不同年齡牦牛宰后鈣激活酶活性及嫩度指標(biāo)變化

楊巧能，梁 琪*，文鵬程，張 炎

不同年齡牦牛宰后鈣激活酶活性及嫩度指標(biāo)變化

楊巧能，梁 琪*，文鵬程，張 炎

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

本研究對不同年齡牦牛宰后成熟過程中鈣激活酶活性和嫩度指標(biāo)（肌纖維直徑、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）、肌原纖維超微結(jié)構(gòu)）進(jìn)行測定。結(jié)果表明：成熟過程中，不同年齡牦牛肉肌纖維直徑、MFI都發(fā)生顯著變化（P＜0.05），肌原纖維在成熟過程中Z線斷裂，框架結(jié)構(gòu)被完全破壞；鈣激活酶活性在宰后的前2 d均顯著下降（P＜0.05），且成熟過程中不同年齡公牦牛的鈣激活酶活性均高于母牦牛；成熟時(shí)間與鈣激活酶活性、嫩度指標(biāo)均成極顯著相關(guān)性（P＜0.01）；牦牛宰后 經(jīng)過7 d的成熟，可以降低牦牛因屠宰年齡不同而產(chǎn)生的差異，同時(shí)也可以改善肉的嫩度；與公牦牛相比母牦牛宰后成熟時(shí)間可以適當(dāng)?shù)难娱L。

牦牛；年齡；鈣激活酶；嫩度

嫩度是決定肌肉食用品質(zhì)的重要指標(biāo)，動(dòng)物宰后肌肉在成熟過程中，骨架蛋白的降解對嫩度的提高起主要作用。Taylor等[1]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性的鈣激活蛋白酶系對肌肉骨架蛋白的降解有重要的作用，并提取鈣激活蛋白酶液作用于分離的肌原纖維，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌原纖維的Z線斷裂并逐漸消失，大大提高了肉的嫩度。Robbins等[2]研究發(fā)現(xiàn)，宰后牛肉成熟過程中，肌細(xì)胞骨架蛋白的降解是宰后肌肉嫩度得到改善的最主要因素。黃明等[3]研究表明成熟過程中鈣激活酶可以降解肌原纖維中的骨架蛋白，從而破壞肌原纖維的結(jié)構(gòu)，增加肉的嫩度。目前，大量的研究已經(jīng)證實(shí)：鈣激活蛋白酶系廣泛存在于動(dòng)物的組織中，并且與動(dòng)物活體時(shí)的生長速率以及宰后肌肉的嫩化有密切的關(guān)系。國內(nèi)外學(xué)者做了許多有關(guān)指示牛肉嫩度特征指標(biāo)的研究，研究結(jié)果表明，鈣蛋白酶活性、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）等都可以用來衡量牛肉的嫩度[4-7]。

牦牛是青藏高原特有的畜種，具有高蛋白、低脂肪等特性，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的保健型肉食品，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值，深受國際國內(nèi)市場的青睞[8]。在目前生產(chǎn)中，牦牛肉不經(jīng)過成熟便直接銷售，嚴(yán)重影響了其品質(zhì)。且牦牛以天然放牧為主，屠宰年齡比較分散，小到3 歲以下，大到12 歲以上，寬泛的屠宰年齡對牦牛宰后肉質(zhì)的嫩化也產(chǎn)生了一定影響。因此，本研究通過對宰后成熟過程中不同年齡牦牛肉的肌纖維直徑、MFI、肌原纖維超微結(jié)構(gòu)以及鈣蛋白酶粗酶活性等指標(biāo)的測定，探索牦牛肉宰后成熟過程中這些指標(biāo)的變化規(guī)律及其與宰后成熟時(shí)間的相關(guān)性，從而為不同年齡及性別牦牛宰后肌肉的成熟變化機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)選取甘肅甘南藏族自治州瑪曲縣的健康放牧牦牛40 頭，分為≤3歲、（3，5] 歲、（5，7] 歲、＞7 歲共4 個(gè)年齡段，每個(gè)年齡段各10 頭，公母各半，根據(jù)當(dāng)?shù)卣w屠宰年齡進(jìn)行屠宰實(shí)驗(yàn)。禁食12～24 h，禁水2 h，屠宰后立即取背最長肌，去除表面脂肪、筋腱及結(jié)締組織后，分割成100 g左右的肉塊，置于4 ℃條件下保存，并于采樣的當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

