白血病相關(guān)基因MLAA-34與急性單核細(xì)胞白血病相關(guān)性探討*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科(西安 710004)

張鵬宇 羅 靜 趙 璇△ 張龍進(jìn) 雷 博 蒙 欣 田 瑋 陳銀霞 張王剛

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白血病相關(guān)基因MLAA-34與急性單核細(xì)胞白血病相關(guān)性探討*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科(西安 710004)

張鵬宇 羅 靜 趙 璇△張龍進(jìn) 雷 博 蒙 欣 田 瑋 陳銀霞 張王剛

目的：探討白血病相關(guān)基因MLAA-34表達(dá)與急性單核細(xì)胞白血病(M5)患者疾病特征的關(guān)系,及對(duì)M5患者化療緩解率和總生存期的影響。方法：應(yīng)用 RT-PCR 方法對(duì)58例M5患者、12例正常健康人骨髓細(xì)胞MLAA-34 mRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析MLAA-34與M5患者的相關(guān)性。結(jié)果：M5患者的MLAA-34表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組；MLAA-34高表達(dá)組患者外周血象白細(xì)胞計(jì)數(shù)更高,異常核型的比例明顯升高；M5患者CR后MLAA-34表達(dá)水平較治療前明顯下降；M5復(fù)發(fā)患者,MLAA-34的表達(dá)顯著高于其初發(fā)時(shí)的水平；MLAA-34高表達(dá)組對(duì)化療反應(yīng)性差,CR率低,中位生存時(shí)間短。結(jié)論：MLAA-34是和M5發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的腫瘤相關(guān)基因,其高表達(dá)是M5患者的一個(gè)高危預(yù)后因素。

急性單核細(xì)胞白血病(M5)是急性髓性白血病中較常見(jiàn)的類(lèi)型,病情進(jìn)展快,預(yù)后差。由于目前尚未鑒定出M5相關(guān)的特異性分子標(biāo)志物，對(duì)于大多數(shù)M5患者僅能通過(guò)臨床特征進(jìn)行分層和預(yù)后判斷。為此,我們課題組前期已應(yīng)用Stratagene公司的λZAP定向克隆表達(dá)系統(tǒng)成功地構(gòu)建了具有單核細(xì)胞分化特點(diǎn)的人U937細(xì)胞定向克隆cDNA表達(dá)文庫(kù),并采用M5型白血病患者的混合血清對(duì)所建文庫(kù)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)35條M5抗原新基因(序列全部在GenBank登錄)。應(yīng)用crELISA技術(shù)對(duì)這些抗原新基因進(jìn)行抗體特異性表達(dá)的小樣本(各23例)檢測(cè),鑒定出具有特異性抗體、陽(yáng)性率高的M5抗原新基因MLAA-34[1]；應(yīng)用RACE技術(shù)克隆出其基因的全長(zhǎng)cDNA序列(已在GenBank登錄,序列編號(hào)：AY288977.2)；通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一個(gè)新的剪接變體；應(yīng)用RNAi 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是和M5發(fā)生相關(guān)的新的抗凋亡分子[2]；慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)MLAA-34的U937細(xì)胞可顯著抑制細(xì)胞凋亡,并增加潛在的致瘤性；應(yīng)用免疫共沉淀,鳥(niǎo)槍法測(cè)序和生物信息學(xué)分析示71種蛋白質(zhì)參與了MLAA-34基因可能的信號(hào)通路[3]。前期,我們應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR及Western Blot技術(shù)小樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：MLAA-34基因的mRNA及蛋白水平在M5患者白血病細(xì)胞中特異性高表達(dá)[4]。本研究進(jìn)一步分析MLAA-34基因表達(dá)與M5患者疾病特征的關(guān)系,及對(duì)M5患者化療緩解率和總生存期的影響。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 選取2013年10月至2015年10月我科收治的初診M5患者58例，其中男37例，女21例，年齡18～71 歲，中位年齡44.5歲。所有患者均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的白血病免疫分型、骨髓細(xì)胞的染色體核型分析、白血病常見(jiàn)基因(NPM1、FLT3和C-KIT)的突變檢測(cè)確診?；颊叩墓撬铇?biāo)本采取于初診、誘導(dǎo)化療后及白血病復(fù)發(fā)時(shí)。另取12例健康志愿者骨髓作為對(duì)照組,其中男6例,女6例,中位年齡39.2歲。骨髓及外周血單個(gè)核細(xì)胞收集后-80 ℃留存?zhèn)溆?所有人員均獲知情同意并簽署書(shū)面同意書(shū)。

