不同佐劑制備的雞坦布蘇病毒滅活疫苗免疫效果比較

劉宇卓，李嘉萍，李 銀，黃欣梅，趙冬敏，韓凱凱，楊 婧，劉青濤，畢可然

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部 動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

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不同佐劑制備的雞坦布蘇病毒滅活疫苗免疫效果比較

劉宇卓，李嘉萍，李 銀，黃欣梅，趙冬敏，韓凱凱，楊 婧，劉青濤，畢可然

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部 動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

以不同材料為佐劑制備坦布蘇病毒滅活疫苗，用ELISA方法檢測(cè)免疫雞不同時(shí)間抗體產(chǎn)生的情況，以選擇最佳制苗佐劑。取40只1月齡SPF雞，隨機(jī)分成8組，以不同的佐劑組合制備疫苗，免疫7個(gè)組(包括白油組、白油+IL-2組、鋁膠組、鋁膠+IL-2組、蜂膠組、蜂膠+IL-2組、IL-2組)，另設(shè)不免疫對(duì)照1個(gè)組，分別于免疫前及免疫后1周、2周、3周和4周采血，用已建立的ELISA方法檢測(cè)血清中的ELISA抗體，比較不同佐劑滅活疫苗的免疫效果。結(jié)果表明：以白油+IL-2作為佐劑組的滅活疫苗效果最好，產(chǎn)生的抗體水平優(yōu)于其他各組，免疫后3周ELISA抗體可達(dá)到1∶800以上，是較理想的制備坦布蘇病毒滅活疫苗的佐劑。

佐劑；坦布蘇病毒；滅活疫苗；免疫效果

2010年4月，我國(guó)多地相繼暴發(fā)了一種由黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)的坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)感染種鴨、種鵝、蛋鴨、蛋鵝的事件，其是以產(chǎn)蛋驟然大幅下降，甚至停產(chǎn)為主要臨床特征，并伴有食欲急劇減退、高熱、運(yùn)動(dòng)障礙，排綠色糞便的急性傳染病[1-4]。肉鴨、肉鵝均可感染，之后陸續(xù)有研究報(bào)道，雞也可感染此病毒而發(fā)病，臨床癥狀及表現(xiàn)與鴨、鵝相似[5-8]。目前學(xué)者在 TMUV 研究領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外研究者針對(duì)病毒分離、鑒定及生物學(xué)特性做了大量研究工作[9-12]。已有研究證明鴨坦布蘇病毒能夠有效誘導(dǎo)抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，也有針對(duì)鴨的疫苗在研發(fā)中，但針對(duì)雞的TMUV滅活疫苗研發(fā)及其佐劑方面的研究較少。

疫苗佐劑是能夠非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原特異性免疫應(yīng)答、發(fā)揮輔助作用的一類物質(zhì)。本研究通過(guò)比較白油、鋁膠、蜂膠、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)作為佐劑單獨(dú)使用及聯(lián)合使用后，對(duì)TMUV滅活疫苗免疫雞后產(chǎn)生抗體的影響，以期能篩選出免疫效果佳、用于雞的坦布蘇病毒滅活疫苗的佐劑。

1　材料與方法

1.1病毒株

坦布蘇JS804株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所禽病實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究室飼養(yǎng)1月齡SPF雞。

1.3主要試劑

白油、鋁膠均由本研究室保存；IL-2由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)組提供；蜂膠購(gòu)自老山藥業(yè)股份有限公司；酶標(biāo)二抗為HRP標(biāo)記的兔抗雞IgY，購(gòu)自美國(guó)EARTH公司；BSA、TMBS均購(gòu)自BIOSHARP公司。雞坦布蘇病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，由本研究室制備并保存。

1.4主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器(SY-450)購(gòu)自徐州圣業(yè)醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；精密電子天平(AA200)購(gòu)自美國(guó)丹佛儀器公司(Denver Instrument)；二級(jí)生物安全柜購(gòu)自西班牙Telsta BioIIA公司；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)購(gòu)自南京優(yōu)普實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)艾本德公司(Eppendorf)；低溫冰箱購(gòu)自海爾公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162A)購(gòu)自上海光都儀器設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀(ELx800)購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司(Biotek)。