BP121S電子天平 德國賽多利斯公司；Primo Star顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)金壇市富華電器有限公司；JEM-1230透射電子顯微鏡、745PC型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；TGL-20高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

將不同年齡段牦牛背最長肌分別分為6 組，于宰后0、1、2、3、5、7 d從4 ℃冰箱中取出肉樣，對以下指標(biāo)測定分析。

1.3.1 肌纖維直徑的測定

取用10%甲醛溶液固定好的肉樣，剝離肌纖維，用測微尺在400 倍顯微鏡下測定。每個(gè)肉樣測定100 根肌纖維，計(jì)算平均值。

1.3.2 MFI的測定[9]

取適量的肉樣去除可見脂肪和結(jié)締組織，精確稱取1 g，加入20 倍體積的緩沖液（含100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、1 mmol/L MgCl2和1 mmol/L NaN3，pH 7.1）在4 ℃條件下勻漿。勻漿液于4 ℃、5 000×g離心15 min，棄去上清液，沉淀中加入20 倍體積的緩沖液重新勻漿，再離心棄去上清液，沉淀中加入5 倍體積的緩沖液進(jìn)行勻漿，用200 目尼龍篩網(wǎng)過濾該懸濁液，過濾所得液體即為肌原纖維蛋白溶液。此步驟重復(fù)2 次，合并2 次所得到的溶液。所得的肌原纖維蛋白懸濁液用雙縮脲法測定其蛋白含量，然后用MFI緩沖液將其質(zhì)量濃度調(diào)整至0.5 mg/mL，在540 nm波長處測定其吸光度，所得數(shù)值乘以200，即為MFI。

1.3.3 肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的測定[10]

采樣固定：將肉分切成 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小方塊，放在體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛（0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制，pH 7.3）溶液中在 0～4 ℃條件下固定保存，固定時(shí)間為3 d或更長。

漂洗：用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)漂洗固定后的肉樣，每次10 min，再放入體積分?jǐn)?shù)1%的鋨酸中進(jìn)行固定，固定1 h以上（0～4 ℃），再用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液漂洗，每次10 min。

脫水：用體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、90%和100%乙醇逐步脫洗一次，再用100%的乙醇反復(fù)脫水。

制片：用Epon 812環(huán)氧樹脂對脫水后的樣品進(jìn)行包埋，聚合。修整包埋塊，切成50 mm的超薄片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。

拍照：在透射電子顯微鏡下觀察切片，并對其進(jìn)行拍照。

1.3.4 鈣激活酶（calpains）粗酶活性測定

1.3.4.1 粗酶液的提取

參考Delgado[11]、黃明[12]等的方法并做修改。取屠宰后不同時(shí)間點(diǎn)的牦牛肉，經(jīng)修整后（300 g）4 ℃勻漿，勻漿時(shí)加1 L抽提液（100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、體積分?jǐn)?shù)0.05% β-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，MCE）、100 mg/L卵類黏蛋白抑制劑、2 mmol/L苯甲基黃酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、6 mg/L亮肽素，pH 8.3），然后離心（4 ℃、10 000 r/min、1.5 h），棄去沉淀，取上清液。對上清液進(jìn)行硫酸銨分級沉淀。取P0-45沉淀部分，用適量抽提液溶解后透析（20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、0.1% MCE，pH 7.5），再經(jīng)超速冷凍離心（4 ℃、10 000 r/min、1.5 h），取上清液，并以0.45 μm針式濾膜過濾。

1.3.4.2 粗酶活性的測定

參考黃明[12]、Koohmarie[13]等的方法并稍作修改。取樣品1 mL加1 mL反應(yīng)混合液（100 mmol/L Tris，10 mmol/L MCE，5 mg/mL酪蛋白，用醋酸調(diào)pH值至7.5），反應(yīng)以添加100 μL 0.1 mol/L CaCl2開始，以添加100 μL 0.2 mol/L EDTA為對照，25 ℃反應(yīng)60 min后加2 mL體積分?jǐn)?shù)5% 三氯乙酸終止反應(yīng)，離心（6 000 r/min，30 min），上清液在 278 nm波長處測吸光度。

