戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化及其抑菌譜

蘇日娜，雙 全*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化及其抑菌譜

蘇日娜，雙 全*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌 物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并其對(duì)敏感菌株的抑菌效果進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件為：接種量2.0%， 培養(yǎng)基初始pH 5.5，32 ℃培養(yǎng)26 h，其抑菌圈平均直徑可達(dá)（3 0.08±0.69） mm，優(yōu)化前其抑菌圈平均直徑為（24.41±0.25）mm，優(yōu)化后抑菌活性提高了0.23倍。菌株S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)所試12 種G＋和G－致病菌的生長(zhǎng)都起到抑制作用，呈現(xiàn)出較廣譜的抑菌特性。因此，菌株S1-4具有可作為食品生物防腐劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

戊糖乳桿菌；抑菌物質(zhì)；發(fā)酵條件優(yōu)化

食品的保鮮防腐在食品工業(yè)中始終是一個(gè)需要解決的重要問(wèn)題[1]。人們使用了很多種保藏食品的方法，其中最常用的一種是添加化學(xué)防腐劑[2]。經(jīng)長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn)一些合成防腐劑有誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等問(wèn)題[3]。所以開(kāi)發(fā)出廣譜、高效、穩(wěn)定、安全的天然食品防腐劑是食品工業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)[4]。

乳酸菌是眾多發(fā)酵食品的生物基礎(chǔ)[5]，它們對(duì)腐敗菌及病原菌的抑制作用可能依靠其代謝產(chǎn)物，比如有機(jī)酸（乳酸和醋酸）、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素[6]。細(xì)菌素（bacteriocin）是細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一種具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，通常是低分子質(zhì)量的多肽或者蛋白類物質(zhì)[7]。尤其是乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素有耐高溫、高效、無(wú)毒、無(wú)殘留、水溶性好、不影響食品風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)，可作為天然綠色防腐劑，在食品保存方面有巨大的應(yīng)用價(jià)值[8]。

乳酸菌細(xì)菌素具有廣譜的抑菌特性，它們不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有抑制作用，而且對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、綠膿假單胞桿菌、福氏志賀氏菌都有不同程度的抑制作用[9]。在我國(guó)，乳酸菌細(xì)菌素的理論和應(yīng)用研究主要針對(duì)Nisin，然而，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Nisin主要是抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，不抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌，因此目前選育出具有廣譜抑菌性的乳酸菌是有非常重要的意義[10]。

乳酸菌代謝產(chǎn)生抑菌物質(zhì)能力的大小，受多種因素影響。除了受菌株自身特性外，還受發(fā)酵條件，比如培養(yǎng)基的初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等因素的影響[11-13]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)前期實(shí)驗(yàn)中篩選到的一株戊糖乳桿菌S1-4的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)分析確定其最佳產(chǎn)抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量和培養(yǎng)基初始pH值，并研究其產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌效果，為后續(xù)的提純與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試菌株：戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）S1-4，分離自內(nèi)蒙古東部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁液。

指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、腸沙門氏菌腸亞種（Salmonella enterica subsp. enterica）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）標(biāo)準(zhǔn)菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

戊糖乳桿菌培養(yǎng)基：脫脂乳培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基；指示菌培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基；抑菌活性的檢測(cè)培養(yǎng)基：水瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。配制方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]。

1.3 儀器與設(shè)備

W-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái) 蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX-500高壓滅菌鍋 德國(guó)Tomy公司；OHAUS EX623電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；PHS-25型數(shù)顯酸度計(jì) 杭州雷磁分析儀器廠；SK-1快速混勻器 常州國(guó)華電器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株S1-4發(fā)酵上清液的制備

將已經(jīng)恢復(fù)活力至正常的菌株S1-4按體積分?jǐn)?shù)2%接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵24 h，離心（6 000 r/min、15 min）取上清，用0.22 μm微孔濾菌器過(guò)濾，去除上清液中的菌體細(xì)胞，得到植物乳桿菌 的無(wú) 細(xì)胞提取液，放置在4 ℃冰箱保藏待用。

1.4.2 抑菌活性的測(cè)定[15]

乳酸菌發(fā)酵上清液的抑菌活性測(cè)定采用雙層瓊脂擴(kuò)散法，先以1%的無(wú)菌瓊脂水溶液在培養(yǎng)皿底層打底，待瓊脂凝固后在上面均勻擺放牛津杯，再倒20 mL帶有指示菌的固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后取牛津杯，在其形成的孔內(nèi)加0.2 mL發(fā)酵上清液，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后測(cè)其抑菌圈直徑。

1.4.3 戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的單因素試驗(yàn)

1.4.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

將菌株S1-4按2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。每隔2 h 取樣（0～60 h），測(cè)定OD600nm、pH值和上清液抑菌活性，各設(shè)3 個(gè)平行。

