外周血T細胞亞群及Th17細胞/Treg細胞比值在乙肝病毒感染者診斷中的價值

陜西省榆林市第一醫(yī)院檢驗科(榆林719000)

樊海燕 劉曉鶯▲

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·臨床檢驗·

外周血T細胞亞群及Th17細胞/Treg細胞比值在乙肝病毒感染者診斷中的價值

陜西省榆林市第一醫(yī)院檢驗科(榆林719000)

樊海燕 劉曉鶯▲

目的：探討外周血T細胞亞群及Th17細胞/Treg細胞比值在乙肝病毒感染者診斷中的價值。方法：選取193例乙肝病毒感染者,包括無癥狀HBV攜帶者47例,急性乙肝42例,慢性乙肝63例,原發(fā)性肝癌41例,同期，選取健康者45例作為正常對照組。利用流式細胞儀對外周血T淋巴細胞亞群、Th17細胞和Treg細胞進行檢測。結果：與正常對照組相比,急性乙肝、慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低,而CD8+升高(P<0.05)；與急性乙肝相比,慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高(P<0.05)；與慢性乙肝相比,原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低,而CD8+升高(P<0.05)；與正常對照組相比,慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血Treg細胞、Th17細胞和Th17/Treg比值均升高(P<0.05)；與慢性乙肝相比,原發(fā)性肝癌外周血Treg細胞、Th17細胞和Th17/Treg比值均升高(P<0.05)；Pearson相關分析顯示，不同乙肝感染組患者外周血Treg和Th17細胞呈正相關(r=0.410,P<0.05),不同組患者外周血CD4+/CD8+比值和Th17/Treg比值呈負相關(r=-0.357,P<0.05)。結論：隨著乙肝患者病情進展,外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低,而CD8+升高,且Th17/Treg比值均升高,外周血T細胞亞群及Th17/Treg比值監(jiān)測可為評估乙肝患者病情及預后提供參考。

乙型病毒性肝炎(乙肝)在我國有較高的感染率和發(fā)病率,病程遷延反復,少數(shù)患者進展為肝硬化和肝癌，嚴重危害人類健康[1]。研究表明,乙肝感染后發(fā)病不僅與病毒直接損傷肝細胞有關,而且機體細胞免疫所致的免疫損傷亦是導致肝損傷及病程進展的重要原因[2]。T淋巴細胞作為淋巴細胞的主要組分,在機體免疫網(wǎng)絡及免疫調控中發(fā)揮重要作用,其中,CD3+、CD4+和CD8+是重要的T細胞亞群,在調控機體免疫反應中發(fā)揮重要作用[3]。輔助性T細胞17(Th17)是CD4+T細胞亞群,可大量產(chǎn)生IL-17,加速和促進免疫應答反應,而調節(jié)性T細胞(Treg)則是具有免疫抑制功能的CD4+T細胞亞群,可減輕免疫損傷作用[4]。研究表明[5]，Th17和Treg平衡打破是導致多種免疫性疾病發(fā)病的主要因素。本研究嘗試對乙肝患者外周血T細胞亞群及Th17細胞/Treg細胞比值變化進行分析，探討其在乙肝發(fā)病及病程進展中的意義，以期為乙肝診斷及防治提供參考。

資料與方法

1 一般資料 選取2013年2月至2015年3月在我院門診及住院治療的乙肝病毒感染者193例,所有患者均符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》中的標準[6],其中,無癥狀HBV攜帶者47例,男32例,女15例,平均年齡38.8±8.6歲；急性乙肝42例,男24例,女18例,平均年齡41.6±12.5歲；慢性乙肝63例,男47例,女16例,平均年齡42.9±13.8歲；原發(fā)性肝癌41例,男27例,女14例,平均年齡47.4±15.2歲。同期,從本院體檢中心選取健康者45例作為正常對照組,其中,男24例,女21例,平均年齡42.4±12.9歲；排除傳染性疾病及慢性病者、系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病者,患者乙肝表面抗原(HBsAg)陰性,且抗丙肝陰性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者均行知情同意。

2 主要試劑和儀器 熒光素標記抗人CD3/CD4-APC/CD8-PE單克隆抗體復合試劑購自美國Roche公司，F(xiàn)ITC-抗人CD3抗體、抗人IL-17-PE抗體、PECy7-抗人CD8抗體、抗人CD69抗體、Treg Cocktil、紅細胞裂解液購自美國Beckman公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、莫能霉素、PMA、離子霉素均購自美國Sigma公司，F(xiàn)ACSCalibur 流式細胞儀購自美國BD 公司。

3 方 法 ①外周血T淋巴細胞亞群檢測：所有患者均抽取晨起空腹靜脈血6 ml,置于EDTA-K2抗凝管中。取50 μl外周血，將10 μl熒光素標記抗人CD3/CD4-APC/CD8-PE單克隆抗體復合試劑加入,混勻,于室溫下避光25 min,加入 250μl紅細胞裂解液,混勻,于室溫下避光15 min,加入1 ml PBS液,混勻,于300 g離心力下離心6 min，棄上清，加入1 ml PBS液重懸,再次離心6 min,加入500 μl PBS液重懸,利用流式細胞儀檢測各細胞亞群百分比。②外周血Th17細胞和Treg細胞檢測：取250 μl全血和250 μl RPMI 1640培養(yǎng)混勻,加入PMA 2.5 μl、離子霉素5 μl和莫能霉素0.8 μl，5% CO2條件下于37℃恒溫箱培養(yǎng)6 h,取培養(yǎng)后100 μl全血，加入20 μl FITC-抗人CD3抗體和5 μl PECy7-抗人CD8抗體,室溫下避光孵育25 min,將紅細胞裂解液和破膜劑加入后,室溫破膜,用PBS液洗滌3次,加入抗人IL-17-PE抗體20 μl,避光室溫孵育10 min,PBS液洗滌后上機檢測,設置同型陰性對照,獲得Th17細胞在CD4+細胞中的比例。取100 μl全血,加入20 μl Treg cooktail,避光孵育20 min,加入紅細胞裂解液,用PBS液洗滌3次,上機檢測,設置同型陰性對照,獲得Th17細胞在CD4+細胞中的比例。

