and then decreased with increasing culture time at 15, 18 and 21 ℃. Lower temperature could result in earlier and higher enzyme activity peaks followed by a faster decline. The profile of GSH was similar to that of antioxidant enzyme activities, while content of MDA increased continuously. ROS levels showed a complex change with declining temperature, and ROS burst was appeared after induction for 16 h at 15 and 18 ℃, with maximum values of (14.11 ± 0.11)% and (14.74 ± 0.58)% at 20 h, respectively (P < 0.05). DHA was 0.105 mg/g at 18 ℃ for 24 h, which was higher than that at 24 ℃ for 24 h by 0.06 mg/g. Therefore, low environmental temperature can improve the levels of metabolic products by activating microalgae defense responses, increasing ROS-related enzyme activities, ROS levels and DHA contents.

    Isochrysis galbana 3011; antioxidant; low temperature; reactive oxygen species (ROS); docosahexaenoic acid

    10.7506/spkx1002-6630-201601023

    TS207.3

    A

    1002-6630(2016)01-0126-07

    王婷, 趙培, 王雪青. 低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻3011抗氧化系統(tǒng)和二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 126-132.

    DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601023. http://www.spkx.net.cn

    WANG Ting, ZHAO Pei, WANG Xueqing. Effect of low environmental temperature on antioxidant system and DHA content in Isochrysis galbana 3011[J]. Food Science, 2016, 37(1): 126-132. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601023. http://www.spkx.net.cn

    2015-02-11

    天津市高等學(xué)??萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目(20120603);國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31270050; 31071522;31171674)

