• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    除草劑篩選小麥轉基因植株的有效濃度研究

    2016-11-09 12:05:28李藝王悅王健趙翔宇王芳別曉敏
    關鍵詞:草銨涂抹除草劑

    李藝,王悅,王健,趙翔宇,王芳,別曉敏

    山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,作物生物學國家重點實驗室,山東泰安271018

    除草劑篩選小麥轉基因植株的有效濃度研究

    李藝,王悅,王健,趙翔宇,王芳,別曉敏*

    山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,作物生物學國家重點實驗室,山東泰安271018

    利用篩選標記基因可方便快捷的區(qū)分轉基因植株和非轉基因植株。篩選標記基因通常用PCR、Southern雜交等分子手段檢測。隨著規(guī)模化轉基因工作的開展,大量轉基因植株需要及時準確的鑒定。葉片涂抹除草劑篩選轉基因植株具有快速、高效的優(yōu)勢。本研究結果顯示,除草劑草銨膦對小麥品種輪選987和科農(nóng)199的有效篩選濃度分別為75 mg·L-1和125 mg·L-1;對以輪選987為受體材料的轉bar基因小麥植株的有效篩選濃度為100 mg·L-1,該濃度可用于針對此類轉基因材料的大規(guī)模篩選。

    小麥;轉基因;除草劑;bar基因;有效濃度

    小麥是世界上重要的糧食作物之一,分布范圍廣,種植面積大,關系到經(jīng)濟和社會穩(wěn)定發(fā)展。因此,培育具有高產(chǎn)、優(yōu)質、抗病、抗逆等優(yōu)良性狀的小麥品種具有重要意義。在基因水平操控和定向改良方面,轉基因技術明顯優(yōu)于傳統(tǒng)育種方式,是改良植物抗病、抗蟲、抗除草劑、抗旱以及其它重要農(nóng)藝性狀的一個有力工具。自1992年Vasil等利用基因槍轉化技術獲得世界上第一例轉基因小麥植株至今[1],小麥遺傳轉化技術經(jīng)過不斷改進已日趨成熟,基因工程育種逐漸成為小麥品種改良的主要補充手段[2-5]。目前,全球轉基因作物面積達到1.7×108hm2[6]。

    篩選標記基因可以為獲得真正的轉化體提供有利的判斷依據(jù),在植物遺傳轉化過程中發(fā)揮著至關重要的作用。篩選標記的選用不僅關系到獲得轉基因植株的效率,也關系到轉基因材料的安全性評價和后續(xù)產(chǎn)業(yè)化進程[7,8]。目前在植物遺傳轉化中廣泛應用的標記基因有抗抗生素基因和抗除草劑基因,均屬于傳統(tǒng)的選擇標記基因,其成熟的技術體系和廣泛的適用性,使得轉化工作能夠更加順利地開展。

    小麥遺傳轉化常用的篩選標記基因主要有bar、nptII、hpt等基因。其中,bar基因編碼的草丁膦乙酰轉移酶PAT蛋白賦予植物細胞對Bialaphos等(活性成分為PPT)除草劑的抗性,nptII或aphA基因編碼的新霉素磷酸轉移酶基因使植物細胞獲得對氨基糖苷類抗生素如卡那霉素(Kanamycin)、G418(Geneticin)、巴龍霉素(Paromomycin)的抗性,hpt基因編碼的潮霉素磷酸轉移酶賦予植物細胞潮霉素(Hygromycin)抗性。

    bar基因是一種抗除草劑基因,是目前使用最多的選擇標記基因之一[9]。它編碼的蛋白能使篩選培養(yǎng)基中的草丁膦自由氨基乙?;荻§D基因植物細胞的毒害作用。此外,草丁膦在土壤中易被土壤微生物快速分解,不會對環(huán)境和人畜造成毒害。該篩選體系快速、簡便、高效,細胞產(chǎn)生的假轉化體少,并且使植物獲得抗除草劑的農(nóng)藝性狀[10,11],在當下轉基因作物的種植面積中占有相當大的比重。

