正交法優(yōu)選杜仲葉中綠原酸提取工藝

◎張 蕾，張 娜，展雯琳

（陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000）

正交法優(yōu)選杜仲葉中綠原酸提取工藝

◎張 蕾，張 娜，展雯琳

（陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000）

為優(yōu)選杜仲葉中綠原酸的最佳提取工藝，選取乙醇濃度、料液比、超聲波時(shí)間、浸泡時(shí)間等為影響因素，先通過(guò)單因素試驗(yàn)提取綠原酸，然后通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取參數(shù)。結(jié)果最佳提取條件：乙醇濃度40%，料液比1∶35，超聲波時(shí)間30 min，浸泡時(shí)間60 min，此條件下綠原酸的得率為8.041 8 mg/g。結(jié)論杜仲葉中富含綠原酸，優(yōu)化杜仲葉中綠原酸提取工藝，可為綠原酸的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

杜仲葉；綠原酸；提??；工藝

杜仲（Eucommia ulmoides）［1］是中國(guó)名貴滋補(bǔ)藥材，現(xiàn)代藥理研究表明，杜仲葉具有降壓、調(diào)節(jié)血脂、心血管保護(hù)、預(yù)防肥胖、抗炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫、延緩衰老和抗疲勞等作用。臨床上杜仲葉主要應(yīng)用于降壓、治療婦產(chǎn)科疾病等。

綠原酸［2］的又名咖啡鞣酸、咖啡單寧酸，化學(xué)名3-O-咖啡?？崴?，是一種弱極性分子，25 ℃時(shí)在水中的溶解度約為4%，易溶于醇和丙酮，微溶于乙酸乙酯，在熱水中溶解度較大。近年來(lái)，研究證明綠原酸具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、保肝作用、抗內(nèi)毒素等［3］。杜仲葉綠原酸含量豐富，可達(dá)1%～5%［4］，因此優(yōu)化杜仲葉中綠原酸提取工藝，對(duì)生產(chǎn)生活及綠原酸今后衍生產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用都具有重要的意義。本文先通過(guò)單因素試驗(yàn)提取綠原酸，然后通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取參數(shù)，以期為進(jìn)一步擴(kuò)展杜仲葉中綠原酸的研究范疇提供參考性數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：杜仲葉（漢中本地收集）、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇、氫氧化鈣、氫氧化鈉、濃硫酸，試劑均為分析純。

儀器：760CRT雙光束紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司分析儀器總廠；WGLL-230BE電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；植物草本粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，浙江上虞市道墟張興紗篩廠；BSA224S-CW電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；旋片式真空泵，上海滬岡真空泵制造有限公司；KQ3200E型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；LD5-10低速離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用天平準(zhǔn)確稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.001 g，用50%乙醇溶液溶解定容于100 mL的質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。取1 mL于10 mL的容量瓶中，50%乙醇溶液定容至刻度。以50%乙醇溶液為參比，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在250～450 nm處掃描，結(jié)果如圖1所示，得最大吸收波長(zhǎng)為334.9 nm。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收光譜圖

分別準(zhǔn)確量取上述0.01 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL和10 mL于10 mL容量瓶中，50%乙醇溶液定容至刻度，以空白試劑為對(duì)照，在334.9 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以綠原酸質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品曲線圖

得回歸方程：Y=0.012 73X+0.003 5，R2=0.999 5。可見(jiàn)，綠原酸在所測(cè)量的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.2 綠原酸的粗提

將杜仲葉洗凈，攤開(kāi)放入烘箱50 ℃烘干，于粉碎機(jī)中粉碎成粉末并過(guò)80目篩，收集、封存，備用。稱(chēng)取0.5 g粉末在料液比1∶30、乙醇濃度50%、浸提時(shí)間6 min、超聲波時(shí)間30 min下浸提抽濾，即得綠原酸粗提液。

1.2.3 綠原酸的精制

將上步所得綠原酸的粗提液定容至15 mL，取5 mL 加20%石灰乳調(diào)節(jié)pH=12，過(guò)濾，濾渣加2倍體積乙醇混懸，過(guò)濾，濾液加50%硫酸調(diào)節(jié)pH為3～4，過(guò)濾，濾液加20%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=7，過(guò)濾，濾液3 000 r/min離心10 min，定容至15 mL在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。

1.2.4 綠原酸得率計(jì)算方法

式中Y：綠原酸得率mg/g；A：吸光度；N：稀釋倍數(shù)；V：綠原酸濾液體積，mL；m：金銀花原料的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

分別取乙醇濃度為40%、50%、60%、70%和80%，并固定液料比為1∶30，浸泡時(shí)間60 min，超

聲波時(shí)間30 min的條件下對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取率進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取率的影響表

乙醇濃度低時(shí)，杜仲葉難以溶解，綠原酸得率低；濃度增高后，杜仲葉溶解，綠原酸得率增大。但杜仲葉中包括綠原酸在內(nèi)的成分隨乙醇濃度的增大不斷被提取，當(dāng)杜仲葉中綠原酸完全提取后，其他雜質(zhì)也被大量提取，導(dǎo)致綠原酸得率下降。由表1可知，綠原酸奶得率隨乙醇濃度增大先增高后降低，故取乙醇濃度為50%較佳。

2.1.2 料液比的影響

分別取料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35，并固定乙醇濃度為最優(yōu)選50%，浸泡時(shí)間60 min，超聲波時(shí)間30 min的條件下對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取率進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 料液比對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取率的影響表