    王婷(1989—),女,碩士研究生,主要從事微藻生理生化研究。E-mail:xuantingqian@aliyun.com

    *通信作者:王雪青(1964—),女,教授,博士,主要從事天然活性物質(zhì)研究。E-mail:wxqing@tjcu.edu.cn

    猜你喜歡
    活力低溫抗氧化
    低溫也能“燙傷”嗎
    6000倍抗氧化能力,“完爆”維C!昶科將天然蝦青素研發(fā)到極致
    基于低溫等離子體修飾的PET/PVC浮選分離
    活力
    零下低溫引發(fā)的火災(zāi)
    改制增添活力
    收回編制 激發(fā)活力
    低溫休眠不是夢(mèng)
    全公開激發(fā)新活力
    浙江人大(2014年1期)2014-03-20 16:20:00
    豬皮膠原蛋白抗氧化肽的分離純化及體外抗氧化活性研究
    不卡av一区二区三区| a在线观看视频网站| 色在线成人网| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲熟妇熟女久久| 此物有八面人人有两片| 超碰成人久久| www.熟女人妻精品国产| 中亚洲国语对白在线视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品欧美国产一区二区三| 黄色视频,在线免费观看| 婷婷六月久久综合丁香| 久久香蕉精品热| 看免费av毛片| 亚洲成国产人片在线观看| 99riav亚洲国产免费| 变态另类丝袜制服| 99re在线观看精品视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 高清在线国产一区| 夜夜夜夜夜久久久久| 满18在线观看网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 无限看片的www在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 午夜激情福利司机影院| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久精品影院6| 国产成人系列免费观看| 又紧又爽又黄一区二区| 国内精品久久久久精免费| 中出人妻视频一区二区| 久9热在线精品视频| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲精品粉嫩美女一区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产高清视频在线播放一区| 搞女人的毛片| 国产激情欧美一区二区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 在线看三级毛片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品九九99| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 999精品在线视频| 日韩国内少妇激情av| 看免费av毛片| 婷婷丁香在线五月| 日韩大码丰满熟妇| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 露出奶头的视频| 亚洲人成77777在线视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产免费男女视频| 看免费av毛片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲真实伦在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 成人三级做爰电影| 国产成人av教育| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 又大又爽又粗| 日本五十路高清| 亚洲中文av在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 一级毛片女人18水好多| 狂野欧美激情性xxxx| 青草久久国产| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久久久久九九精品二区国产 | 可以在线观看毛片的网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日本免费a在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 丝袜在线中文字幕| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 两人在一起打扑克的视频| 国产99久久九九免费精品| 老司机在亚洲福利影院| 免费看a级黄色片| 午夜免费观看网址| 1024视频免费在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 不卡av一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 免费观看人在逋| 国产区一区二久久| 窝窝影院91人妻| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 精华霜和精华液先用哪个| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线观看舔阴道视频| 999精品在线视频| 久久99热这里只有精品18| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲国产欧美网| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久精品欧美日韩精品| 长腿黑丝高跟| 亚洲男人天堂网一区| 18禁国产床啪视频网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 妹子高潮喷水视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲午夜理论影院| 精品福利观看| 91九色精品人成在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 中国美女看黄片| 亚洲第一青青草原| 精品久久久久久,| 国产爱豆传媒在线观看 | 一本综合久久免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| xxxwww97欧美| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产一区二区激情短视频| 久久精品国产清高在天天线| 在线天堂中文资源库| cao死你这个sao货| 嫩草影院精品99| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲片人在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲美女黄片视频| 99re在线观看精品视频| 黄色女人牲交| 免费av毛片视频| 在线免费观看的www视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 午夜免费观看网址| 长腿黑丝高跟| 日韩视频一区二区在线观看| 久久久国产精品麻豆| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产高清有码在线观看视频 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品不卡国产一区二区三区| 一二三四在线观看免费中文在| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲色图av天堂| 白带黄色成豆腐渣| 精品不卡国产一区二区三区| 成人特级黄色片久久久久久久| 成人av一区二区三区在线看| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲美女黄片视频| 国产主播在线观看一区二区| 露出奶头的视频| 欧美日韩乱码在线| 国产成人精品无人区| 两个人视频免费观看高清| 日日干狠狠操夜夜爽| 51午夜福利影视在线观看| a级毛片在线看网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久久久久久午夜电影| 午夜免费观看网址| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲av成人av| 女性生殖器流出的白浆| 一个人免费在线观看的高清视频| 黄色视频,在线免费观看| 两个人视频免费观看高清| a级毛片在线看网站| a级毛片在线看网站| 成年人黄色毛片网站| 男人操女人黄网站| bbb黄色大片| 十分钟在线观看高清视频www| 99热6这里只有精品| 十八禁人妻一区二区| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲无线在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 香蕉av资源在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品九九99| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲,欧美精品.| 色综合亚洲欧美另类图片| 精品人妻1区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品久久久久久,| 一a级毛片在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲,欧美精品.| 十八禁网站免费在线| 久久久久久国产a免费观看| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲av电影在线进入| а√天堂www在线а√下载| 51午夜福利影视在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 在线观看日韩欧美| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| www.熟女人妻精品国产| 成人精品一区二区免费| 午夜激情av网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲黑人精品在线| 黄色片一级片一级黄色片| 老司机福利观看| 中文字幕高清在线视频| 日韩精品中文字幕看吧| 美女午夜性视频免费| 大型av网站在线播放| 国产97色在线日韩免费| 中文在线观看免费www的网站 | xxx96com| 精品国产国语对白av| 18禁国产床啪视频网站| 一二三四社区在线视频社区8| 国产亚洲精品久久久久5区| 一本一本综合久久| 欧美中文日本在线观看视频| 我的亚洲天堂| 搞女人的毛片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美黄色片欧美黄色片| 日韩视频一区二区在线观看| 免费看十八禁软件| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 女同久久另类99精品国产91| 精品人妻1区二区| 国产高清激情床上av| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 脱女人内裤的视频| 色老头精品视频在线观看| 97碰自拍视频| 免费在线观看完整版高清| 久久中文字幕人妻熟女| 午夜精品在线福利| 99热这里只有精品一区 | 国产午夜福利久久久久久| 亚洲第一av免费看| 久久久久久大精品| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产野战对白在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 老司机午夜十八禁免费视频| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲av五月六月丁香网| av天堂在线播放| 天堂动漫精品| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 99国产精品一区二区三区| 自线自在国产av| 女性生殖器流出的白浆| 国产成人影院久久av| 桃色一区二区三区在线观看| 日日夜夜操网爽| 又紧又爽又黄一区二区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品久久久久久久末码| 精品久久蜜臀av无| 精品高清国产在线一区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲国产看品久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 俺也久久电影网| 校园春色视频在线观看| 91九色精品人成在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 免费电影在线观看免费观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲人成伊人成综合网2020| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国语自产精品视频在线第100页| 此物有八面人人有两片| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产视频内射| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 