鈣激活蛋白酶活力單位定義為：25 ℃反應(yīng)60 min，在278 nm波長處吸光度增加1.0催化反應(yīng)所需酶的量為

1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和Pearson’s相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 年齡和成熟時(shí)間對牦牛肉肌纖維直徑的影響

牦牛的肌纖維在各種牛種中直徑最大，且隨著年齡的增長而變粗[14]。由圖1可知，宰后第0天，隨著牦牛年齡增加，肌纖維直徑從49.71 μm增加到63.33 μm；成熟7 d后，從小到大不同年齡牦牛肉肌纖維直徑相比第0天分別減小了18.29%、15.52%、19.41%、19.34%；其中，（3，5] 歲和（5，7] 歲牦牛肉肌纖維直徑隨著成熟時(shí)間的延長顯著降低（P＜0.05）。成熟過程中，肌纖維直徑的下降是由于肌纖維與肌內(nèi)膜發(fā)生分離及汁液的流失導(dǎo)致的[15]。牦牛的屠宰年齡越大，肌纖維直徑值越大。Light等[16]對不同部位牛肉中結(jié)締組織含量和特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)較嫩的肉具有較細(xì)的肌纖維直徑，這說明年齡越大，肉的嫩度就越差。由此可以看出年齡和宰后成熟處理對牦牛肉的肌纖維直徑都有較大的影響，宰后若按照年齡對其進(jìn)行分級，并采用適當(dāng)?shù)某墒鞐l件，將有效提高肌肉嫩度。

圖1 不同年齡牦牛宰后成熟過程中肌纖維直徑的變化Fig.1 Change in muscle fiber diameter during postmortem aging of yak meat at different slaughter ages

2.2 年齡和成熟時(shí)間對牦牛肉MFI的影響

MFI反映了肌原纖維蛋白降解情況和肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞的程度。因此，可以把MFI作為衡量嫩度的指標(biāo)，也可以用來判斷肉的成熟程度[17]。由圖2可知，宰后成熟過程中，MFI值均呈逐漸上升的趨勢，肉的MFI程度越高，越有利于肉的嫩度。年齡越大，肌原纖維其小片化程度越低，宰后第0天，不同年齡牦牛MFI范圍為13.54～35.03，但在整個(gè)成熟過程中不同年齡牦牛肉MFI都有不同程度的增加，成熟7 d后，從小到大年齡牦牛肉MFI值分別為：137.25、115.07、105.24、86.34，相比成熟第0天時(shí)，均提高了2 倍以上，說明宰后成熟對牦牛肉嫩度的改善有較大的影響。MFI在宰后的0～3 d上升幅度較大，說明肌原纖維逐漸降解，有利于肉的嫩度的改善。而在接下來的成熟過程中MFI上升速率和幅度都減弱，基本保持穩(wěn)定，這是由于體內(nèi)蛋白酶的耗盡，肌間蛋白不再被降解所致[18]，MFI這一變化趨勢與Watanabe[19]、師希雄[20]等的研究結(jié)果相一致。

圖2 牦牛宰后成熟過程中不同年齡肉MFI的變化Fig.2 Change in MFI during postmortem aging of yak meat at different slaughter ages

2.3 年齡和成熟時(shí)間對牦牛肉肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的影響

圖3 第0天不同年齡牦牛肉肌原纖維超微結(jié)構(gòu)（×10 000）Fig.3 Myofibril ultrastructure of yak meat at different slaughter ages (×10 000)

圖3 是通過透射電鏡觀察牦牛在宰后成熟第0天時(shí)，不同年齡段肌原纖維的超微結(jié)構(gòu)，從圖中可以看出，不同年齡牦牛肉肌原纖維超微結(jié)構(gòu)在形態(tài)上基本一致，Z線清晰，每一條肌原纖維都呈現(xiàn)規(guī)則的明帶和暗帶。兩條Z線之間為一個(gè)肌節(jié)，肌節(jié)的長度與嫩度的好壞有直接的關(guān)系，肌節(jié)越長，嫩度越好；肌節(jié)越短，嫩度越差。從圖中可以看出（以標(biāo)尺衡量），3 歲及以下牦牛肉肌原纖維超微結(jié)構(gòu)中，肌節(jié)比較長，而（3，5] 歲可以明顯看到肌節(jié)變短；（5，7] 歲和7 歲以上肌節(jié)長度較（3，5] 歲還要短一些。所以年齡對肌原纖維超微結(jié)構(gòu)影響是顯著的，隨著年齡的增大，肌節(jié)長度變短，肉的嫩度變差，適口性受到很大影響。