    篩選標記基因在植物遺傳轉化中具有極為重要的作用,使用這類基因可大大減少工作量,能夠方便快捷的區(qū)分轉化細胞和非轉化細胞。關于篩選標記基因的檢測,目前常用PCR[12-14]、Southern雜交[15]等分子手段鑒定。隨著規(guī)?;D基因工作的開展,大量候選轉基因植株需要及時準確的鑒定,因此,需要探明一種快速、高效、準確的檢測方法。本研究擬通過對轉bar基因小麥植株葉片涂抹不同濃度的除草劑,以期獲得能夠有效鑒定轉基因植株的除草劑濃度。

    1 材料與方法

    1.1小麥材料

    本實驗所用的非轉基因小麥材料為小麥國審品種—輪選987和科農(nóng)199;所用的轉基因材料為以輪選987受體的3個轉bar基因小麥株系,編號為B1、B2、B3等3個株系。轉化方法為農(nóng)桿菌介導法。所有實驗材料均于2014年10月份種植于山東農(nóng)業(yè)大學網(wǎng)室。

    1.2實驗方法

    分別配制濃度為50 mg·L-1、75 mg·L-1、100 mg·L-1、125 mg·L-1和150 mg·L-1的草銨膦溶液(美國Sigma公司)并涂抹非轉基因小麥植株;50 mg·L-1、75 mg·L-1、100 mg·L-1、125 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1和250 mg·L-1的草銨膦溶液涂抹轉基因小麥植株。用棉簽蘸取相應濃度的草銨膦溶液涂抹拔節(jié)期的小麥葉片,涂抹位置選擇生長節(jié)位和葉面積基本一致的葉片中部,并保證涂抹面積一致。

    涂抹時間于下午16:00~18:00進行。涂抹72 h后調查葉片表型。

    1.3基因組提取及PCR鑒定

    利用CTAB法提取轉基因小麥T3代植株和非轉基因小麥植株的基因組DNA。根據(jù)bar基因序列設計特異引物。上游引物序列為:CGGTCTGCACCATCGTCAACCACT;下游引物序列為:GAAACCCACGTCATGCCAGTTCCC(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。PCR擴增體系為:1 μL DNA模板(200 ng μL-1),2 μL上游引物(5 μmol μL-1),2 μL下游引物(5 μmol μL-1),10 μL 2×Trans Diect PCR SuperMix(天根生化科技(北京)有限公司),加ddH2O將總體積補充至20 μL。擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃變性50 s,60℃退火50 s,72℃延伸40 s,循環(huán)32次;72℃延伸10 min。PCR擴增時以陽性質粒作為陽性對照、非轉基因小麥植株的基因組DNA為陰性對照。

    2 結果與分析

    2.1不同濃度草銨膦對非轉基因小麥葉片的影響

    在非轉基因小麥葉片上涂抹50 mg·L-1、75 mg·L-1、100 mg·L-1、125 mg·L-1、150 mg·L-15種不同濃度的草銨膦溶液,3 d后觀察并統(tǒng)計實驗結果(表1)。

    由表1和圖1可知,75 mg·L-1草銨膦涂抹輪選987葉片,涂抹部位葉色由綠色變?yōu)辄S色,與未涂抹部位有明顯差異(圖1A),可作為有效篩選濃度;科農(nóng)199在草銨膦濃度為125 mg·L-1時,葉色明顯由綠色變黃色(圖1B)。

    表1 不同濃度草銨膦涂抹非轉基因小麥植株葉片的結果統(tǒng)計Table 1 Statistics of non-transgenic wheat leaves painted different concentrations of herbicide

    圖1 小麥葉片涂抹草銨膦72 h后的表型觀察Fig.1 Phenotype of wheat leaves painted with glufosinate-ammonium for 72 h

    2.2不同濃度草銨膦對轉基因小麥植株的影響

    由于轉基因材料為轉bar基因小麥植株,我們首先對5個T3代轉基因株系進行了PCR鑒定(圖2),發(fā)現(xiàn)bar基因均已整合到小麥基因組中。結合輪選987草銨膦涂抹實驗得出75 mg·L-1為有效篩選濃度,設置了50 mg·L-1、75 mg·L-1、100 mg·L-1、125 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1、250 mg·L-17個濃度梯度。選取株系3、4、5(編號B1,B2,B3)的T4代轉基因植株和非轉基因植株的葉片涂抹不同濃度的草銨膦,觀察表型(圖1C和圖1D),并統(tǒng)計實驗結果(表2)。