1.4.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

將復(fù)篩選出的菌株按2%接種于MRS培養(yǎng)基中，分別以30、34、37、40、42 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，并測(cè)定其OD600nm值和抑菌活性，確定最適發(fā)酵溫度。

1.4.3.3 接種量對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

將復(fù)篩選出的菌株分別以1%、1.5%、2%、2.5%、3%的接種量接入MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h、并測(cè)定其OD600nm值和抑菌活性，確定最適的接種量。

1.4.3.4 初始pH值對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

用NaOH、HCl調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基至初始pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0，將復(fù)篩選出的菌株以2%接種量分別接入上述不同初始pH值的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，并測(cè)定其OD600nm值和抑菌活性，確定最適初始pH值范圍。

1.4.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的主要發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、接種量和初始pH值為主要影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而確定最優(yōu)發(fā)酵條件組合。

1.4.5 戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜

選用內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌作為檢測(cè)的指示菌，采用雙層瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定各指示菌的抑菌作用，以確定其抑菌譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化

圖1 菌株S1-4生長(zhǎng)曲線及抑菌活性曲線Fig.1 Growth and antibacterial activity curves of strain S1-4

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響由圖1可知，戊糖乳桿菌S1-4在培養(yǎng)至3、4 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)pH值顯著下降，到16～18 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵22 h后pH值趨于穩(wěn)定，從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程可以看出菌株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，最終pH值為3.8左右。圖上未見(jiàn)明顯的衰亡期。從其抑菌活性看，在8 h左右開(kāi)始產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，且在24 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最大值，抑菌圈直徑可達(dá)（25.37±0.82） mm，抑菌活性達(dá)到最高。通常認(rèn)為菌株的生長(zhǎng)和抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生是有關(guān)聯(lián)的，有的抑菌物質(zhì)在細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)即可產(chǎn)生，而有的抑菌物質(zhì)——植物乳桿菌P158[16]則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期產(chǎn)抑菌物質(zhì)，在生長(zhǎng)到一定時(shí)間后抑菌活性降低，可能是由于細(xì)菌素吸附到產(chǎn)生菌細(xì)胞表面導(dǎo)致發(fā)酵液中細(xì)菌素活性的下降，也可能是細(xì)菌素發(fā)生降解而失活[17]。

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株S1-4抑菌活性的影響Fig.2 Effect of culture tempera ture on antibacterial activity of strain S1-4

由圖2可知，培養(yǎng)溫度在30 ℃時(shí)菌體生長(zhǎng)最好，隨著培養(yǎng)溫度的升高，抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量開(kāi)始下降。這與資料報(bào)道的某些細(xì)菌素在低于最適培養(yǎng)溫度條件下有較高細(xì)菌素產(chǎn)量的結(jié)論不一致，說(shuō)明細(xì)菌素的產(chǎn)生是一種復(fù)雜生理代謝過(guò)程，與多種因素有關(guān)[18]。所以不同溫度對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響也不同。總的來(lái)說(shuō)戊糖乳桿菌S1-4的最適培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.1.3 接種量對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著接種量的改變菌株S1-4的抑菌活性變化很大，菌體密度（OD600nm）變化也大，接種量為2%時(shí)的OD600nm值明顯高于其他接種量，對(duì)指示菌的抑菌效果也最明顯，有利于細(xì)菌的快速生長(zhǎng)和細(xì)菌素的分泌和積累。因此選擇2%接種量作為戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最適接種量。當(dāng)接種量超過(guò)2%時(shí)，菌株S1-4的抑菌活性有所下降，可能是因?yàn)殡S著接種量的增大，培養(yǎng)基內(nèi)乳酸菌之間生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)加劇，培養(yǎng)基性質(zhì)改變，環(huán)境條件惡化，使乳酸菌群體生長(zhǎng)下降，因而抑菌物質(zhì)產(chǎn)量下降[19]。

圖3 不同接種量對(duì)菌株S1-4抑菌活性的影響Fig.3 Effect of inoculum size on antibacterial activity of strain S1-4

2.1.4 初始pH值對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

圖4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株S1-4抑菌活性的影響Fig.4 Effect of initial pH of medium on antibacterial activity of strain S1-4

由圖4可知，pH值在4.0～8.0之間菌株均能產(chǎn)抑菌物質(zhì)，并且在pH值為5.5時(shí)，對(duì)指示菌的抑菌活性最大，產(chǎn)抑菌物質(zhì)最多，其抑菌圈直徑可達(dá)（26.28±0.17） mm左右，同上pH值為5.5時(shí)菌株S1-4達(dá)到了菌體富集的最大值，這也說(shuō)明抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生與細(xì)胞生長(zhǎng)成正相關(guān)[20]。因此選擇pH 5.5作為戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最適培養(yǎng)基初始pH值。

