滅菌設(shè)備、容器對樣品試劑損失量的影響

◎鄧倩南，劉學(xué)文，林雅慧，陳海寧，余構(gòu)彬，高裕鋒

（廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所），廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，廣東 廣州 510316）

滅菌設(shè)備、容器對樣品試劑損失量的影響

◎鄧倩南，劉學(xué)文，林雅慧，陳海寧，余構(gòu)彬，高裕鋒

（廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所），廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，廣東 廣州 510316）

為考察滅菌設(shè)備和容器對樣品試劑損失量的影響，修正樣品試劑加入量提供依據(jù)，利用三種滅菌設(shè)備在相同的滅菌條件下（121 ℃，15 min）對四種容器盛裝的不同樣品試劑進(jìn)行滅菌實(shí)驗(yàn)，比較試劑損失的差異性。經(jīng)過滅菌實(shí)驗(yàn)，各種樣品試劑的體積都有一定程度的損失，不同品牌的滅菌設(shè)備試劑損失量不同，不同盛裝容器試劑損失量存在差異。微生物檢測前的滅菌實(shí)驗(yàn)應(yīng)該對滅菌設(shè)備和容器對樣品試劑損失量的影響進(jìn)行驗(yàn)證，確保試劑在滅菌完成后達(dá)到最適的體積和濃度。

滅菌設(shè)備；容器；微生物實(shí)驗(yàn)；試劑損失量

滅菌是微生物實(shí)驗(yàn)最基礎(chǔ)、最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，無菌操作貫穿于微生物實(shí)驗(yàn)的始終。在各種滅菌方法中，壓力蒸汽滅菌是使用最廣泛的一種［1，2］。微生物檢測實(shí)驗(yàn)中往往需預(yù)先定量配制好各種試劑（培養(yǎng)基、生理鹽水等），進(jìn)行滅菌操作后再進(jìn)行培養(yǎng)等后續(xù)工作。與滅菌后再進(jìn)行分裝相比，這種滅菌方式可以減輕工作量，同時(shí)避免分裝對溶液造成二次污染［3］。然而在實(shí)際操作中，由于滅菌設(shè)備和容器造成樣品試劑質(zhì)量或體積的變化可能影響后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在菌落總數(shù)檢測中，由稀釋液誤差帶來的不確定度是影響測量結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素之一［4］。以副溶血性弧菌為例，它作為一種嗜鹽性細(xì)菌，對鹽濃度環(huán)境要求嚴(yán)格，3%氯化鈉堿性緩沖蛋白胨水作為測定副溶性弧菌的關(guān)鍵試劑，其濃度的改變直接影響實(shí)驗(yàn)的成功與否［5］。

為考察滅菌設(shè)備和盛裝容器對樣品試劑損失量的影響，實(shí)驗(yàn)選取了常用于食品中菌落總數(shù)檢測的PCA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、磷酸緩沖液和生理鹽水［6］，及用于食品中副溶血性弧菌檢測的3%氯化鈉堿性緩沖蛋白胨水，使用3個(gè)不同品牌的滅菌鍋在4種不同盛裝容器進(jìn)行滅菌實(shí)驗(yàn)。獲取各種實(shí)驗(yàn)條件下試劑損失的情況，為修正樣品試劑加入量提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

PCA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；3%氯化鈉堿性緩沖蛋白胨水、磷酸緩沖液干粉，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；0.85%生理鹽水（自制）；純水（實(shí)驗(yàn)室用水）；枯草芽孢桿菌生物指示劑購自廣州康龍生物有限公司。

1.2 主要儀器

LDZX型立式壓力蒸汽滅菌鍋：Ⅰ號鍋，上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；高壓滅菌鍋GI36DS：Ⅱ號鍋，致微（廈門）儀器有限公司生產(chǎn)；不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器YM50Z：Ⅲ號鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；電子天平：梅特勒；250 mL聚丙烯耐高溫廣口塑料試劑瓶；250 mL錐形瓶；封口膜；耐高壓橡皮筋；15 mm×100 mm普通試管；硅膠塞；試管蓋帽；250 mL量筒；自動分液器。

1.3 方法

PCA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、3%氯化鈉堿性緩沖蛋白胨水、磷酸緩沖液按商品說明書加水溶解配制，將錐形瓶、塑料試劑瓶、蓋帽試管和硅膠塞試管干燥標(biāo)記后稱重并記錄空瓶質(zhì)量，并加入相應(yīng)量的試劑，稱重，記錄為滅菌前質(zhì)量，各容器的試劑添加量見表1。

表1 四種容器的試劑添加量表

平均分成3組，分別置于3種滅菌鍋中，同時(shí)加入枯草芽孢桿菌生物指示劑于121 ℃，15 min高壓滅菌。滅菌完成后干燥，冷卻至室溫后稱重，記錄為滅菌后質(zhì)量。每種高壓鍋重復(fù)10次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取10次平行的算術(shù)平均值。

1.4 損失率的計(jì)算

式中：

N——試劑損失率；m1——空瓶質(zhì)量；m2——滅菌器質(zhì)量；m3——滅菌后質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

經(jīng)滅菌后，生物指示劑中的孢子均被完全殺滅［7］，三種滅菌鍋的滅菌效果均為滿意，滅菌性能正常。用錐形瓶瓶盛裝的PCA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、3%氯化鈉堿性緩沖蛋白胨水、磷酸緩沖液和生理鹽水在三種滅菌鍋中的損失結(jié)果見表2。