由表2可知，綠原酸得率隨料液比的增大先快速升高后緩慢升高。杜仲葉中綠原酸隨料液比增大不斷析出，料液比過(guò)小，杜仲葉難以溶解，且綠原酸提出后溶液成為綠原酸飽和溶液，導(dǎo)致杜仲葉中綠原酸無(wú)法繼續(xù)提出；料液比增大綠原酸得率明顯增大，之后料液比再增大時(shí)，由于綠原酸已經(jīng)基本完全提出，得率增大不明顯。從節(jié)約試劑的角度看料液比過(guò)大不經(jīng)濟(jì)。故當(dāng)料液比為1∶30時(shí)較佳。

2.1.3 超聲波時(shí)間的影響

分別取超聲波時(shí)間為0、10、20、30 min和40 min，并固定乙醇濃度為最優(yōu)選50%，料液比為最優(yōu)選1∶30，浸泡時(shí)間60 min的條件下對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取率進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 超聲波時(shí)間對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取率的影響表

通過(guò)超聲波可以快速有效的提取杜仲葉中的綠原酸，但也可以提出其他雜質(zhì)，超聲波時(shí)間增加，雜質(zhì)增多，此外，長(zhǎng)時(shí)間超聲波使溶液受熱也會(huì)導(dǎo)致綠原酸分解，綠原酸得率下降。由表3可知，綠原酸得率隨超聲波時(shí)間的增長(zhǎng)先升高后降低，所以超聲波時(shí)間為20 min較佳。

2.1.4 浸泡時(shí)間的影響

分別取浸泡時(shí)間為0、30、60、90 min和120 min，并固定乙醇濃度為最優(yōu)選50%，料液比為最優(yōu)選1∶30，超聲波時(shí)間為最優(yōu)選20 min的條件下對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取率進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 浸泡時(shí)間對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取率的影響表

不浸泡，杜仲葉和溶劑乙醇接觸時(shí)間過(guò)短，不能將綠原酸全部提出。通過(guò)浸泡杜仲葉粉末綠原酸不斷提出，綠原酸得率增大，但隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，雜質(zhì)變多、綠原酸分解變質(zhì)，不利于綠原酸提取，反而會(huì)導(dǎo)致綠原酸得率大幅下降。由表4可知，綠原酸得率隨浸泡時(shí)間的增長(zhǎng)先升高后降低，所以浸泡時(shí)間為30 min較佳。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響綠原酸提取的因素，乙醇濃度、料液比、超聲波時(shí)間、浸泡時(shí)間，設(shè)計(jì)4因素3水平的L9-3-4正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表5。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

按表5進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表6。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表

由表6可知，影響綠原酸提取的主次因素為乙醇濃度＞超聲波時(shí)間＞料液比＞浸泡時(shí)間。最佳組合是A1B3C3D3，即杜仲葉中綠原酸的最佳提取工藝為乙醇濃度40%，料液比1∶35，超聲波時(shí)間30 min，浸泡時(shí)間60 min，此條件下綠原酸的得率為8.041 8 mg/g。

3 結(jié)論

采用單因素和正交試驗(yàn)來(lái)確定提取綠原酸的最佳工藝條件，得到以下結(jié)果：乙醇濃度40%，料液比1∶35，超聲波時(shí)間30 min，浸泡時(shí)間60 min，選取即組合A1B3C3D3時(shí)綠原酸得率最大，為8.041 8 mg/g。

實(shí)驗(yàn)表明杜仲葉中富含的綠原酸，是提取綠原酸的重要來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)為綠原酸的提取純化工藝的進(jìn)一步研究提供了參考數(shù)據(jù)，可為生產(chǎn)生活及綠原酸今后衍生產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

［1］袁天翊，方蓮花，呂 揚(yáng)，等.杜仲葉的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2013（6）：781-785.

［2］王 茜，李 智，何 琦，等.杜仲葉中綠原酸提取分離工藝條件的研究［J］.離子交換與吸附，2008（1）：73-80.

［3］向燦輝，羅 景，王文君，等.杜仲葉綠原酸抗氧化穩(wěn)定性研究［J］.食品科技，2013（1）：224-227.

［4］袁 華，鄧 良，楊小俊，等.杜仲葉中綠原酸的提取純化研究［J］時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007（2）：446-448.

The Extraction Process of Chlorogenic Acid in Eucommiaulmoides Leaves by Orthogonal Design

Zhang Lei， Zhang Na， Zhan Wenlin
（College of Chemistry and Environmental Science， Shaanxi Sci-Tech University，Hanzhong 723000， China）

To optimize the extraction process of chlorogenic acid in Eucommia leaf （ECA）， choosing ethanol concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic time and soaking time as influencing factors. The extraction process of chlorogenic acid was studied by single factor test and then the parameters were optimized by orthogonal test. As the result，the optimum extraction conditions is Ethanol concentration 40%，solid-liquid ratio 1∶35， ultrasonic time 30 min， soaking time 60 min， the yield of chlorogenic acid under this condition was 8.041 8 mg/g. ECA rich in chlorogenic acid and optimize the extraction process of chlorogenic acid in ECA， which can provide a theoretical basis for the development and application of chlorogenic acid.

Eucommia leaf （ECA）； Chlorogenic acid； Extract； Process

TQ464

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.14.037

張蕾（1995- ），女，陜西西安人，本科在讀；主要研究方向?yàn)榛瘜W(xué)工程與工藝。