Box-Benhken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取天冬中皂苷的工藝

劉夢迪，梁德勤，金傳山，張　偉，劉成偉，趙園園

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012)

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Box-Benhken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取天冬中皂苷的工藝

劉夢迪，梁德勤，金傳山，張偉，劉成偉，趙園園

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012)

目的優(yōu)化天冬中皂苷的超聲提取工藝，為質(zhì)量檢測提供基礎(chǔ)。方法以紫外可見分光光度法測定天冬中皂苷的含量，并比較菝葜皂苷元與薯蕷皂苷元對照品與天冬樣品的最大吸收波長，采用單因素實(shí)驗(yàn)法及Box-Benhken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)天冬皂苷的超聲提取實(shí)驗(yàn)，并對Box-Benhken響應(yīng)面模型進(jìn)行方差分析。結(jié)果薯蕷皂苷元的最大吸收波長與天冬樣品最大吸收波長相近。響應(yīng)面分析的最佳提取條件為：乙醇濃度為48%，液料比為50 mL/g，超聲時(shí)間為61 min。天冬皂苷的含量預(yù)測值為5.10%，驗(yàn)證試驗(yàn)的天冬皂苷含量的平均值為5.07%。結(jié)論選擇薯蕷皂苷元作為對照品，可以較好地反映天冬皂苷含量水平。響應(yīng)面法建立的天冬皂苷含量模型具有良好的實(shí)際指導(dǎo)意義，可作為進(jìn)一步研究天冬的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

天冬；天冬皂苷；響應(yīng)面；超聲提取

天冬原名天門冬，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為百合科植物天冬Asparaguscochinchinensis(Lour.) Merr.的干燥塊根，具有養(yǎng)陰潤燥、清肺生津的功效[1]。天冬皂苷類成分主要包括以菝葜皂苷元、薯蕷皂苷元、雅姆皂苷元等皂苷元為非糖部分的多種甾體皂苷[2]，是天冬中主要有效成分。藥理研究[3-5]也顯示，天冬中皂苷類成分具有抑菌、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫能力等藥理活性。

目前研究天冬中總皂苷的提取優(yōu)化方式多采用正交實(shí)驗(yàn)法[6]，而Box-Benhken響應(yīng)面法可以較系統(tǒng)地優(yōu)化多個(gè)因素影響的工藝條件[7]。目前尚未見到采用響應(yīng)面法優(yōu)化天冬中總皂苷的超聲提取條件的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究以天冬總皂苷含量為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取天冬中皂苷的條件，以期為天冬相關(guān)加工工藝的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)的選取提供依據(jù)，同時(shí)為天冬的進(jìn)一步研究提供理論指導(dǎo)。

1　材料

SPECORD S600紫外-可見分光光度計(jì)：德國耶拿分析儀器股份公司；Milli-QAdvantage 超純水機(jī)：蘇州賽恩斯儀器有限公司；AS20500BDT 超聲波清洗機(jī)：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；FA-2004型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；CP2225-D型十萬分之一電子天平：Sartorius公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省常州普天儀器制造有限公司；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：河南省鄭州長城科工貿(mào)有限公司；純水自制；95%乙醇、甲醇、正丁醇、冰醋酸等試劑均為分析純。

薯蕷皂苷元(批號 CFN99515)、菝葜皂苷元(批號 CFN99779)：湖北省武漢天植生物技術(shù)有限公司；天冬樣品收自廣西玉林中藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為百合科植物天冬Asparaguscochinchinensis(Lour.) Merr.的干燥塊根。

2　方法

2.1天冬皂苷測定方法的確立

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取薯蕷皂苷元對照品4.16 mg及菝葜皂苷元對照品6.46 mg，分別加甲醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻即得。