    圖2 T3代轉基因小麥株系PCR鑒定Fig.2 PCR detection of T3 transgenic wheat

    表2 不同濃度草銨膦涂抹轉基因小麥植株的統(tǒng)計結果Table 2 Statistics of transgenic wheat plants painted with different concentrations of glufosinate-ammonium

    由表2可知,B1、B2、B3轉基因株系在涂抹草銨膦濃度為100 mg·L-1時,幾乎所有植株均具有除草劑抗性;125 mg·L-1濃度時,抗性苗率不超過10%;高于150 mg·L-1濃度時,幾乎無抗性苗存活。結合輪選987有效篩選濃度為75 mg·L-1,表明在100 mg·L-1濃度時,草銨膦涂抹實驗可以有效區(qū)分小麥植株是否為轉基因植株。

    3 討論

    隨著作物轉基因工作的大規(guī)模開展,轉基因植株的鑒定工作量急劇增大,且時間較為集中。相比于PCR檢測、Sourthern雜交等分子生物學手段,除草劑涂抹實驗具有操作簡單、價格低廉、高效快速等優(yōu)勢。

    輪選987和科農(nóng)199作為兩種不同的非轉基因材料(轉化受體材料),對除草劑的敏感性有差異,我們推測其它的各種小麥受體材料可能對除草劑敏感性亦有差異。在實驗鑒定過程中,如需涂抹除草劑,應先對受體材料進行預實驗,確定最低有效篩選濃度后,再進行轉基因材料的除草劑涂抹試驗及濃度確定。

    本研究中,以輪選987為受體的多個株系的有效篩選濃度基本一致,均為草銨膦100 mg·L-1,這一濃度低于李欣等[16]在葉片涂抹200 mg·L-1Liberty的濃度,推測可能與實驗所用除草劑有效濃度及處理時的天氣條件等有關。同時,本研究所用小麥轉基因株系為農(nóng)桿菌侵染法所得,該轉化方法獲得的轉基因植株中bar基因多為單拷貝插入,故對除草劑敏感性基本一致。對于基因槍轟擊法獲得的小麥轉基因植株,可能會由于bar基因在不同轉化事件中拷貝數(shù)的差異,導致植物體內草丁膦乙酰轉移酶PAT蛋白的表達量不一致,對除草劑抗性會在有效濃度基礎上有所提高。

    4 結論

    本研究通過對小麥轉化的受體材料——輪選987和科農(nóng)199,即非轉基因小麥植株的葉片涂抹不同濃度的除草劑溶液(草銨膦),確定75 mg·L-1可有效篩選輪選987,125 mg·L-1有效篩選科農(nóng)199。對于轉bar基因小麥植株(輪選987為受體材料),結果表明100 mg·L-1濃度為有效篩選濃度。研究結果對以輪選987為受體的小麥轉基因植株的快速篩選具有一定的參考價值。

    [1]Vasil V,Castillo A,F(xiàn)romm ME,et al.Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus[J].Nat Bio/Technol,1992,10(6):667-674

    [2]別曉敏,佘茂云,杜麗璞,等.植物多基因轉化研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報,2010,4:18-23

    [3]萬建民.我國轉基因植物研發(fā)形勢及發(fā)展戰(zhàn)略[J].生命科學,2011,2(23):157-167

    [4]葉興國,陳明,杜麗璞,等.小麥轉基因方法及其評述[J].遺傳,2011,33(5):422-430

    [5]陽力.轉基因農(nóng)作物的研究進展[J].生物技術世界,2012,5:31-32,35

    [6]James C.Global status of commercialized biotech/GM crops[M].Ithaca,New York,USA:ISAAA,2013:46

    [7]郭倩倩,孫熙森,唐益雄,等.新型篩選標記磷酸甘露糖異構酶基因在轉基因植物中的應用[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報,2011,13(6):12-19

    [8]周巖,游建.植物基因工程——標記基因的安全利用[J].生物技術通報,2012(7):7-13

    [9]唐安軍,龍春林,刀志靈.種子休眠機理研究概述[J].云南植物研究,2004,26(3):241-251

    [10]王相春,程在全,曾千春,等.植物篩選標記基因應用進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(22):13290-13291,13365

