四逆散對2型糖尿病大鼠血糖、11βHSD1及GR的影響

梁紹滿 鄧小敏

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【實驗研究】

四逆散對2型糖尿病大鼠血糖、11βHSD1及GR的影響

梁紹滿1鄧小敏2△

目的 觀察研究四逆散對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響及作用機制。方法 利用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病大鼠模型。設(shè)空白對照組、模型組、四逆散高劑量組及四逆散低劑量組，給藥4周后測各組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖 (FPG)、隨機血糖、血清胰島素(FINS) 水平、血漿皮質(zhì)酮含量，并計算胰島素抵抗指數(shù)，采用Western blot法檢測肝臟組織中11β-HSD1、GR蛋白表達。結(jié)果 給藥后，四逆散可以控制糖尿病大鼠體質(zhì)量增長(P<0.05)，具有降低空腹及隨機血糖的作用(P<0.01)，且中藥高劑量組降血糖效果更佳，降低血清胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)水平(P<0.05 或P<0.01)，降低血漿皮質(zhì)酮含量(P<0.05)。模型組肝臟11β-HSD1、GR蛋白表達量上調(diào)，經(jīng)中藥治療后兩種蛋白的表達量均有所下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論 四逆散能夠改善 2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，其作用機制可能與下調(diào)11β-HSD1、GR蛋白的表達有關(guān)。

四逆散；2型糖尿病；從肝論治；11β-HSD1；GR

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種由遺傳因素和多種環(huán)境因素引起以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是一種可伴隨因胰島素分泌絕對不足或相對不足，以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低引起糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)代謝紊亂綜合征，臨床常表現(xiàn)為多飲、多食、多尿，體質(zhì)量下降。目前在我國糖尿病患者中大約90%～95%屬于2型糖尿病(TyPe 2 Diabetes Mellitus，T2DM)，而IR和胰島β細胞分泌功能障礙是T2DM發(fā)生發(fā)展進程中的兩個重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)精神創(chuàng)傷、易激易郁或持久性緊張可誘發(fā)或加重糖尿病，這可能由于各種情志刺激影響大腦皮質(zhì)以及皮質(zhì)下中樞以致影響腦垂體、腎上腺、胰腺等，即通過神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)影響糖脂代謝而發(fā)病[1]。也有研究[2]認為抑郁是糖尿病的最常見的心理障礙之一，給患者帶來沉重的精神壓力。四逆散是中藥復方制劑，我們在臨床主要用于治療2型糖尿病胰島素抵抗并發(fā)情志異常疾病，本研究從糖代謝、糖皮質(zhì)激素方面，采用分子生物學方法探討四逆散治療糖尿病胰島素抵抗的藥效作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠110只，12周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學分子生物學實驗室，實驗室溫度恒定為：(26±2)℃，相對濕度60%～80%。飼養(yǎng)環(huán)境符合醫(yī)學實驗動物環(huán)境設(shè)施要求，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.1.2 飼料 動物飼料購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，分為普通基礎(chǔ)飼料和高糖高脂飼料，高糖高脂飼料由基礎(chǔ)飼料67.7%、豬油10%、蔗糖20%、膽固醇2.0%、膽酸鹽0.3%組成，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院加工為顆粒飼料。

1.1.3 藥物準備 四逆散組成：柴胡、白芍、枳實、甘草，按原方比例1∶1∶1∶1配齊藥物，購于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房。加入5倍蒸餾水浸泡60 min，快速加熱至沸騰，而后保持微沸狀態(tài)15 min，趁熱抽濾；剩余藥渣中加入3倍蒸餾水，浸泡30 min，快速加熱至沸，微沸10 min，趁熱抽濾。合并2次濾液，水浴濃縮至含生藥量1 g·mL-1，分裝滅菌，4℃儲存?zhèn)溆?。灌胃前提前取出藥液，加熱至常溫后使用?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備 所有大鼠均予自由攝食基礎(chǔ)飼料及飲水適應性喂養(yǎng)1周，隨后高糖高脂組換予高糖高脂飼料飼養(yǎng)。采用高糖高脂飼料加小劑量STZ注射造模。高糖高脂組大鼠在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后空腹腹腔注射低劑量STZ(35 mg/kg，Sigma公司)1次，正常對照組腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液(STZ 用PH4.2的 0.1mmol/L 檸檬酸緩沖液配制)。造模時，STZ需要現(xiàn)配現(xiàn)用。剔除血糖值升高不符合要求的動物并選出健康狀態(tài)相對較好的60只大鼠在進行隨機分組治療。糖尿病大鼠成模標準為STZ造模72 h(3天)后剪尾取血測血糖，以隨機血糖≥16.7mmol/L 認為造模成功。