2.1.2樣品溶液的制備精密稱取天冬粗粉(過二號篩)1 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密量取50 mL 50%乙醇，搖勻，超聲30 min，過濾，取25 mL續(xù)濾液，水浴蒸干，加水定容至10 mL容量瓶中，用水飽和正丁醇萃取3次，每次約10 mL，合并萃取液，減壓回收至干，殘?jiān)蛹状级ㄈ萦?5 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.1.3波長的選擇精密吸取薯蕷皂苷元對照品溶液及菝葜皂苷元對照品溶液各0.4 mL、供試品溶液0.5 mL置具塞試管內(nèi)，水浴蒸干后，分別加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，混勻密塞，水浴60 ℃顯色15 min，立即冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻。空白對照為甲醇，用上述方式顯色，在400～800 nm波長下進(jìn)行掃描。

2.1.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精密吸取薯蕷皂苷元對照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，置具塞試管中，水浴蒸干后，照“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色，空白對照為甲醇，在456 nm處測吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，薯蕷皂苷元質(zhì)量(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.5精密度試驗(yàn)精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下薯蕷皂苷元對照品溶液6份，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后測定吸光度。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一樣品6份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品，測定吸光度。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一樣品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后，每隔15 min測定吸光度，記錄1 h內(nèi)吸光度值。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的天冬樣品1 g，共6份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品，吸取各樣品溶液1 mL，分別加入一定量的薯蕷皂苷元對照品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后測定吸光度，計(jì)算加樣回收率。

2.2超聲提取天冬皂苷的單因素實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間為3個(gè)因素，分別設(shè)置7個(gè)水平，按照“2.1.2”項(xiàng)下進(jìn)行樣品溶液的制備，固定液料比為50 mL/g、超聲時(shí)間為30 min，考察乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；固定乙醇濃度為50%、超聲時(shí)間為30 min，考察液料比分別為10、20、30、40、50、60、70 mL/g；固定液料比為50 mL/g、乙醇濃度為50%，考察超聲時(shí)間分別為20、30、40、50、60、70、80 min，并選擇其中各因素的3個(gè)水平。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化天冬皂苷的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Design-Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面Box-Benhken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時(shí)間(C)為自變量，天冬皂苷含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)選天冬皂苷的超聲提取條件。具體因素、水平見表1。

表1　超聲提取天冬中天冬皂苷的響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素及水平表

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)稱取天冬粗粉(過二號篩)1 g，按響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝進(jìn)行天冬皂苷的提取測定，平行3次，以驗(yàn)證工藝的可行性及重現(xiàn)性。

3　結(jié)果與分析

3.1天冬皂苷測定方法的確立

3.1.1波長的確定波長掃描結(jié)果顯示菝葜皂苷元的最大吸收波長為535 nm(圖1A)，薯蕷皂苷元的最大吸收波長為456 nm(圖1B)，天冬樣品的最大吸收波長(圖1C)與薯蕷皂苷元相同，故選擇薯蕷皂苷元為對照品，456 nm為檢測波長。

圖1菝葜皂苷元(A)、薯蕷皂苷元(B)和天冬樣品(C)的紫外光譜圖

3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制由薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的回歸方程為：y=3.774x+0.040 27，r2=0.999 8，表明薯蕷皂苷元對照品在0.050～0.133 mg范圍內(nèi)其吸光度與質(zhì)量之間線性關(guān)系良好。

3.1.3精密度試驗(yàn)經(jīng)測定薯蕷皂苷元的RSD值為1.35%，表明紫外-可見分光光度計(jì)的精密度良好。

3.1.4重復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)中樣品含量的RSD值為1.41%，表明天冬皂苷測定方法的重復(fù)性良好。

3.1.5穩(wěn)定性試驗(yàn)經(jīng)測定，樣品含量的RSD值為0.59%，表明樣品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.6加樣回收率試驗(yàn)加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，天冬樣品的平均回收率為99.10%，天冬樣品加樣回收率的RSD為1.99%。