    [11]劉洪艷,弭曉菊,崔繼哲.bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性與安全性[J].生態(tài)學雜志,2007,26(6):938-942

    [12]段武德.轉基因植物檢測[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2009

    [13]郭斌,祁洋,尉亞輝.轉基因植物檢測技術的研究進展[J].中國生物工程雜志,2010,30(2):120-126

    [14]李亞南,高儼,張艷,等.轉基因植物核酸檢測策略與體外擴增技術研究進展[J].生物技術通報,2012(10):52-62

    [15]劉祿,牛焱焱,雷昊,等.基于地高辛標記對小麥進行Southern雜交分析主要影響因素的優(yōu)化和驗證[J].植物遺傳資源學報,2012,13(2):182-188

    [16]李欣,杜麗璞,殷桂香,等.轉bar基因小麥和非轉基因小麥抗除草劑鑒定方法比較[J].植物遺傳資源學報,2012(13):596-600

    Study on the Effective Concentration of Herbicide Screening for Transgenic Wheat

    LI Yi,WANG Yue,WANG Jian,ZHAO Xiang-yu,WANG Fang,BIE Xiao-min*
    College of Life Sciences,State Key Laboratory of Crop Biology/Shandong Agricultural University,Tai'an 271018,China

    The selection marker gene was widely used to detect and identify transgenic plants in biotechnological breeding of crops.For detection of selection marker genes,the molecular techniques such as Polymerase-Chain-Reaction(PCR)and Southern blot were generally applied.However,with the rapid progress of genetic transformation of crop species,a large number of transgenic plants need to be identified timely and usually,bar was designed as the marker gene.The method painting herbicide(glufosinate-ammonium)on leaf has the advantage of quickness and effectiveness for verifying transformation.The results showed that in wheat varieties Lunxuan 987 and Kenong199,the effective selection concentrations of herbicide were 75 mg·L-1and 125 mg·L-1,respectively.Further,the effective selection concentrations of herbicide were 100 mg·L-1for detecting the activity of bar protein when Lunxuan 987 was transformed as the donor plant,suggesting this concentration of glufosinate-ammonium might be suitable for large scale detection.

    wheat;transgenosis;Herbicide;bar gene;effective concentration

    Q786

    A

    1000-2324(2016)05-0664-04

    2015-10-14

    2015-11-16

    泰安市大學生科技創(chuàng)新行動計劃項目(2014D027)