1.2.2 動物分組 按隨機分配原則選取SD大鼠110只，分為空白對照組20只，高糖高脂組90只。將60只高糖高脂組中造模成功的大鼠隨機分為模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，共三組，每組20只。

1.2.3 給藥 造模后空白對照組與模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組繼續(xù)予標準大鼠基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。正常對照組給予生理鹽水灌胃(5ml/kg)，模型組給予生理鹽水灌胃(5ml/kg)，中藥高劑量組給予四逆散煎劑濃縮液灌胃(10 g生藥量/kg)，中藥低劑量組給予四逆散煎劑濃縮液灌胃(5 g生藥量/kg)，各組每日灌胃1次，連續(xù)灌胃4周。

1.2.4 取材 實驗結(jié)束后，大鼠禁食12 h，空腹血糖的檢測采用腹主動脈取血，不抗凝取血清測胰島素(FINS)，抗凝取血漿測皮質(zhì)酮(CORT)，低溫保存，待檢；隨后分離出肝臟組織，取肝右葉下緣2cm×1cm大小組織并分割成數(shù)小塊，用生理鹽水沖洗干凈后，置于濾紙上吸干，放入事先編號的凍存管中，液氮保存，置于-80℃冰柜冰凍保存，以留待制備蛋白標本。

1.2.5 檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)測胰島素(FINS)、皮質(zhì)酮(CORT)，指標檢測嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的計算方法：FPG×FINS/22.5；采用Western Blot法檢測肝臟11β-HSD1、GR蛋白，用Image J軟件對膠片進行掃描，將各組大鼠肝臟蛋白水平以β-actin標準化后進行量化分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較 造模前1周模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組大鼠體質(zhì)量較空白對照組明顯增加，差異具有非常顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示高脂飼料對比普通飼料更能增加大鼠體質(zhì)量。造模第0周(即造模成功伊始)，造模大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量驟降、血糖增高現(xiàn)象，且造模大鼠的進食量、進水量較空白對照組明顯增多，多數(shù)大鼠開始出現(xiàn)多尿的情況，說明成功造成2型糖尿病大鼠模型；但此時造模的三個組之間比較，大鼠體質(zhì)量變化并沒有統(tǒng)計學意義。造模第4周(即給藥治療后第4周)，兩個給藥組體質(zhì)量與模型組比較，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥低劑量組體質(zhì)量與中藥高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示四逆散治療對大鼠體質(zhì)量增長具有抑制作用，不論湯藥劑量的高低均可控制糖尿病大鼠體質(zhì)量增長。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量(g)的變化 (只，

注：與空白對照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.05

2.2 各組大鼠隨機血糖比較 實驗過程中，模型組大鼠與中藥高劑量組、中藥低劑量組血糖均維持在較高水平，明顯高于空白對照組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。造模伊始，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組間血糖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經(jīng)中藥灌胃4周后，模型大鼠的血糖有下降趨勢，與模型組對比，中藥高劑量組、中藥低劑量組血糖下降明顯，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，中藥高劑量組血糖對比其治療前血糖下降明顯(P<0.01)，中藥低劑量組血糖對比其治療前血糖雖然也有下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示四逆散具有降低糖尿病大鼠隨機血糖的作用，且高劑量的四逆散降血糖效果更佳。見表2。

表2 各組大鼠隨機血糖濃度比較(mmol/L) (只，

注：與空白對照組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；同組間，與造模第0周相比，3)P<0.01

2.3 各組大鼠空腹血糖(FBG)及血清胰島素(FINS)水平比較 給藥四周后，檢測各組FBG，與空白對照組相比，造模大鼠(模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組)FBG明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。中藥高劑量組較模型組FBG降低，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，中藥低劑量組對比模型組血糖有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義。提示四逆散高劑量組可以有效降低空腹血糖。給藥四周后檢測各組血清胰島素水平，與空白對照組相比，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組血清胰島素水平升高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。經(jīng)治療后，兩個中藥組FINS均有降低，中藥高劑量組與模型組相比，差異有顯著統(tǒng)計學意義，中藥低劑量組有統(tǒng)計學差異，中藥高劑量組和中藥低劑量組比較無統(tǒng)計學差異，提示四逆散高劑量及四逆散低劑量均可降低2型糖尿病大鼠血清胰島素水平，但二者對血清胰島素的干預作用沒有很大差別。見表3。