表2 錐形瓶中滅菌溶液損失率表（%）

Ⅱ號鍋試劑的損失率明顯要比Ⅰ號鍋和Ⅲ號鍋都小，Ⅰ號鍋和Ⅲ號鍋每一種溶液的損失率都在5%以上；添加了瓊脂的試劑經(jīng)滅菌后比沒有添加瓊脂的試劑損失的成分更少。

用塑料試劑瓶盛裝的滅菌溶液損失率見表3。

表3 塑料試劑瓶中滅菌溶液損失率表（%）

通過對比表2和表3可以看到，在同樣的滅菌環(huán)境中塑料試劑瓶要比錐形瓶更有效地防止試劑的損失，低溶度液體的損失率要比高濃度液體的損失率大。

采用不同的試管塞經(jīng)滅菌后試管內(nèi)試劑的變化情況見表4，使用試管蓋帽的生理鹽水要比使用硅膠塞的生理鹽水損失得少，但是差異不大，損失率都在5%以內(nèi)；兩種加蓋方式的試管都比使用錐形瓶和塑料試劑瓶的損失率要低。

表4 試管中生理鹽水損失率表（%）

在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中，PCA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、磷酸緩沖液和生理鹽水常用于食品中菌落總數(shù)的測定，225 mL磷酸緩沖液、225 mL生理鹽水和9 mL生理鹽水是廣泛使用的樣品稀釋液，這也要求其用量的準(zhǔn)確性，尤其是在對處于臨界值的樣品進(jìn)行菌落總數(shù)的測定時(shí)，如果稀釋液的實(shí)際用量是偏低的話，則會造成結(jié)果偏高，容易誤判。3%氯化鈉堿性緩沖蛋白胨水用于副溶血性弧菌的定性和定量檢驗(yàn)，而副溶血性弧菌是一種對鹽敏感的食源性致病菌，在含鹽量0.5%～8%的環(huán)境中方可生長，在含鹽量2%～4%中生長迅速［8］。按商品說明書進(jìn)行配制的3%氯化鈉堿性緩沖蛋白胨水經(jīng)高壓滅菌后，水分有一定的損失，造成氯化鈉濃度偏高，使得副溶血性弧菌生長變緩慢或不生長，從而影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

試劑經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后都會有一定程度的質(zhì)量損失，每種試劑在不同滅菌鍋中的損失量也不同，同一試劑用不同容器盛裝在同一滅菌鍋中的質(zhì)量損失也不同，因此，在實(shí)驗(yàn)開始前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對這些可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素進(jìn)行評估和驗(yàn)證。對用量要求相對嚴(yán)格的培養(yǎng)基可在滅菌前增加相應(yīng)的量以抵消滅菌過程中的損失，而對濃度要求相對嚴(yán)格的培養(yǎng)基則應(yīng)在配制時(shí)增加相應(yīng)的水分，確保滅菌完成后培養(yǎng)基的濃度在合理范圍內(nèi)。

［1］劉勝國，余裕娟，羅藝輯.培養(yǎng)皿高壓蒸汽滅菌效果不佳的原因探討［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17 （7）：1309-1310.

［2］張潔靜，陳 攀.冷空氣對滅菌器檢測結(jié)果的影響［J］.上海計(jì)量測試，2015，（3）：51-52.

［3］秦霄雯，李鳳霞，胡方崢.大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）質(zhì)量控制程序［J］.醫(yī)療裝備，2015， 28（17）：33-34.

［4］劉 崢.食品中菌落總數(shù)測量的不確定度評定［J］.中國保健營養(yǎng)旬刊，2013（5）：42.

［5］國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會. GB 4789.7-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

［6］國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會. GB 4789.2-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定 ［S］. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［7］肖 璜，郭志龍，夏夢菲，等.自含式壓力蒸汽滅菌生物指示劑孢子計(jì)數(shù)方法的考察［J］.中國藥師，2015，18（7）：1110-1112.

［8］周鵬飛.不同濃度鹽環(huán)境對副溶血性弧菌生長的影響［D］.安徽：安徽科技學(xué)院，2012.

The Influence of Sterilizing Equipments and Containers on the Loss of Reagents

Deng Qiannan， Liu Xuewen， Lin Yahui， Chen Haining， Yu Goubin， Gao Yufeng
（Department of Guangdong Bioengeneering Institute， Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute， Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement and Bio-refinery， China Sugar Inspection Center ， Guangzhou 510316， China）

In order to investigating the in fluence of sterilizing equipment and container on the loss of reagents and correcting the amount of reagents， four different reagents are sterilized using three kinds of equipments in different containers under the same condition （121 ℃ ， 15min）， and the loss of reagents are compared. After the sterilization experiment， all reagents have certain quantity of loss， and the quantities of loss of reagent are different in different sterilization equipments and containers. Before the microbial testing，the effect of sterilization equipment and containers on the loss of sample reagents should be verified to make sure the reagent have optimal volume and concentration after sterilization.

Sterilization equipment； Medium； Microbial test； Uncertainty

TS203

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.14.027

廣東省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2013B040400003）；廣東省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2013B061800023）；廣東省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2013B061800007）； 廣東省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2014B040404054）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2016A040403066）；廣東省科學(xué)院項(xiàng)目（編號：2016GDASPT-010）。

鄧倩南（1989-），男，本科，助理工程師；主要研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。

高裕鋒（1983-），男，博士，高級工程師；主要研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)化。