1.5抗原制備

取TMUV細(xì)胞毒，向200 mL TMUV細(xì)胞毒中加入0.6 mL的甲醛，充分混勻，37 ℃滅活24 h。

1.6不同佐劑滅活疫苗的制備

1.6.1白油佐劑取47 mL白油與3 mL司本-80混合，高溫滅菌，即為油相；取滅活后的TMUV 25 mL，加入1.5 mL吐溫-80混勻，即為水相；將油相用乳化儀低速攪拌，加入水相，高速攪拌1 min，即制成1號(hào)苗。

1.6.2白油+IL-2佐劑取滅活后的TMUV 5 mL，加入1 mL濃度為4 mg/mL的IL-2、 0.3 mL吐溫-80，混勻，即為水相；將油相用乳化儀低速攪拌，加入水相，攪拌1 min，即制成2號(hào)苗。

1.6.3鋁膠佐劑取7.5 g鋁膠，加入50 mL PBS，充分溶解，用乳化儀低速攪拌，溶解后的鋁膠與滅活后的TMUV以2∶1的體積比混合，攪拌1 min，即制成3號(hào)苗。

1.6.4鋁膠+IL-2佐劑取10 mL溶解后的鋁膠溶液，用乳化儀低速攪拌，加入滅活后的TMUV 5 mL和1 mL IL-2,攪拌1 min，即制成4號(hào)苗。

1.6.5蜂膠佐劑取3 g蜂膠，加入50 mL 95%酒精，37 ℃、溶解24 h，取5 mL溶解后的蜂膠溶液，用乳化儀低速攪拌，加入滅活后的TMUV 5 mL，攪拌1 min，即制成5號(hào)苗。

1.6.6蜂膠+IL-2佐劑取5 mL溶解后的蜂膠溶液，用乳化儀低速攪拌，加入滅活后的TMUV 5 mL和1 mL IL-2，攪拌1 min，即制成6號(hào)苗。

1.6.7IL-2佐劑滅活后的TMUV和IL-2充分混勻, 用乳化儀攪拌1 min，即制成7號(hào)苗。

1.7疫苗的免疫接種

取1月齡SPF雞40羽，隨機(jī)分成8組，每組5只，第1～7組按表1腿部肌肉注射不同佐劑的滅活疫苗，第8組不接種作為空白對(duì)照。

表1　動(dòng)物分組及免疫情況

1.8免疫效果的檢測(cè)

1.8.1采血檢測(cè)分別于免疫前及免疫后1、2、3、4周在雞翅下靜脈采血，37 ℃放置1 h，于4 ℃過(guò)夜后，經(jīng)3000 r/min離心5 min，分離血清，取上清液，置-20 ℃保存。

1.8.2血清抗體的檢測(cè)利用本研究室制備的ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.3判定方法如果 P/N [(樣品孔OD450nm-空白孔OD450nm)/(陰性孔OD450nm-空白孔OD450nm)]≥2.1 ，則判為陽(yáng)性，否則判定為陰性。

2　結(jié)果與分析

2.1免疫前抗體測(cè)定

抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2白油及白油+IL-2佐劑組免疫后不同時(shí)間的抗體

接種白油佐劑滅活疫苗，結(jié)果見表2。免疫后第1周只有20%(1/5)檢測(cè)到抗體，第2周100%抗體效價(jià)可達(dá)1∶100以上，到第4周，抗體效價(jià)在1∶400以上，且最高抗體效價(jià)為1∶800。

表2　白油佐劑組各雞的抗體效價(jià)

同時(shí)免疫了白油+IL-2佐劑組滅活疫苗的抗體結(jié)果見表3。相對(duì)于單獨(dú)免疫白油佐劑組疫苗的抗體，總體水平抗體產(chǎn)生早，且抗體水平均較高，當(dāng)免疫至第4周時(shí)，平均抗體達(dá)到720。