4 統(tǒng)計學方法 利用SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，利用Pearson相關分析對變量間相關關系進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同組患者外周血T淋巴細胞亞群變化情況 見表1。與正常對照組相比，HBV攜帶者外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+均無統(tǒng)計學差異，急性乙肝、慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與急性乙肝相比，慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與慢性乙肝相比，原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 不同組患者外周血T淋巴細胞亞群變化(%)

注：與正常對照組相比，aP<0.05；與HBV攜帶者相比，bP<0.05；與急性乙肝相比，cP<0.05；與慢性乙肝相比，dP<0.05

2 不同組患者外周血Th17細胞和Treg細胞變化情況 見表2。正常對照組、HBV攜帶者和急性乙肝外周血Treg細胞、Th17細胞和Th17/Treg差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與正常對照組相比，慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血Treg細胞、Th17細胞和Th17/Treg比值均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與慢性乙肝相比，原發(fā)性肝癌外周血Treg細胞、Th17細胞和Th17/Treg比值均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 不同組患者外周血Th17細胞和Treg細胞變化±s)

注：與正常對照組相比，aP<0.05；與HBV攜帶者相比，bP<0.05；與急性乙肝相比，cP<0.05；與慢性乙肝相比，dP<0.05

3 不同變量間相關性分析 見附圖。Pearson相關分析顯示，不同乙肝感染組患者外周血Treg和Th17細胞呈正相關(r=0.410，P<0.05)，不同組患者外周血CD4+/CD8+比值和Th17/Treg比值呈負相關(r=-0.357，P<0.05)。

討 論

本研究顯示,與正常對照組相比,急性乙肝、慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高，說明在乙肝病程進展中T細胞免疫發(fā)揮重要作用，與乙肝病程轉歸密切相關，隨著乙肝患者病程進展,CD3+和CD4+T細胞比例下降，而CD8+T細胞比例升高，出現(xiàn)CD4+/CD8+比值倒置，提示機體免疫功能被打破，免疫功能異常可能參與了乙肝感染患者病程進展過程[7]。

附圖 不同變量間相關性分析

Th17細胞作為抗感染免疫效應性T細胞，在促進免疫功能、清除病毒感染中發(fā)揮重要作用，并可通過分泌IL-17調控機體炎性反應過程[8]，本研究顯示，與正常對照組相比，慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血Th17細胞比例升高，說明隨著乙肝患者病程慢性化進展，Th17細胞比例出現(xiàn)上升，可能是隨著乙肝病毒大量復制，反應性的出現(xiàn)Th17細胞比例升高，以加強機體免疫作用，同時，可能參與肝細胞炎性反應加重有關，導致肝細胞損傷[9]。Treg作為具有免疫抑制作用的T細胞，可通過調控免疫應答強度而減輕對組織損傷，在自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用，Th17和Treg共同作用在維持機體正常的免疫功能中發(fā)揮重要作用，這種平衡打破可能是炎性疾病和免疫性疾病發(fā)生的重要原因[10]。本研究顯示，與正常對照組相比，慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血Th17細胞比例均升高，與慢性乙肝相比，原發(fā)性肝癌外周血Th17細胞比例均升高，說明在乙肝患者病情進展中，隨著細胞免疫的增強，抑制細胞免疫的作用亦加強,以維持機體免疫平衡,Pearson相關分析顯示,不同乙肝感染組患者外周血Treg和Th17細胞呈正相關(r=0.410，P<0.05),說明隨著病情進展,患者體內大量HBV病毒復制,使效應性Th17細胞比例增高,而為了抑制過度免疫,減少免疫過度對機體組織的損傷,Treg細胞反饋性的升高,同時,轉化生長因子-β(TGF-β)是調控Th17和Treg細胞分化的重要因子,有研究指出[10]，乙肝患者體內TGF-β水平隨病情進展而增加。推測本研究中患者外周血Treg和Th17細胞升高亦可能與TGF-β升高有關。本研究亦顯示，在患者病情進展中，Th17細胞升高幅度較Treg細胞更為明顯，使Th17和Treg平衡被打破，加重肝細胞損傷，從而促進乙肝患者病情進展。Pearson相關分析顯示,不同組患者外周血CD4+/CD8+比值和Th17/Treg比值呈負相關(r=-0.357，P<0.05)，而CD4+/CD8+比值是動態(tài)反映機體免疫平衡的重要指標,提示Th17/Treg比值亦可作為機體免疫平衡的指標,為臨床提供參考。

綜上所述，隨著乙肝患者病情進展，外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低,而CD8+升高,且Th17/Treg比值均升高,免疫細胞構成的免疫平衡被打破,共同參與了乙肝病程進展,外周血T細胞亞群及Th17/Treg比值監(jiān)測可為評估乙肝患者病情及預后、指導患者治療提供參考。

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[10] Joller N, Lozano E, Burkett PR,etal. Treg cells expressing the coinhibitory molecule TIGIT selectively inhibit proinflammatory Th1 and Th17 cell responses[J]. Immunity, 2014, 40(4):569-581.

(收稿：2016-01-22)

▲通訊作者

乙型肝炎 診斷 預后 抗原,分化,T淋巴細胞 CD4+陽性T淋巴細胞 Th17細胞

R512.62

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.051