圖4 （3，5] 歲牦牛宰后成熟過程中肌原纖維超微結(jié)構(gòu)（×10 000）Fig.4 Myofibril ultrastructure during postmortem aging of meat of yaks slaughtered at 3-5 years of age (×10 000)

由圖4可知，在成熟過程中，剛屠宰的牦牛肌原纖維排列整齊，Z線保持完整。牦牛肉成熟1 d時(shí)的肌原纖維超微結(jié)構(gòu)與剛屠宰時(shí)的超微結(jié)構(gòu)并無太大差異，Z線仍保持完整，肌節(jié)間的輪廓清晰可見。牦牛肉成熟2 d和3 d時(shí)，肌原纖維結(jié)構(gòu)基本完好，但肌原纖維之間連接開始不緊密，雖然有的Z線處有輕微的降解現(xiàn)象，但基本上未被破壞。當(dāng)牦牛肉成熟5 d時(shí)，肌原纖維框架結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，肌原纖維間隙增大，Z線兩側(cè)間隙增大并出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。成熟7 d以后，肌原纖維框架結(jié)構(gòu)完全被破壞，Z線斷裂。這一研究結(jié)果與劉麗[21]、Koohmaraie[22]等的研究結(jié)果一致。

2.4 年齡、性別和成熟時(shí)間對牦牛肉鈣激活酶活性的影響

在肌肉組織中，鈣激活酶分為μ-鈣激活酶和m-鈣激活酶兩類，其活性的下降是其發(fā)揮水解作用的標(biāo)志，與宰后肌肉的成熟嫩化有著直接的關(guān)系[23]。由表1可知，鈣激活酶粗酶活力隨著年齡的增大，先增加后減小。宰后成熟過程中，不同年齡牦牛肉鈣激活酶粗酶液活力在成熟的前2 d，均隨成熟時(shí)間的延長而顯著降低（P＜0.05），3 d以后下降速率減慢。宰后第0天時(shí)，≤3 歲、（3，5] 歲和（5，7] 歲不同性別牦牛肉鈣激活酶粗酶液活力均高于7 歲以上?！? 歲和（3，5] 歲不同性別牦牛肉鈣激活酶粗酶液沒有明顯差別，（5，7] 歲和7 歲以上公牦牛的鈣激活酶粗酶液活力均高于母牦牛。整個(gè)成熟過程中，不同性別牦牛肉鈣激活酶粗酶液活性都有下降，但下降過程中公牦牛鈣激活酶粗酶液活力均大于母牦牛。當(dāng)成熟7 d后，（5，7] 歲和7 歲以上公牦牛鈣激活酶粗酶液酶活力分別為剛屠宰后的33.61%和33.62%，而母牦牛酶活力僅為剛屠宰后的25.38%和19.71%，說明母牦牛較公牦牛完成成熟的時(shí)間要短。

表1 宰后成熟時(shí)間對不同年齡及性別牦牛肉鈣激活酶粗酶液酶活力的影響Table 1 Change in calpain activity during postmortem ageing of meat of yaks of different ages and sex

2.5 嫩度指標(biāo)間的相關(guān)性分析

表2 嫩度指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between tenderness indexes of yak meat

