響應(yīng)面法優(yōu)化商洛核桃青皮多糖提取工藝

何念武，丁淑平，李堆淑，趙艷艷

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

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響應(yīng)面法優(yōu)化商洛核桃青皮多糖提取工藝

何念武，丁淑平，李堆淑，趙艷艷

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

為探究商洛核桃青皮多糖熱水浸提的最佳工藝條件，以多糖提取率為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以液料比、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，采用響應(yīng)面法(RSM)建立數(shù)學(xué)模型，篩選最佳提取工藝。研究結(jié)果表明，商洛核桃青皮多糖最佳提取條件為：液料比30∶1，浸提時(shí)間2.5 h，提取溫度90 ℃，在此條件下多糖提取率可達(dá)到7.01%。各因素對(duì)提取率影響的大小順序?yàn)椋禾崛囟?提取時(shí)間>液料比。此工藝合理可行，可用于商洛核桃青皮多糖的提取。

商洛核桃青皮；多糖；響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化

核桃青皮，又名青龍衣，為胡桃科植物胡桃楸(JuglansmandshuricaM.)和胡桃(JuglansregialL.)的未成熟果實(shí)的綠色外果皮，主產(chǎn)于東北、山東、河北等地[1]，自古以來(lái)一直作為民間常用中藥材，辛、苦、澀、平，有清熱解毒、祛風(fēng)療癬、止痛止痢等廣泛的藥用價(jià)值[2]。研究表明，青龍衣有效成分對(duì)于人類的健康保護(hù)以及抗微生物活性方面有著重要的作用[3-4]。多糖作為核桃青皮主要化學(xué)成分之一，對(duì)其進(jìn)行深入研究具有重要意義。此外，有研究表明多糖都具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗腫瘤等諸多功效[5-6]，這對(duì)深度開(kāi)發(fā)商洛核桃青皮多糖是一個(gè)很好的啟發(fā)。然而，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)核桃青皮的探索主要集中在胡桃醌、多酚類等化學(xué)成分的分離制備以及藥理活性研究等方面[7-10]。

核桃青皮為核桃外部一層厚厚的綠色果皮，核桃果實(shí)采摘后脫掉的青皮堆放在田間地頭或傾倒在河里，不僅會(huì)造成資源的浪費(fèi)，還會(huì)給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重的污染[2,4]。如果對(duì)核桃青皮中的有效物質(zhì)加以提取、分離、綜合利用，既可以保護(hù)環(huán)境，還可以增加果農(nóng)收入[2,4]。為此，本文采用響應(yīng)面法對(duì)商洛核桃青皮多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為下一步商洛核桃青皮多糖活性機(jī)制研究及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用商洛核桃青皮資源奠定基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

商洛核桃青皮，2014年8～9月采自商洛洛南縣寺坡中山，經(jīng)商洛學(xué)院張小斌教授鑒定為胡桃科植物胡桃楸(JuglansmandshuricaM.)的未成熟果實(shí)的外果皮。洗凈，曬干至恒重備用。

1.2商洛核桃青皮多糖的提取與精制

將干燥的核桃青皮粉碎過(guò)100目篩，精密稱取20 g，按一定液料比在熱水中浸提數(shù)小時(shí)。提取結(jié)束后4000 r/min離心10 min，沉淀再加水重復(fù)浸提兩次，而后離心，合并上清液。pH調(diào)為6.0后，加入2%活性炭脫色30 min。在60 ℃條件下減壓濃縮至200 mL左右。加入4倍體積的無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢韬笾糜? ℃冰箱沉淀12 h，然后4000 r/min離心10 min，重復(fù)操作3次，每次均采用離心分離上清液與沉淀。回收上清液中的乙醇，沉淀加水配成一定體積的多糖水溶液，Sevage法除蛋白處理4次。將去蛋白的多糖提取液透析48 h，每8 h換一次水。濃縮透析袋內(nèi)的多糖液至黏稠，以乙酸乙酯、氯仿反復(fù)交叉洗之，最后以氯仿洗之。置鼓風(fēng)干燥箱中干燥(40 ℃)，得精制商洛核桃青皮多糖。以下述公式計(jì)算多糖提取率：