表3 各組大鼠空腹血糖及血清胰島素水平變化情況

組別FBG(mmol/L)FINS(mIU/L)空白對照組657±1311462±181模型組2212±0851)2841±4231)中藥高劑量組2013±1381)2)2465±2741)2)中藥低劑量組2189±0941)3)2615±3721)4)

注：與空白對照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.01。與高劑量組比較，3)P<0.01

2.4 各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)變化比較 給藥四周后根據(jù)大鼠空腹血糖及血清胰島素水平計算各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)，與空白對照組相比，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組HOMA-IR明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。藥物治療后，兩個中藥組HOMA-IR較模型組比較均有降低，與模型組相比，中藥高劑量組有顯著統(tǒng)計學差異，中藥低劑量組有統(tǒng)計學差異，中藥高劑量組對比中藥低劑量組HOMA-IR下降具有顯著統(tǒng)計學差異，提示四逆散高劑量及四逆散低劑量均可降低2型糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)水平，且高劑量組干預作用優(yōu)于低劑量組。見表4。

表4 各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)水平變化情況 ±s)

注：與空白對照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.01，3)P<0.05。與高劑量組比較，4)P<0.01

2.5 各組大鼠血漿皮質(zhì)酮比較 隨著實驗的進展，空白對照組大鼠血糖處于正常水平，由于空白對照組未給予任何藥物及飲食干預，其體質(zhì)量持續(xù)增長，重量重于各組大鼠，血糖低于各組大鼠。即使空白對照組此時的體質(zhì)量較重，但其血漿皮質(zhì)酮含量較模型組低，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；并且空白對照組也低于中藥高劑量組與中藥低劑量組的皮質(zhì)酮含量，與中藥高劑量組、中藥低劑量組對比，皮質(zhì)酮含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由于經(jīng)中藥治療后，中藥高劑量組、中藥低劑量組CORT含量對比模型組有下降趨勢，且中藥高劑量組對比模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥低劑量組對比模型組雖然也有下降趨勢，但是差異沒有統(tǒng)計學意義，因此提示四逆散高劑量組較低劑量組降低血漿皮質(zhì)酮含量更為有效。見表5。

表5 各組大鼠血漿皮質(zhì)酮(CORT)含量 (只，

注：與空白對照組比較，1)P<0.01，2)P<0.05，與模型組比較，3)P<0.05

2.6 Western Blot法檢測四逆散對2型糖尿病大鼠肝臟組織蛋白中11β-HSD1表達的影響 11β-HSD1蛋白含量在模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組均明顯升高，與空白對照組相比具有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01)。中藥高劑量組、中藥低劑量組較模型組表達下降，且均與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。提示四逆散高低劑量組均可降低11β-HSD1蛋白在糖尿病大鼠肝臟的表達。見表6，圖1。

表6 各組大鼠11β-HSD1蛋白表達

組別樣本數(shù)平均光密度空白對照組20061±004模型組20125±0061)中藥高劑量組20085±0061)2)中藥低劑量組20100±0051)2)

注：與空白對照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.01

2.7 Western Blot法檢測四逆散對2型糖尿病大鼠肝臟組織蛋白中GR表達的影響 GR蛋白含量在模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組均明顯升高，與空白對照組相比具有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01)。中藥高劑量組、中藥低劑量組較模型組表達下降，且均與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。提示四逆散高低劑量組均可降低GR蛋白在糖尿病大鼠肝臟的表達。見表7，圖2。

表7 各組大鼠GR蛋白表達

組別樣本數(shù)平均光密度空白對照組20182±012模型組20279±0161)中藥高劑量組20263±0171)2)中藥低劑量組20271±021)2)