表2反映了牦牛宰后成熟過程中，肌纖維直徑、MFI、鈣激活酶粗酶液活性3 個(gè)指標(biāo)變化情況以及與宰后成熟時(shí)間之間的相關(guān)性。由表2可知，MFI與成熟時(shí)間成極顯著正相關(guān)（P＜0.01），肌纖維直徑、鈣激活酶粗酶液活性與成熟時(shí)間成極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），說明宰后成熟對牦牛肉嫩度的改善有著極大的作用。MFI和肌纖維直徑與鈣激活酶粗酶液活性相關(guān)性極顯著（P＜0.01），這可能是由于牦牛肉成熟過程中，鈣激活酶被大量的Ca2+激活，作用于Z線，導(dǎo)致其斷裂、崩解，從而導(dǎo)致了MFI的增加，肌原纖維的弱化和肉的嫩化[24]。Pringle等[25]用Angus（A）和Brhman（B）及其雜交牛為對象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)鈣激活酶的活性與嫩度具有相關(guān)性。李誠等[26]研究發(fā)現(xiàn)MFI和鈣激活酶粗酶液活性可作為評價(jià)豬肉嫩度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中鈣激活酶粗酶活性與MFI、肌纖維直徑成極顯著相關(guān)（P＜0.01），說明這3 個(gè)指標(biāo)均可作為評價(jià)牦牛肉嫩度的指標(biāo)。

3 結(jié) 論

宰后成熟過程中，不同年齡牦牛肉肌纖維直徑顯著下降（P＜0.05），MFI隨著成熟時(shí)間的延長呈增加趨勢，肌原纖維在成熟過程中Z線斷裂，框架結(jié)構(gòu)被完全破壞。鈣激活酶粗酶液活性在宰后的前2 d顯著下降（P＜0.05），隨后呈緩慢下降趨勢。宰后第0天，5 歲以下不同性別牦牛肉鈣激活酶粗酶液活性沒有顯著差異（P＞0.05），5 歲以上公牦牛的鈣激活酶粗酶液活性均高于母牦牛，且在整個(gè)成熟過程中公牦牛鈣激活酶粗酶液活性均高于母牦牛。肌纖維直徑、MFI、鈣激活酶粗酶液活性均與宰后成熟時(shí)間成極顯著相關(guān)性（P＜0.01），而且三者在宰后成熟過程中也均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性（P＜0.01），說明肌纖維直徑、MFI和鈣激活酶粗酶液活性均可作為重要指標(biāo)反映牦牛肉宰后成熟情況，均可作為評價(jià)牦牛肉嫩度的重要指標(biāo)。牦牛宰后經(jīng)過7 d的成熟，對嫩度的改善有著很大的作用，同時(shí)也可以降低牦牛因屠宰年齡不同而產(chǎn)生的差異；公牦牛相比母牦牛宰后成熟時(shí)間可以適當(dāng)延長，從而提高肉的嫩度。

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Changes of Calpain Activity and Tenderness Indexes during Postmortem of Yak Meat from Different Aged Yaks

YANG Qiaoneng, LIANG Qi*, WEN Pengcheng, ZHANG Yan
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

In this study, the tenderness indexes (muscle fiber diameter (MFI) and myofibril ultrastructure) and calpain activity of the meat of yaks of different ages during postmortem were measured. The results showed that MFI of yak meat at different ages significantly changed (P ＜ 0.05), myofibril ultrastructure was completely disrupted, Z line was ruptured, and calpain activity was significantly decreased (P ＜ 0.05) during aging. In addition, calpain activity of male yak meat was higher than that of female yak meat during aging. The aging time showed a significant correlation with tenderness indexes and calpain activity (P ＜ 0.01). After seven days, the distinction of yak meat at different ages was decreased; meanwhile, the tenderness of meat was improved. The aging time of male yak meat was longer than that of female yak meat.

yak; age; calpain; tenderness

10.7506/spkx1002-6630-201601009

TS251.1

A

1002-6630（2016）01-0045-05

楊巧能, 梁琪, 文鵬程, 等. 不同年齡牦牛宰后鈣激活酶活性及嫩度指標(biāo)變化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 45-49.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601009. http://www.spkx.net.cn

YANG Qiaoneng, LIANG Qi, WEN Pengcheng, et al. Changes of calpain activity and tenderness indexes during postmortem of yak meat from different aged yaks[J]. Food Science, 2016, 37(1): 45-49. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601009. http://www.spkx.net.cn

2015-02-11

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B01）；甘肅省青年基金項(xiàng)目（1308RJYA019）

楊巧能（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail：yangqn1022@163.com

*通信作者：梁琪（1969—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称菲焚|(zhì)、乳品科學(xué)。E-mail：liangqi@gsau.edu.cn