亚洲真实伦在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 香蕉久久夜色| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲人成77777在线视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 热re99久久国产66热| 女警被强在线播放| 精品乱码久久久久久99久播| 一边摸一边做爽爽视频免费| 此物有八面人人有两片| 丰满的人妻完整版| 麻豆av在线久日| 欧美中文综合在线视频| 婷婷亚洲欧美| 久久狼人影院| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 首页视频小说图片口味搜索| 91九色精品人成在线观看| 久久精品人妻少妇| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 人人妻人人澡人人看| 国产99久久九九免费精品| 国产午夜福利久久久久久| 婷婷六月久久综合丁香| 黑丝袜美女国产一区| 午夜精品在线福利| 制服人妻中文乱码| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲国产精品999在线| 黄片小视频在线播放| 黄片大片在线免费观看| 欧美大码av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品电影一区二区在线| 视频区欧美日本亚洲| 免费在线观看亚洲国产| 免费在线观看日本一区| 欧美三级亚洲精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 一级片免费观看大全| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲第一青青草原| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 操出白浆在线播放| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品,欧美在线| 免费人成视频x8x8入口观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲精品国产区一区二| 天堂动漫精品| 一本一本综合久久| 日本一本二区三区精品| 亚洲精品国产区一区二| 在线免费观看的www视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本三级黄在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产免费av片在线观看野外av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲在线自拍视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 一进一出好大好爽视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 日韩精品青青久久久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久久国产成人免费| 国产激情欧美一区二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| videosex国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美乱码精品一区二区三区| 丁香欧美五月| 两个人视频免费观看高清| 国产在线精品亚洲第一网站| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲无线在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产黄片美女视频| 午夜免费观看网址| av福利片在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 日本五十路高清| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久精品影院6| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 女性生殖器流出的白浆| e午夜精品久久久久久久| 国语自产精品视频在线第100页| 宅男免费午夜| 久9热在线精品视频| 色播在线永久视频| 一a级毛片在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品电影一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 黄色视频,在线免费观看| 免费看日本二区| 精品福利观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 99精品久久久久人妻精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 男女午夜视频在线观看| 69av精品久久久久久| 国产成人av激情在线播放| 嫩草影视91久久| 色播亚洲综合网| 国产精品电影一区二区三区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 香蕉国产在线看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久热这里只有精品99| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文字幕人妻熟女乱码| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品国产美女av久久久久小说| 国产成人av教育| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲午夜理论影院| 国产爱豆传媒在线观看 | 日本免费a在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 悠悠久久av| 欧美成人性av电影在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 草草在线视频免费看| 1024手机看黄色片| 亚洲专区字幕在线| 国产成年人精品一区二区| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美不卡视频在线免费观看 | 一级a爱片免费观看的视频| 成年人黄色毛片网站| 国产伦在线观看视频一区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99在线视频只有这里精品首页| 精品久久久久久久久久久久久 | 午夜a级毛片| 欧美色视频一区免费| 欧美日本视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 美女 人体艺术 gogo| 日韩精品中文字幕看吧| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产在线观看jvid| cao死你这个sao货| 国产精品电影一区二区三区| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 中文亚洲av片在线观看爽| 91av网站免费观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲自拍偷在线| 久久九九热精品免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 少妇粗大呻吟视频| 成人午夜高清在线视频 | 国产精品久久久久久精品电影 | 精品不卡国产一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 欧美中文综合在线视频| 好男人电影高清在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产熟女xx| 国产av不卡久久| 国产激情久久老熟女| 97碰自拍视频| 最近最新免费中文字幕在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av片东京热男人的天堂| 身体一侧抽搐| 中国美女看黄片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产成人精品久久二区二区免费| 宅男免费午夜| 日韩欧美在线二视频| 无遮挡黄片免费观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 中文字幕久久专区| 1024香蕉在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 12—13女人毛片做爰片一| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 色综合婷婷激情| 亚洲久久久国产精品| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久久国产欧美日韩av| 午夜老司机福利片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一级片免费观看大全| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产一区二区在线av高清观看| 国产高清videossex| 久久狼人影院| av片东京热男人的天堂| 日韩免费av在线播放| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 听说在线观看完整版免费高清| 可以在线观看毛片的网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美中文日本在线观看视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 后天国语完整版免费观看| 少妇 在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产黄a三级三级三级人| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 在线视频色国产色| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产一区二区三区视频了| 大香蕉久久成人网| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲九九香蕉| 在线国产一区二区在线| 哪里可以看免费的av片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产亚洲精品第一综合不卡| 免费在线观看亚洲国产| 18禁观看日本| bbb黄色大片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 青草久久国产| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品久久久久久久末码| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 哪里可以看免费的av片| 欧美中文日本在线观看视频| 久久精品人妻少妇| 成年人黄色毛片网站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 变态另类丝袜制服| 可以在线观看毛片的网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 我的亚洲天堂| 欧美黑人欧美精品刺激| 91老司机精品| 亚洲精品美女久久av网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 99国产综合亚洲精品| 欧美乱码精品一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 无限看片的www在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一本大道久久a久久精品| 91av网站免费观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产黄色小视频在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 曰老女人黄片| 色播亚洲综合网| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产精品久久视频播放| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产av又大| 不卡一级毛片| 女警被强在线播放| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产成人欧美在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲男人的天堂狠狠| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 日本 av在线| 观看免费一级毛片| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲午夜理论影院| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| www日本在线高清视频| 夜夜爽天天搞| 一级黄色大片毛片| 1024手机看黄色片| 亚洲精品在线观看二区| 狂野欧美激情性xxxx|