2 治療方案、療效判定及隨訪 選取的初治M5患者應(yīng)用MA方案或TA方案進(jìn)行誘導(dǎo)緩解化療，MA方案：米托蒽醌 8 mg/m2，d1-3，阿糖胞苷 150 mg/m2，d1-7；TA方案：吡柔比星 50 mg/m2，d1-3，阿糖胞苷 100 mg/m2，d1-7。7 d的誘導(dǎo)化療方案未完成之前，患者如合并感染、嚴(yán)重骨髓抑制而生命體征不穩(wěn)定者可停藥。第一個(gè)化療療程未完成的患者,視為放棄治療；誘導(dǎo)緩解治療完成后觀察療效及緩解率,納入統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。療效判定按照張之南等[5]的血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn),分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)以及未緩解(NR)。白血病復(fù)發(fā)的診斷指標(biāo)：緩解后骨髓白血病細(xì)胞>5%,但<20%,經(jīng)有效的抗白血病治療一個(gè)療程仍未達(dá)CR者；骨髓白血病細(xì)胞>20%；或臨床出現(xiàn)髓外白血病浸潤(rùn)(骨髓及血象仍正常)三項(xiàng)之一。隨訪起自患者初次就診日期至2015年10月10日止。

3 主要試劑及檢測(cè)方法 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海試劑二廠；Trizol 試劑購(gòu)自 Invitrogen 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司；pMD18-T 載體購(gòu)自 Promega Biotech公司；Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。應(yīng)用 RT-PCR 方法對(duì) M5患者及對(duì)照組骨髓的 MLAA-34 mRNA 的表達(dá)水平分別進(jìn)行檢測(cè)。對(duì) AML-M5 患者不同病程階段(初診、完全緩解、部分緩解或未緩解及復(fù)發(fā)) 的 MLAA-34 mRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)并分析。骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離、cDNA 的合成、實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 檢測(cè)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4]。MLAA-34 mRNA的引物序列和Taqman探針序列、內(nèi)參β-actin基因的引物序列、及產(chǎn)物長(zhǎng)度,見(jiàn)表1。引物及探針均 委托中山大學(xué)達(dá)安基因公司合成。

表1 RT-PCR反應(yīng)的引物及探針序列

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件；計(jì)量資料呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)(M)描述，兩樣本中位數(shù)比較采用 Mann-Whitney 檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間的中位數(shù)比較采用 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。率的比較采用 χ2檢驗(yàn)。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 初發(fā)的M5患者與對(duì)照組MLAA-34 mRNA的表達(dá)水平 見(jiàn)表2。Mann-Whitney Test統(tǒng)計(jì)表明，M5患者M(jìn)LAA-34的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)。

表2 初發(fā)M5患者與對(duì)照組MLAA-34 mRNA的表達(dá)水平

2 初發(fā)的M5患者臨床特征與MLAA-34基因表達(dá)的關(guān)系 初發(fā)M5組患者M(jìn)LAA-34表達(dá)的中位值為7.16×102，以中位值為標(biāo)準(zhǔn)將M5患者分為高表達(dá)MLAA-34組和低表達(dá)MLAA-34組，每組29例。應(yīng)用Mann-Whitney Test統(tǒng)計(jì)分析的比較結(jié)果表明：①患者的年齡、性別與MLAA-34基因的表達(dá)無(wú)關(guān),兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②與MLAA-34低表達(dá)組患者相比,高表達(dá)組患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)更高，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；骨髓穿刺檢查原始細(xì)胞比例也高,但兩組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。③兩組的染色體核型分析結(jié)果表明，兩組共有23例患者被檢出異常核型，包括涉及11q23的缺失或易位及+8,9q-等,MLAA-34高表達(dá)組異常核型的檢出率明顯增高,兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 初發(fā)M5患者臨床特征與MLAA-34基因表達(dá)的關(guān)系(n=25)

3 M5患者骨髓緩解狀態(tài)與MLAA-34基因表達(dá)的關(guān)系 為了解M5患者不同病程階段(初診、完全緩解、部分緩解、難治或復(fù)發(fā))其MLAA-34表達(dá)水平的變化，對(duì)30例M5患者進(jìn)行了MLAA-34 mRNA表達(dá)的跟蹤檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：M5完全緩解(CR)的患者M(jìn)LAA-34 mRNA表達(dá)水平較治療前顯著下降(P<0.05)；M5部分緩解及未緩解的患者M(jìn)LAA-34表達(dá)水平與初治組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； M5復(fù)發(fā)患者M(jìn)LAA-34表達(dá)水平顯著高于初治組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 M5患者骨髓緩解狀態(tài)與MLAA-34基因表達(dá)的關(guān)系