2.2 戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的主要發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)L9（34）對(duì)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量和培養(yǎng)基初始pH值4 個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化，從而確定菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件。

戊糖乳桿菌S1-4的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表1。極差R大小表明各個(gè)因素對(duì)菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響程度，即培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時(shí)間＞接種量＞初始pH值，說(shuō)明培養(yǎng)溫度影響最大，其次是培養(yǎng)時(shí)間、接種量，最后是初始pH值。菌株S1-4的最佳發(fā)酵條件組合是A3B3C2D2，即培養(yǎng)溫度32 ℃、培養(yǎng)時(shí)間26 h、接種量2.0%、初始pH 5.5。在此條件下得到戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌圈直徑為（30.08±0.69） mm，比9 組試驗(yàn)組中抑菌圈直徑最大值（27.81 mm）要大，故經(jīng)驗(yàn)證確定戊糖乳桿菌S1-4的最佳發(fā)酵條件組合是A3B3C2D2。

表1 菌株S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table1 Orthogonal array design with experimental results for optimization of fermentation conditions

2.3 戊糖乳桿菌S1-4的抑菌譜

利用戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)對(duì)選取的12 株具有代表性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌做抑菌實(shí)驗(yàn)。由表2、圖5可知，戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)不僅可以較好地抑制革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等），更重要的是能夠抑制革蘭氏陰性細(xì)菌（大腸桿菌、沙門氏菌、熒光假單胞菌、綠膿假單胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌）。綜合上述結(jié)果可以得出戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有較廣泛的抑菌譜，具有潛在的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景。

表2 菌株S1-4無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌譜Table2 Antimicrobial spectra of strain S1-4

圖5 菌株S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)部分指示菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effects of strain S1-4 against indicator bacteria

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)對(duì)戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件為：接種量2.0%、培養(yǎng)基初始pH 5.5，32 ℃培養(yǎng)26 h，其抑菌圈平均直徑可達(dá)（30.08±0.69）mm，優(yōu)化前其抑菌圈平均直徑為（24.41±0.25）mm，優(yōu)化后抑菌活性提高了0.23倍。

戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌效果較好，能抑制多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的生長(zhǎng)，是一株很有開(kāi)發(fā)潛力并代替化學(xué)防腐劑的菌株。菌株所產(chǎn)細(xì)菌素抑菌譜是反映抑菌范圍和能力大小的重要參數(shù)。于雷雷等[21]報(bào)道的戊糖乳桿菌素pentocin LPEM818對(duì)枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑菌作用，呂燕妮等[22]報(bào)道的戊糖乳桿菌31-1對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌沒(méi)有抑制作用，而戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)上述菌株均有強(qiáng)烈的抑制作用。可見(jiàn)，戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)不僅對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯抑制作用，同時(shí)還對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、熒光假單胞菌、綠膿假單胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌這些革蘭氏陰性菌也表現(xiàn)出抑菌活性。這與部分文獻(xiàn)[23-24]報(bào)道一致。綜合上述結(jié)果可以得出戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有較廣泛的抑菌譜，具有作為食品防腐劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景。

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Optimal Fermentation Conditions for and Antibacterial Spectrum of Antibacterial Substance Produced by Lactobacillus pentosus S1-4

SU Rina, SHUANG Quan*
(College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010000, China)

Using single factor and orthogonal array designs, the optim al fermentation conditions for antibacterial substances produced by Lactobacillus pentosus S1-4 and their antibacterial spectrum were studied. The results showed an inoculum amount of 2.0%, an initial pH of 5.5, and 26 h cultivation at 30 ℃ proved optimal. The average diameter of inhibition zones against Lactobacillus brevis under the optimized culture conditions was (30.08 ± 0.69) mm, and the bacteriostatic activity was increased by 1.23 times over that before optimization. The antibacterial substances produced by Lactobacillus pentosus S1-4 were effective against 12 strains of Gram-positive and Gram-negative bacteria, indicating a wide antibacterial spectrum. In conclusion, S1-4 has potential applications as a bio-preservative to improve the safety of food products.

Lactobacillus pentosus; antibacterial substance; fermentation conditions optimization

10.7506/spkx1002-6630-201603021

TS201.3

A

1002-6630（2016）03-0109-05

蘇日娜, 雙全. 戊糖乳桿菌S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化及其抑菌譜[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 109-113. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603021. http://www.spkx.net.cn

SU Rina, SHUANG Quan. Optimal fermentation conditions for and antibacterial spectrum of antibacterial substance produced by Lactobacillus pentosus S1-4[J]. Food Science, 2016, 37(3): 109-113. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603021. http://www.spkx.net.cn

2015-03-17

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31460443）

蘇日娜（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：surina_nana@128.com

*通信作者：雙全（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：shuangquan@imau.edu.cn