注：與空白對照組比較，1)P<0.01，與模型組比較，2)P<0.01

圖1

圖2

3 結(jié)論

本實驗證明在2型糖尿病大鼠中11β-HSD1、GR蛋白的含量均明顯增高，在運用四逆散干預治療后，二者均可以表現(xiàn)出目標蛋白的表達量下降，提示二者之間確實具有相互調(diào)節(jié)作用。同時，造模大鼠血漿皮質(zhì)酮(嚙齒類動物血漿中的糖皮質(zhì)激素主要是皮質(zhì)酮)含量也有升高，在中藥治療后可下降。提示三者之間存在緊密的聯(lián)系，通過三者之間相互作用，表達上調(diào)，從而使肝糖產(chǎn)生過多，導致發(fā)生血糖升高、胰島素抵抗。本課題的研究表明，四逆散高劑量組隨機血糖、空腹血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)明顯降低，11β-HSD1、GR蛋白表達量也有下降，與模型組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。四逆散低劑量組在血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)上與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量組在降低皮質(zhì)酮含量方面優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。由此可知，經(jīng)典名方四逆散能有效降低2型糖尿病大鼠血糖水平，其降血糖機理可能與降低肝臟11β-HSD1、GR蛋白表達有關(guān)。該研究結(jié)果可為豐富中醫(yī)藥防治2型糖尿病胰島素抵抗從肝論治理論提供依據(jù)及作用機制指導。

4 討論

4.1 四逆散從肝論治理論基礎(chǔ) 《黃帝內(nèi)經(jīng)》中認為肝的生理功能為“主疏泄”“喜條達而惡抑郁”， 元代朱丹溪曾經(jīng)說過：“氣血沖和，諸疾不生，一有怫郁，百病生焉”，可見他尤為強調(diào)肝的疏泄功能失調(diào)引發(fā)的情志怫郁在疾病發(fā)生的重要地位。明朝戴元禮的《證治要決·傷食門》提到：“人之飲食由脾入胃，過食傷肝”。清代醫(yī)家唐容川《血證論》認為：“木之性主于疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，則水谷乃化?！边@兩條古文則說明了肝與脾胃之間的緊密聯(lián)系，肝臟促進脾胃的運化水谷的功能。肝的情志失調(diào)，氣機不暢，導致氣血運行受阻，郁而化熱，傷津耗液，瘀毒病理產(chǎn)物內(nèi)生，發(fā)為消渴。并且現(xiàn)代健康觀念既包含身體健康，又含精神衛(wèi)生、心理等諸多方面，愈加重視情志方面的治療，因此在認識到肝失疏泄是糖尿病早期的胰島素抵抗發(fā)展變化的基本病理后，現(xiàn)代醫(yī)家常選用疏肝理氣的名方——四逆散來輔助治療2型糖尿病，以達到降低血糖，減少胰島素抵抗，增加胰島素敏感性的目的。

4.2 11HSD1、GR與2型糖尿病胰島素抵抗的相關(guān)性 11β-HSD1是一種微粒體復合酶體，能催化循環(huán)中無活性的糖皮質(zhì)激素與活性的糖皮質(zhì)激素之間進行轉(zhuǎn)化，進行受體前調(diào)解，即糖皮質(zhì)激素(GCs)與糖皮質(zhì)激素受體(GR)的結(jié)合，改變局部激素生物效應[3]。11β-HSD1廣泛分布于肝臟、脂肪組織、腦組織等，有實驗研究顯示11β-HSD1活性在小鼠的肝、脂肪細胞的不正常升高與胰島素抵抗和內(nèi)臟型肥胖的發(fā)生有關(guān)[4]。11β-HSD1可逆地控制糖皮質(zhì)激素的代謝，引起GCs濃度變化，影響胰島素抵抗狀態(tài)及血糖變化。11β-HSD1能增加組織中GCs濃度，影響血糖變化。并且流行病學提示2型糖尿病存在慢性應激，如易激易郁或持久性緊張可以造成局部組織糖皮質(zhì)激素水平增高，擴大激素效應。長期的慢性應激導致某些升糖激素如胰高血糖素、GCs等不恰當?shù)胤置赱5]，導致血糖升高。

GR是一種配體激活型核轉(zhuǎn)錄因子，糖皮質(zhì)激素的效應就是由GR介導的。GCs與肝臟GR結(jié)合后，使糖異生的兩個限速酶表達上調(diào)，加速糖異生的過程，對抗胰島素活性、外周敏感性，從而使肝糖產(chǎn)生過多，血糖升高。

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廣西壯族自治區(qū)教育廳課題(No.YB2014186)

1.廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院碩士研究生2013級(南寧 530023)；2. 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥物臨床試驗辦公室(南寧 530023)

△通訊作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.19.017

1003-8914(2016)-19-2799-05

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2016-05-16)