多糖提取率(%)=多糖干品質(zhì)量/商洛核桃青皮粉末質(zhì)量×100%。

1.3多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至50 mL。以上不同質(zhì)量濃度溶液各取1.0 mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻。然后迅速加入濃硫酸3.0 mL，立即搖勻。置于95 ℃水中恒溫加熱30 min，取出冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)吸光度(A)值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得回歸方程為：y=0.0505x+0.0056，R2=0.9988(n=8)。從圖中可以看出，在10～80 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)葡萄糖濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4單因素實(shí)驗(yàn)

用水提醇沉法提取商洛核桃青皮中的水溶性多糖，深入研究液料比、浸提時(shí)間、浸提溫度等因素對(duì)多糖提取率的影響。

液料比：分別稱取60 g的商洛核桃青皮粉末，按液料體積質(zhì)量比5∶ 1、10∶ 1、15∶ 1、20∶ 1、25∶ 1、30∶ 1，加入蒸餾水。80 ℃水浴浸提2.5 h，4000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液。依法提取3次，合并上清液。

時(shí)間：分別稱取60 g商洛核桃青皮粉末, 液料比為30∶ 1，在80 ℃水浴中分別浸提1、2、3、4、5 h, 離心后棄沉淀收集上清液。依法提取3次，合并上清液。

溫度：分別稱取60 g商洛核桃青皮粉末，液料比為30∶ 1，分別置于50、60、70、80、90 ℃恒溫水浴鍋中，浸提2.5 h，離心后棄沉淀收集上清液。依法提取3次，合并上清液。

1.5響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇液料比、浸提時(shí)間、浸提溫度為試驗(yàn)因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以商洛核桃青皮多糖得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.05b實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面分析因素及水平

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1液料比對(duì)商洛核桃青皮多糖提取率的影響從圖2可以看出，液料比從5∶1增加到30∶1時(shí)，多糖提取率顯著增加；液料比增加到20∶1后，多糖提取率增幅放緩。這可能是隨著液料比的不斷擴(kuò)大，核桃青皮中殘留的多糖成分越來(lái)越少的緣故。這與何念武等[11]的研究結(jié)論一致。

圖2　液料比對(duì)商洛核桃青皮多糖提取率的影響

2.1.2浸提時(shí)間對(duì)商洛核桃青皮多糖提取率的影響由圖3可知，提取時(shí)間對(duì)商洛核桃青皮多糖提取率的影響先是快速增長(zhǎng)而后趨于平緩。多糖提取率在3 h后趨于平緩的原因可能是：隨著提取時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，商洛核桃青皮中的多糖成分大部分已經(jīng)被浸提出來(lái)，商洛核桃青皮中固有的多糖成分越來(lái)越少。為減少能耗，節(jié)省時(shí)間，選擇提取時(shí)間為3 h。

圖3　提取時(shí)間對(duì)商洛核桃青皮多糖提取率的影響

2.1.3浸提溫度對(duì)商洛核桃青皮多糖提取率的影響由圖4可知，提取溫度在50～80 ℃之間，多糖的提取率隨著溫度的升高呈快速遞增趨勢(shì)；從80～90 ℃，提取率緩慢降低。這可能是由于溫度過(guò)高，從商洛核桃青皮中提取的多糖有所降解，使提取率下降。因此選擇浸提溫度為80 ℃。

圖4　提取溫度對(duì)商洛核桃青皮多糖提取率的影響

2.2響應(yīng)面分析

2.2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析和顯著性檢驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以A=(Z1-25)/5，B=(Z2-3)/0.5，C=(Z3-80)/10為自變量，以多糖提取率Y為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.05b對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表3，回歸方程為：Y=5.17+0.16A+0.3B+0.83C-0.00375AB-0.15AC+0.34BC+0.22A2-0.23B2+0.38C2。

當(dāng)P值小于0.05時(shí)，即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著。從表3中可以得出，本實(shí)驗(yàn)的模型顯著(P=0.0035)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.3814)，說(shuō)明該模型是合理的。由P值可知，各因素對(duì)提取率影響的大小順序?yàn)椋禾崛囟?提取時(shí)間>液料比，其中，B、C、BC、C2對(duì)Y的影響顯著，A對(duì)Y的影響不顯著。回歸模擬的R2為0.9665，說(shuō)明模型的擬合程度很好，響應(yīng)值的96.65%是由所選變量即液料比、提取時(shí)間、提取溫度引起的，故可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)商洛核桃青皮多糖的提取率。