    李藝(1991-),女,本科生.E-mail:18706380053@163.com

    Author for correspondence.E-mail:biexm@sdau.edu.cn

    猜你喜歡
    草銨涂抹除草劑
    草銨膦價格創(chuàng)新高短期價格仍將上行
    草銨膦價格創(chuàng)新高 短期價格仍將上行
    封閉式除草劑什么時間噴最合適
    涂抹
    延河(2018年6期)2018-06-11 07:34:16
    草銨膦水劑對柑桔園雜草的防效試驗初報
    如何正確選擇使用農(nóng)藥及除草劑
    雞蛋清巧貼吸盤掛鉤
    女士(2017年10期)2017-11-01 08:16:12
    巧貼吸盤掛鉤
    伴侶(2017年6期)2017-06-07 08:29:23
    急性草甘膦與草銨膦中毒23例臨床分析
    玉米田除草劑的那些事
    營銷界(2015年23期)2015-02-28 22:06:18
    动漫黄色视频在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产野战对白在线观看| 1000部很黄的大片| 看片在线看免费视频| 亚洲午夜理论影院| 免费看日本二区| 亚洲不卡免费看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 熟女电影av网| 国产视频一区二区在线看| 在线观看66精品国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 88av欧美| 久久亚洲真实| 久久久国产成人精品二区| 久久久精品大字幕| 国产精品电影一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 香蕉av资源在线| 国产精品三级大全| 日韩亚洲欧美综合| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 99久久九九国产精品国产免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美黑人欧美精品刺激| 在线观看午夜福利视频| 中出人妻视频一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩欧美 国产精品| av中文乱码字幕在线| 免费av毛片视频| 亚洲最大成人av| 毛片女人毛片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 免费看光身美女| 亚洲 国产 在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产亚洲精品久久久com| 欧美中文日本在线观看视频| 一本综合久久免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 露出奶头的视频| 成人无遮挡网站| 国产精品久久久久久久久免 | 波多野结衣高清无吗| 亚洲美女黄片视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 两个人视频免费观看高清| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 看黄色毛片网站| av天堂中文字幕网| 久久久成人免费电影| 亚洲精品色激情综合| 床上黄色一级片| 午夜福利在线观看吧| 性欧美人与动物交配| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 少妇的逼水好多| h日本视频在线播放| av中文乱码字幕在线| 有码 亚洲区| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲五月婷婷丁香| 桃色一区二区三区在线观看| 天堂影院成人在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品国产高清国产av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 床上黄色一级片| 青草久久国产| 国产人妻一区二区三区在| 91麻豆av在线| 内射极品少妇av片p| 中文字幕av成人在线电影| 嫩草影视91久久| 亚洲,欧美精品.| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美色视频一区免费| 亚洲天堂国产精品一区在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美日韩乱码在线| 极品教师在线视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 精品一区二区免费观看| 色播亚洲综合网| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 99热这里只有精品一区| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲国产精品sss在线观看| av在线天堂中文字幕| 亚洲人成电影免费在线| 日韩大尺度精品在线看网址| 一进一出抽搐gif免费好疼| 一二三四社区在线视频社区8| 日日干狠狠操夜夜爽| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 在线免费观看的www视频| 精品久久久久久久末码| 国产单亲对白刺激| 国产精品国产高清国产av| 亚洲片人在线观看| 欧美黑人巨大hd| 亚洲不卡免费看| 国产黄片美女视频| 国产91精品成人一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 全区人妻精品视频| 亚洲无线在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 热99re8久久精品国产| 久久久久久久久久成人| 一区福利在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲中文字幕日韩| 国产黄a三级三级三级人| 免费在线观看亚洲国产| h日本视频在线播放| 亚洲av美国av| 久久久久性生活片| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美日韩乱码在线| 色尼玛亚洲综合影院| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产精品三级大全| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 黄片小视频在线播放| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久久久久久中文| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 看免费av毛片| av在线观看视频网站免费| 两个人视频免费观看高清| 成人鲁丝片一二三区免费| 网址你懂的国产日韩在线| 香蕉av资源在线| 高清毛片免费观看视频网站| 可以在线观看毛片的网站| 热99re8久久精品国产| 日韩有码中文字幕| 欧美日本视频| 国产免费av片在线观看野外av| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品精品国产色婷婷| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜久久久久精精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| www.