4 MLAA-34基因表達(dá)與M5緩解率的關(guān)系 58例初發(fā)急性單核細(xì)胞白血病中，經(jīng)誘導(dǎo)緩解方案化療后，1例患者未完成首次化療即因出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥死亡，2例患者未完成首次誘導(dǎo)緩解放棄治療。在可分析的55例患者中，63.4% (35例)的患者達(dá)到完全緩解。其中MLAA-34低表達(dá)組患者完全緩解率為75%(21/28)，高表達(dá)組患者完全緩解率為51.9% (14/27)，MLAA-34低表達(dá)組患者CR率顯著高于高表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.371,P<0.05 )。

5 MLAA-34基因表達(dá)與M5預(yù)后的關(guān)系 MLAA-34基因低表達(dá)組患者中位生存時(shí)間為18個(gè)月，高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間為10.5月。MLAA-34基因低表達(dá)組總生存率顯著高于高表達(dá)組患者 (76.2% VS 53.2%,P<0.05)。

討 論

白血病的發(fā)生是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，目前具體的過(guò)程及發(fā)病機(jī)制尚不清楚；但研究已經(jīng)證實(shí)，基因突變、染色體易位等基因組的異常在白血病的發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。在急性白血病的發(fā)生中主要有兩類(lèi)基因突變起著重要作用，一類(lèi)是累及酪氨酸激酶的基因突變、重排，使得酪氨酸激酶活性持續(xù)激活，從而導(dǎo)致造血前體細(xì)胞獲得增殖/生存優(yōu)勢(shì)，比如：BCR/ABL、KIT、TEL/PDGFβR、K-RAS N-RAS、及FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)等突變；第二類(lèi)是累及轉(zhuǎn)錄因子的突變，導(dǎo)致機(jī)體造血祖細(xì)胞分化成熟障礙、阻滯其正常的凋亡,比如：AML1/ETO、PML/RARα、NUP98/HOXA9、CBFβ/SMMHC、C/EBPα和AML1基因點(diǎn)突變等。當(dāng)?shù)谝活?lèi)突變單獨(dú)發(fā)生時(shí)會(huì)產(chǎn)生CML樣病變，第二類(lèi)突變單獨(dú)存在是將導(dǎo)致似骨髓增生異常綜合征樣(MDS-like)的臨床表現(xiàn)。只有以上兩類(lèi)突變同時(shí)具備時(shí)方可導(dǎo)致白血病的發(fā)生，這就是目前被大多數(shù)人接受的AML發(fā)生的多次打擊學(xué)說(shuō)[6]。

基于對(duì)白血病的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí),靶向藥物給血液腫瘤的治療帶來(lái)了新的曙光,如針對(duì)BCR/ABL融合基因的靶向藥物伊馬替尼、PML/RARA融合基因的靶向藥物全反式維甲酸和三氧化二砷,完全改變了慢粒及M3的治療模式及預(yù)后[7]。為尋找M5特異性的治療靶點(diǎn),我們課題組通過(guò)構(gòu)建人U937細(xì)胞定向克隆cDNA表達(dá)文庫(kù)，通過(guò)篩選和鑒定發(fā)現(xiàn)了M5抗原新基因MLAA-34；初步研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一個(gè)新的剪接變體；是和急性單核細(xì)胞白血病發(fā)生相關(guān)的新的抗凋亡分子。最近，我們課題組進(jìn)一步研究了其可能的抗凋亡機(jī)制，發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因的高表達(dá)不僅在白血病細(xì)胞株中具有抗凋亡作用，而且在宮頸癌HeLa細(xì)胞中同樣具有抗凋亡作用[8]；并且發(fā)現(xiàn)其抗凋亡作用可能通過(guò)參與了β-Catenin/TCF4途徑[9]。以上基礎(chǔ)研究表明，MLAA-34是一個(gè)候選的白血病靶向基因。

本研究是我們既往工作的深入研究，采用特異的Taq Man探針進(jìn)行定量PCR，統(tǒng)計(jì)分析表明：12例正常對(duì)照組其MLAA-34 mRNA表達(dá)水平極低或檢測(cè)不到；M5患者的MLAA-34表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，結(jié)果與我們前期的小樣本研究結(jié)果相一致[4]。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)：MLAA-34基因高表達(dá)與M5患者診斷時(shí)的不利的臨床特征相關(guān)，與MLAA-34低表達(dá)組M5患者相比較，高表達(dá)組患者初發(fā)時(shí)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)更高，發(fā)現(xiàn)異常核型的幾率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然高表達(dá)組骨髓原始細(xì)胞比例高于低表達(dá)組，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究樣本量較小有關(guān)。進(jìn)一步我們對(duì)30例M5患者的MLAA-34基因的表達(dá)進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)M5患者經(jīng)誘導(dǎo)化療獲得CR后其MLAA-34 mRNA表達(dá)水平較治療前明顯下降；尤其是M5患者復(fù)發(fā)后，MLAA-34的表達(dá)不但升高，而且顯著高于其初發(fā)時(shí)的水平。并且，MLAA-34高表達(dá)組對(duì)化療反應(yīng)性差，CR率低；預(yù)后分析表明，其中位生存時(shí)間明顯縮短。