2.2.2響應(yīng)面分析液料比(A)與提取時(shí)間(B)對(duì)商洛核桃青皮多糖提取率影響的響應(yīng)面曲線結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，液料比與浸提時(shí)間之間的交互作用不顯著，這與方差分析結(jié)論一致。整個(gè)響應(yīng)曲線成凸形，說(shuō)明商洛核桃青皮多糖提取率可達(dá)到最大值。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　商洛核桃青皮多糖提取率的回歸方差分析

圖5　液料比與提取時(shí)間對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面曲線3D圖

由圖6可知，當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，液料比在較大范圍內(nèi)均可以得到較大的響應(yīng)值Y；浸提溫度編碼在0.55～1時(shí)，核桃青皮多糖得率可達(dá)到最大值。這與方差分析結(jié)果相吻合。

圖6　液料比與提取溫度對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面曲線3D圖

由圖7可知，當(dāng)液料比取30∶ 1時(shí)，浸提時(shí)間與浸提溫度之間的交互作用顯著；當(dāng)浸提時(shí)間編碼在0.25～1，浸提溫度編碼在0.8～1時(shí)，多糖得率可達(dá)到最大值。

圖7　提取時(shí)間與提取溫度對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面曲線3D圖

2.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)由響應(yīng)面預(yù)測(cè)模型得出的最優(yōu)工藝條件為：液料比為30∶ 1，提取時(shí)間為2.5 h，提取溫度為80 ℃，預(yù)測(cè)多糖的提取率為6.92%。為了驗(yàn)證由響應(yīng)面預(yù)測(cè)分析的最優(yōu)條件，采用上述條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得多糖提取率平均值為7.01%，與模型預(yù)測(cè)值接近。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化商洛核桃青皮多糖的得率有一定的實(shí)際意義，對(duì)現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。

3　結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化商洛核桃青皮多糖的提取工藝，得出最佳工藝條件：液料比為30∶1，提取時(shí)間為2.5 h，提取溫度為80 ℃。在此條件下，多糖預(yù)測(cè)得率為6.99%，而實(shí)際實(shí)驗(yàn)測(cè)定值為7.01%±0.22%，此條件下實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值非常接近，說(shuō)明該預(yù)測(cè)模型比較可靠，可以為商洛核桃青皮多糖的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。另外，研究發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間與提取溫度的交互項(xiàng)，以及提取溫度的二次項(xiàng)對(duì)多糖提取率的影響顯著，說(shuō)明液料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)商洛核桃青皮多糖提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素對(duì)提取率影響的大小順序?yàn)椋禾崛囟?提取時(shí)間>液料比。

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(責(zé)任編輯：許晶晶)

Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Shangluo Walnut Green Peel by Response Surface Method

HE Nian-wu, DING Shu-ping, LI Dui-shu, ZHAO Yan-yan

(College of Biopharmaceutical and Food Engineering, Shangluo University, Shangluo 726000, China)

In order to explore the optimum process conditions for the hot-water extraction of polysaccharide from Shangluo walnut green peel, the author took polysaccharide extraction rate as response value, took water-material ratio, extraction time and extraction temperature as investigated factors, used response surface method (RSM) to establish a mathematical model based on the results of single-factor experiments, and screened out the best polysaccharide extraction conditions as follows: water-material ratio 30∶1, extraction time 2.5 h, and extraction temperature 90 ℃. Under these conditions, the polysaccharide extraction rate could reach 7.01%. The influence of various factors on polysaccharide extraction rate showed the following order: extraction temperature > extraction time > water-material ratio. This process is reasonable and feasible, and it can be used for the extraction of polysaccharide from Shangluo walnut green peel.

Shangluo walnut green peel; Polysaccharide; Response surface method; Process optimization

2016-05-03

陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目“商洛核桃青皮提取物防治煙草病蟲(chóng)害關(guān)鍵技術(shù)研究” (15JK1219)；商洛市煙草公司橫向科研項(xiàng)目“核桃青皮提取物防治煙草病毒病關(guān)鍵技術(shù)研究”(KJ-2014-02)。

何念武(1985─)，男，陜西商洛人，講師，碩士研究生，主要從事中藥材成分分析及活性研究。

S664.1

A

1001-8581(2016)10-0056-04