表2　天冬樣品加樣回收率測定結(jié)果

3.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析采用“2.1.2”項(xiàng)下樣品制備方法，固定液料比為50 mL/g，超聲時(shí)間為30 min，考察乙醇濃度為30%～90%，結(jié)果見圖2A。乙醇濃度為40%～60%時(shí)，天冬皂苷含量較高，當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，天冬皂苷含量下降較多。固定乙醇濃度為50%，超聲時(shí)間為30 min，液料比為10～70 mL/g，結(jié)果見圖2B。液料比在30～60 mL/g時(shí)，天冬皂苷含量較高，液料比低于30 mL/g時(shí)，天冬皂苷提取含量低，可能由于溶液中天冬皂苷已達(dá)到飽和，但提取不完全所致。固定液料比為50 mL/g，乙醇濃度為50%，超聲時(shí)間20～80 min，結(jié)果見圖2C。時(shí)間在50～70 min內(nèi)，天冬皂苷含量較高，低于或高于此時(shí)間段，天冬皂苷含量均降低，因此超聲提取時(shí)間應(yīng)選合適范圍。

圖2乙醇濃度(A)、液料比(B)和超聲時(shí)間(C)對天冬皂苷含量的影響

3.3響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析超聲提取天冬皂苷的3因素3水平Box-Benhken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3。其中編號1～12組為析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，編號13～17組為中心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。A、B、C構(gòu)成的三維空間的頂點(diǎn)為析因點(diǎn)，區(qū)域中心點(diǎn)為零點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)共5組，用以估算實(shí)驗(yàn)誤差。最終擬合的天冬皂苷(Y)的二次多項(xiàng)式方程為：Y=5.05-0.69A+0.049B+0.093C+0.050AB-0.15AC+0.96BC-1.87A2-0.60B2-0.64C2。

表3　超聲提取天冬中天冬皂苷的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

模型的各項(xiàng)方差分析結(jié)果及模型的決定系數(shù)可反映其可靠性，結(jié)果見表4。該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，失擬項(xiàng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.110)，另外該模型的校正決定性系數(shù)RAdj2=0.999 3，說明該模型對天冬皂苷超聲提取實(shí)驗(yàn)的擬合程度好，此實(shí)驗(yàn)方案可行。由A、B、C各因素的F值可知，影響天冬皂苷含量的因素從高至低依次是乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(C)、液料比(B)。

由Design-Expert 8.0 軟件對方程模型繪制天冬皂苷含量的三維響應(yīng)面圖(圖3)，固定超聲時(shí)間，天冬皂苷含量的響應(yīng)值隨液料比與乙醇濃度的增加而增大，當(dāng)液料比為45～55 mL/g，乙醇濃度為40%～50%時(shí)，響應(yīng)值最高，但A、B繼續(xù)增高，響應(yīng)值下降；固定液料比，Y隨A、C的增加而增大，當(dāng)A為40%～50%，C為55～65 min時(shí)，響應(yīng)值最高，但A、C繼續(xù)增高，響應(yīng)值下降，這說明天冬皂苷在50%左右的乙醇中溶解較多，超聲時(shí)間過短，則天冬皂苷溶出少，但超聲時(shí)間過長又可能會導(dǎo)致皂苷結(jié)構(gòu)的破壞或使雜質(zhì)溶出增加，從而導(dǎo)致天冬皂苷含量減少。固定乙醇濃度，Y隨B、C的增加而增大，當(dāng)B為46～62 mL/g，C為56～72 min時(shí)，響應(yīng)值最高，說明超聲時(shí)間與液料比在合適范圍內(nèi)才能使天冬皂苷溶出加大。經(jīng)Design-Expert 8.0軟件進(jìn)一步分析，得出超聲提取天冬中總皂苷的最佳提取條件為：乙醇濃度為48%，液料比為50 mL/g，超聲時(shí)間為61 min。在此條件下，提取天冬中天冬皂苷的含量預(yù)測值為5.10%。