色视频.com| 狠狠狠狠99中文字幕| 国模一区二区三区四区视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久久久久大av| 岛国在线免费视频观看| 99热这里只有是精品在线观看 | 久久国产精品影院| 日本黄大片高清| 一进一出好大好爽视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| 91av网一区二区| 最近最新免费中文字幕在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲真实伦在线观看| 深夜精品福利| 美女 人体艺术 gogo| 欧美一级a爱片免费观看看| 一级黄色大片毛片| 国产91精品成人一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲,欧美,日韩| av在线观看视频网站免费| 欧美一区二区国产精品久久精品| 三级毛片av免费| 亚洲人成网站高清观看| 欧美三级亚洲精品| 欧美成人性av电影在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲成av人片在线播放无| 国产高潮美女av| 成人三级黄色视频| 国产亚洲精品久久久com| 老女人水多毛片| 国产老妇女一区| 热99在线观看视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 人人妻人人看人人澡| 日韩免费av在线播放| 欧美精品国产亚洲| 精品人妻熟女av久视频| 在线播放无遮挡| 国产免费av片在线观看野外av| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲国产精品成人综合色| 特大巨黑吊av在线直播| 色5月婷婷丁香| 亚洲激情在线av| 国产中年淑女户外野战色| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 热99re8久久精品国产| 看片在线看免费视频| 不卡一级毛片| 久久久久久久精品吃奶| 久久伊人香网站| 激情在线观看视频在线高清| 在线观看一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲av成人精品一区久久| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲熟妇熟女久久| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 免费在线观看日本一区| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 高清日韩中文字幕在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 综合色av麻豆| 国产亚洲欧美98| 成年女人看的毛片在线观看| 黄片小视频在线播放| 国产人妻一区二区三区在| 在线国产一区二区在线| 美女大奶头视频| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 深爱激情五月婷婷| 亚洲人成网站在线播| 伊人久久精品亚洲午夜| 少妇被粗大猛烈的视频| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美国产日韩亚洲一区| 99视频精品全部免费 在线| 极品教师在线免费播放| 欧美3d第一页| 欧美激情久久久久久爽电影| 搡老岳熟女国产| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 禁无遮挡网站| 天堂影院成人在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 99riav亚洲国产免费| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 真实男女啪啪啪动态图| 男女下面进入的视频免费午夜| 熟女人妻精品中文字幕| 国产免费一级a男人的天堂| 嫩草影院入口| 99久久精品热视频| 国产伦人伦偷精品视频| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲精品一区av在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 97超视频在线观看视频| 九色国产91popny在线| 免费av毛片视频| 亚洲精华国产精华精| 在线免费观看不下载黄p国产 | 麻豆成人午夜福利视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美国产日韩亚洲一区| 白带黄色成豆腐渣| 国产欧美日韩一区二区三| 久久性视频一级片| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美又色又爽又黄视频| 一级毛片久久久久久久久女| 午夜福利在线观看吧| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲真实伦在线观看| 日本a在线网址| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲,欧美精品.| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩人妻高清精品专区| 国产三级黄色录像| 亚洲av二区三区四区| 欧美日韩综合久久久久久 | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 午夜福利免费观看在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美成人a在线观看| 成人精品一区二区免费| 欧美乱色亚洲激情| 免费无遮挡裸体视频| 九九在线视频观看精品| 午夜免费成人在线视频| 久久久久久久久大av| 一区福利在线观看| 久久久精品大字幕| 色5月婷婷丁香| 中文字幕av成人在线电影| 免费av毛片视频| 男插女下体视频免费在线播放| bbb黄色大片| 看片在线看免费视频| 国产伦在线观看视频一区| 91狼人影院| 国产极品精品免费视频能看的| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲av电影在线进入| 日韩高清综合在线| 久久人妻av系列| 999久久久精品免费观看国产| 五月伊人婷婷丁香| 久久久久久久久久黄片| 国产真实乱freesex| 亚洲国产精品久久男人天堂| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 3wmmmm亚洲av在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 成人亚洲精品av一区二区| 国产熟女xx| 国产亚洲精品久久久久久毛片| www.999成人在线观看| 色吧在线观看| 日本 欧美在线| 91狼人影院| 亚洲av美国av| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美精品啪啪一区二区三区| av视频在线观看入口| 亚洲一区二区三区不卡视频| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲不卡免费看| 中文字幕av成人在线电影| 成人性生交大片免费视频hd| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲五月天丁香| 可以在线观看毛片的网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 99久久无色码亚洲精品果冻| 老司机深夜福利视频在线观看| 十八禁网站免费在线| 级片在线观看| 亚洲国产精品999在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲第一区二区三区不卡| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线国产一区二区在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久久久国内视频| 成年女人看的毛片在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 脱女人内裤的视频| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品久久久久久久电影| 观看美女的网站| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲内射少妇av| 国产精品野战在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 如何舔出高潮| 在线天堂最新版资源| 久久久久国内视频| 午夜两性在线视频| 国产黄色小视频在线观看| 欧美+日韩+精品| 欧美黄色片欧美黄色片| 可以在线观看毛片的网站| 成人三级黄色视频| 亚洲不卡免费看| 91九色精品人成在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲国产精品999在线| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 97热精品久久久久久| 久久久久久久久中文| 欧美性猛交黑人性爽| 两人在一起打扑克的视频| 国产男靠女视频免费网站| 91久久精品国产一区二区成人| 赤兔流量卡办理| 长腿黑丝高跟| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美午夜高清在线| 如何舔出高潮| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲av免费高清在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 男人的好看免费观看在线视频| 成人永久免费在线观看视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 