表3　白油+IL-2佐劑組各雞的抗體效價(jià)

2.3鋁膠及鋁膠+IL-2佐劑組免疫后不同時(shí)間的抗體

由測(cè)得抗體可知，兩組免疫效果均不佳，免疫后第3周抗體均值達(dá)到1∶120，且個(gè)別個(gè)體檢測(cè)不到抗體，至第4周平均抗體才達(dá)到250，說(shuō)明抗體上升緩慢。而同時(shí)接種了鋁膠+IL-2的佐劑組，抗體水平明顯高于單獨(dú)接種鋁膠組，至免疫后第4周，平均抗體達(dá)到320。詳細(xì)結(jié)果見表4、表5。

表4　鋁膠佐劑組各雞的抗體效價(jià)

表5　鋁膠+IL-2佐劑組各雞的抗體效價(jià)

2.4蜂膠及蜂膠+IL-2佐劑組免疫后不同時(shí)間的抗體

接種蜂膠滅活疫苗組，免疫后第1周，即有40%的抗體效價(jià)達(dá)到1:100，第2周和第3周抗體水平略有上升，至第4周時(shí)，抗體有升有降，平均抗體與第3周相同。接種蜂膠+IL-2滅活疫苗組，相應(yīng)的抗體水平也均較單獨(dú)免疫蜂膠佐劑的高，結(jié)果見表6、表7。

2.5IL-2佐劑免疫組免疫后不同時(shí)間的抗體

接種IL-2滅活疫苗組，免疫后第1周抗體水平就有明顯升高，第2、第3周，抗體水平持續(xù)升高，第4周時(shí)，抗體水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。結(jié)果見表8。

表6　蜂膠佐劑組各雞的抗體效價(jià)

表7　蜂膠+IL-2佐劑組各雞的抗體效價(jià)

表8　IL-2佐劑組各雞的抗體效價(jià)

2.6免疫后不同佐劑組抗體平均水平比較

不同組別免疫后抗體平均水平見圖1。從圖1中可以看出，白油佐劑組抗體明顯高于鋁膠組及蜂膠組。在每個(gè)小組里，加入IL-2的比同期未加組抗體滴度高。

圖1　不同組別的抗體效價(jià)

3　討論

佐劑是動(dòng)物疫苗中的重要組成部分，是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，能夠提高抗原對(duì)機(jī)體的免疫原性，增強(qiáng)疫苗免疫效果，被廣泛應(yīng)用于疫苗研究與生產(chǎn)。選擇合適的佐劑，對(duì)于提高疫苗免疫效果和減少不良反應(yīng)有著重要的意義。而細(xì)胞因子調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，可作為佐劑增強(qiáng)疫苗免疫的效應(yīng)[13-17]。

白細(xì)胞介素是一種糖蛋白，在機(jī)體的免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中有著重要作用。研究證明：雞IL-2能顯著提高疫苗的免疫應(yīng)答，IL-2作滅活疫苗的免疫增強(qiáng)劑，能使滅活苗的高水平抗體效價(jià)維持時(shí)間較長(zhǎng)，且0.06～0.10 mg的雞IL-2蛋白作為佐劑較合適[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示滅活疫苗中具有IL-2佐劑成分的實(shí)驗(yàn)組抗體水平均高于相同條件實(shí)驗(yàn)組。

白油佐劑乳化后在注射部位的貯庫(kù)效應(yīng)能延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，緩慢釋放抗原，不斷刺激機(jī)體，提高抗原的免疫原性刺激，且在注射部位引起細(xì)胞浸潤(rùn)，促使抗原呈遞細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增殖從而提高免疫應(yīng)答水平。其次乳劑能夠包裹抗原，保護(hù)其不被體液中的酶迅速分解，延長(zhǎng)抗原刺激機(jī)體的時(shí)間；此外油乳佐劑還能刺激各種細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)抗體產(chǎn)生。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，白油佐劑效果最好，配合IL-2使用，免疫效果更佳。