本研究進(jìn)一步從臨床上證明了MLAA-34是和M5發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的腫瘤相關(guān)基因，其特異性的在M5患者中表達(dá)，其高表達(dá)是M5患者的一個(gè)高危預(yù)后因素，有可能成為M5的治療靶點(diǎn)。但本研究仍然存在一些不足，如所納入的實(shí)驗(yàn)對(duì)象例數(shù)仍然偏少、為單中心研究、隨訪時(shí)間短；后續(xù)的研究需要擴(kuò)大研究樣本，爭(zhēng)取多中心合作，深入作用機(jī)制研究，進(jìn)一步探討MLAA-34基因與急性單核細(xì)胞白血病的相關(guān)性及其作用機(jī)制。

[1] Chen G, Zhang W, Cao X,etal. Serological identification of immunogenic antigens in acute monocytic leukemia[J]. Leuk Res,2005,29(5)：503-509.

[2] Zhang PY, Zhang WG, He AL,etal. Identification and functional characterization of the novel acute monocytic leukemia associated antigen MLAA-34[J].Cancer Immunol Immunother,2009,58(2)：281-290.

[3] Zhang WJ,Zhang WG,Zhang PY,etal. The expression and functional characterization associated with cell apoptosis and proteomic analysis of the novel gene MLAA-34 in U937 cells[J]. Oncology Reports, 2013,29(2)：491-506.

[4] Zhao JQ,He AL,Zhang WG,etal. Quantitative assessment of MLAA-34 expression in diagnosis and prognosis of acute monocytic leukemia[J]. Cancer Immunol Immunother,2011,60(4)：587-597.

[5] 張之南,沈 悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M]. 3 版.北京:科學(xué)出版社，2008：219-228.

[6] Kansal R. Acute myeloid leukemia in the era of precision medicine: recent advances in diagnostic classification and risk stratification[J]. Cancer Biol Med,2016,13(1):41-54.

[7] 唐建瓊,黎艷麗,岳小婭,等. 白血病干細(xì)胞及白血病靶向治療研究進(jìn)展[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 43(6): 758-760.

[8] 張鵬宇,趙 璇,張文娟,等. 白血病相關(guān)基因MLAA-34在HeLa細(xì)胞中的抗凋亡作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2016, 24(2): 363-368.

[9] Qian L, Zhang W, Zhang P,etal. The anti-apoptosis effect of MLAA-34 in leukemia and the β-catenin/T cell factor 4 protein pathway[J]. Am J Transl Res,2015,7(11):2270-2278.

(收稿：2016-07-25)

Correlation between leukemia associated gene MLAA-34 and acute mononuclear cell leukemia

Department of Clinical Hematology, The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University( Xi’an 710004)

Zhang Pengyu Luo Jing Zhao Xuan et al

Objective: To analyze the relationship between the expression of leukemia associated gene MLAA-34 and the disease characteristics of patients with acute leukemia (M5), and to investigate the effect of MLAA-34 expression on the remission rate and overall survival of patients with M5. Methods: RT-PCR method was used to detect the expression levels of mRNA in bone marrow cells of M5 patients and normal healthy people, and the correlation between MLAA-34 and M5 were statistically analyzed. Results: The expression level of MLAA-34 in M5 patients was significantly higher than that in normal control group; the high expression of MLAA-34 in patients with peripheral blood white blood cell count higher, abnormal karyotype increased significantly; the expression level of MLAA-34 in M5 patients after CR was significantly lower than that before treatment; the expression of MLAA-34 was significantly higher in the recurrent patients with M5 than the primary patients; MLAA-34 high expression patients had poor response to chemotherapy, low CR rate, and short median survival time.Conclusion: MLAA-34 is associated with the occurrence and development of M5, and its high expression is a high risk prognostic factors in patients with M5.

Leukemia, monocytic, acute Gene expression regulation, leukemic Prognosis @MLAA-34 gene

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81000219)

△西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部組胚教研室

白血病, 單核細(xì)胞, 急性 基因表達(dá)調(diào)控, 白血病 預(yù)后 @MLAA-34基因

R733.71

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.042