免费观看精品视频网站| 九九热线精品视视频播放| 看黄色毛片网站| 免费看美女性在线毛片视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美日本视频| 国产精品三级大全| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产精品成人综合色| 9191精品国产免费久久| 色哟哟·www| 老司机福利观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 麻豆av噜噜一区二区三区| www日本黄色视频网| 成人性生交大片免费视频hd| 国产野战对白在线观看| 如何舔出高潮| 少妇人妻一区二区三区视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲激情在线av| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品一区二区免费观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 精品福利观看| 桃红色精品国产亚洲av| 怎么达到女性高潮| 极品教师在线免费播放| 麻豆一二三区av精品| 亚洲国产精品999在线| 51午夜福利影视在线观看| av黄色大香蕉| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产精品伦人一区二区| 午夜精品在线福利| or卡值多少钱| 一级av片app| 日本黄色视频三级网站网址| 色吧在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲人与动物交配视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av美国av| 欧美高清性xxxxhd video| 麻豆成人av在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 看黄色毛片网站| 两个人的视频大全免费| a级毛片免费高清观看在线播放| 一本精品99久久精品77| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久久久国内视频| 久久久久久久久中文| 长腿黑丝高跟| 中出人妻视频一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费观看人在逋| 脱女人内裤的视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产91精品成人一区二区三区| 中文字幕久久专区| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲成av人片在线播放无| 日本a在线网址| 麻豆一二三区av精品| 日本a在线网址| 熟女电影av网| 亚洲五月天丁香| 99久久久亚洲精品蜜臀av| xxxwww97欧美| 日本与韩国留学比较| 国产成人啪精品午夜网站| 午夜福利18| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产野战对白在线观看| 亚洲人成网站在线播| 一二三四社区在线视频社区8| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 变态另类丝袜制服| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲七黄色美女视频| 真人做人爱边吃奶动态| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品久久电影中文字幕| 97超视频在线观看视频| 国产色爽女视频免费观看| 色综合站精品国产| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩欧美免费精品| 欧美区成人在线视频| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲精品影视一区二区三区av| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 精品国产亚洲在线| 久久久久性生活片| 亚洲精品一区av在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 少妇丰满av| 真实男女啪啪啪动态图| 舔av片在线| 中文字幕久久专区| 床上黄色一级片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久精品国产清高在天天线| 国产亚洲精品av在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 少妇高潮的动态图| 亚洲成av人片免费观看| 97碰自拍视频| 美女高潮的动态| 在线免费观看的www视频| 亚洲无线观看免费| 天美传媒精品一区二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产69精品久久久久777片| 男人舔奶头视频| 色尼玛亚洲综合影院| www日本黄色视频网| 看免费av毛片| 欧美日韩乱码在线| 搞女人的毛片| 毛片女人毛片| av国产免费在线观看| 人妻久久中文字幕网| 在线观看一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品在线美女| 老熟妇仑乱视频hdxx| 极品教师在线免费播放| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日本a在线网址| 成人精品一区二区免费| 久久亚洲精品不卡| 男人舔女人下体高潮全视频| 麻豆成人午夜福利视频| 国产毛片a区久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 99久国产av精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产成人aa在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精华一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 免费人成在线观看视频色| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产高清三级在线| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜福利成人在线免费观看| 搡老岳熟女国产| 成人无遮挡网站| 悠悠久久av| av视频在线观看入口| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产极品精品免费视频能看的| 如何舔出高潮| 久久久久久久午夜电影| 韩国av一区二区三区四区| 一夜夜www| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美黑人巨大hd| 女同久久另类99精品国产91| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲成av人片在线播放无| 毛片女人毛片| avwww免费| 中文在线观看免费www的网站| 性色av乱码一区二区三区2| 三级国产精品欧美在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 国产高清激情床上av| 脱女人内裤的视频| 97超视频在线观看视频| 国产毛片a区久久久久| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 午夜福利成人在线免费观看| 精品一区二区三区人妻视频| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲av电影在线进入| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 香蕉av资源在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 神马国产精品三级电影在线观看| 免费看日本二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美日本视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产三级中文精品| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美激情在线99| 全区人妻精品视频| 三级毛片av免费| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 特大巨黑吊av在线直播|