鋁膠佐劑使抗原滯留，緩慢釋放，并可引起局部炎癥反應(yīng)，從而吸引活性淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，還可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，起抗原儲(chǔ)存庫(kù)和傳遞作用。鋁膠佐劑滅活苗以凝膠狀態(tài)注入動(dòng)物體內(nèi)后，不溶性顆粒能吸附、分散抗原物質(zhì)，增加抗原表面積，在組織中形成一個(gè)富含巨噬細(xì)胞的肉芽腫，延緩吸收。鋁膠佐劑存在的主要問(wèn)題是激活Th2型免疫細(xì)胞，只誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，且在注射部位緩慢釋放抗原的效應(yīng)較低，但應(yīng)激較小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，作為坦布蘇病毒滅活疫苗佐劑免疫雞，鋁膠佐劑的免疫效果并不理想，配合IL-2使用雖然能提高免疫后抗體的滴度，但效果也不佳。

蜂膠是工蜂從樹芽、樹皮或其他植物幼芽上采集來(lái)樹脂，并混入它的上顎腺分泌物和蜂蠟等加工而成，是一種粘性、膠狀、含有樹脂的物質(zhì)。其中含樹脂類化合物、多酚類化合物、多糖類化合物，細(xì)菌脂多糖對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫都有輔助作用，可引起動(dòng)物特異性應(yīng)答，還可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表面Ia分子的表達(dá)，從而改變抗原的遞呈。用蜂膠佐劑疫苗免疫動(dòng)物，機(jī)體能更快速、更高效、更持久產(chǎn)生抗體，能全面啟動(dòng)機(jī)體的免疫防衛(wèi)系統(tǒng)，刺激機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫、紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)和巨噬細(xì)胞補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)中蜂膠佐劑疫苗的免疫效果未見特別突出，可能由于蜂膠較難溶解，導(dǎo)致滅活疫苗中蜂膠的含量不夠，影響了免疫效果。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，白油+IL-2作為佐劑制成TMUV滅活疫苗免疫SPF雞效果最好，不但抗體產(chǎn)生快、抗體滴度高，且高滴度抗體持續(xù)時(shí)間也長(zhǎng)，明顯優(yōu)于其他各組，為制備本疫苗的首選佐劑。

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(責(zé)任編輯：許晶晶)

Comparison of Immune Effect of Chicken Tembusu Virus Inactivated Vaccine with Different Adjuvants

LIU Yu-zhuo, LI Jia-ping, LI Yin, HUANG Xin-mei, ZHAO Dong-min,HAN Kai-kai, YANG Jing, LIU Qing-tao, BI Ke-ran

(Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology, Ministry of Agriculture / National Research Center for Engineering and Technology of Veterinary Bio-products, Nanjing 210014, China)

Tembusu virus inactivated vaccines were mixed with different adjuvants (oil, oil+IL-2, alumina gel, alumina gel+IL-2, propolis, propolis+IL-2, and IL-2). Forty 1-month-old SPF chickens were randomly divided into 8 groups, seven groups were immunized with different Tembusu virus inactivated vaccines respectively, and one group was not immunized for blank control. The serum samples of immunized chickens were collected before immunization, as well as 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks after immunization respectively. The antibody levels of various serum samples were detected by using ELISA method, in order to compare the immune effects of Tembusu virus inactivated vaccine with different adjuvants. The results showed that the Tembusu virus inactivated vaccine mixed with oil+IL-2 had the best immune effect, and the ELISA antibody titer could reach 1∶800 3 weeks after immunization. Therefore, oil and IL-2 were the ideal adjuvants for the preparation of Tembusu virus inactivated vaccine.

Adjuvant; Tembusu virus; Inactivated vaccine; Immune effect

2016-05-24

劉宇卓(1967─)，女，黑龍江泰康人，研究員，碩士，主要從事家禽疫病診斷、禽用生物制品研發(fā)。

S852

A

1001-8581(2016)10-0060-04