3.4驗(yàn)證試驗(yàn)采用“3.3”項(xiàng)下優(yōu)選出的最佳提取條件，采用超聲提取天冬總皂苷，平行3組，所得天冬皂苷平均值為5.07%，與模型預(yù)測值5.10%相近，說明該模型具有良好的重現(xiàn)性。

4　討論

目前對天冬總皂苷的測定多采用5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸顯色，通過紫外-可見分光光度法測定皂苷含量，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]，發(fā)現(xiàn)所用對照品一般為菝葜皂苷元或薯蕷皂苷元，本研究對兩對照品及天冬樣品進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)天冬樣品的最大吸收波長與薯蕷皂苷元最大吸收波長相近，因此選擇薯蕷皂苷元作為天冬總皂苷的對照品，以更好地反映天冬總皂苷的含量水平。

表4　模型各項(xiàng)的方差分析結(jié)果

圖3液料比與乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間與乙醇濃度(B)以及超聲時(shí)間與液料比(C)對天冬皂苷含量的交互作用的響應(yīng)面圖

超聲提取天冬總皂苷的響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)所擬合的二次多項(xiàng)式方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其失擬項(xiàng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且校正決定性系數(shù)R2=0.999 3，反映該方程模型可以較好地預(yù)測天冬皂苷的提取量，具有實(shí)際意義。方程中各項(xiàng)的方差分析均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且從模型中可看出乙醇濃度、液料比及超聲時(shí)間對天冬皂苷含量不是簡單的線性關(guān)系，因此采用Box-Benhken響應(yīng)面模型能更好地預(yù)測天冬皂苷的提取條件。最終優(yōu)化的最佳提取條件為乙醇濃度為48%、液料比為50 mL/g、超聲時(shí)間為61 min，天冬皂苷的含量預(yù)測值為5.10%。經(jīng)驗(yàn)證，此提取條件具有重現(xiàn)性及可行性，可為天冬的后期研究提供理論基礎(chǔ)。

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Saponins fromAsparaguscochinchinensisby Response Surface Methodology with Box-Behnken Design

LIUMeng-di,LIANGDe-qin,JINChuan-shan,ZHANGWei,LIUCheng-wei,ZHAOYuan-yuan

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo optimize the ultrasonic extraction of saponins fromAsparaguscochinchinensis,and to provide a basis for quality evaluation.MethodsThe content of total saponins inAsparaguscochinchinensiswas determined by ultraviolet spectrophotometry,and the maximum absorption wavelengths of sarsasapogenin,diosgenin,andAsparaguscochinchinensiswere compared.The single-factor experiment and response surface methodology with Box-Behnken design were used to design the ultrasonic extraction experiment for saponins fromAsparaguscochinchinensis.An analysis of variance was performed for the model of the response surface methodology with Box-Behnken design.ResultsThe maximum absorption wavelength of diosgenin was similar to that ofAsparaguscochinchinensis.The optimal extraction conditions by the response surface method were as follows:an ethanol concentration of 48%,a liquid-solid ratio of 50 mL/g, and an ultrasonic extraction time of 61 min.The predicted content of saponins inAsparaguscochinchinensiswas 5.10%.The average content of saponins inAsparaguscochinchinensisin verification test was 5.07%.ConclusionDiosgenin is a good

ubstance to reflect the content of saponins inAsparaguscochinchinensis.The saponins content model established by response surface methodology has a good guiding significance and can be used as the foundation of further research onAsparaguscochinchinensis.

Asparaguscochinchinensis; Saponin; Response surface; Ultrasonic extraction

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201507002-2)；安徽高?？蒲袆?chuàng)新平臺團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(皖教秘科〔2015〕49號)

劉夢迪(1992-)，女，碩士研究生

金傳山，jcs4@sohu.com

R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.05.026

2016-05-19；編輯：姚實(shí)林)