白介素22在直腸癌患者外周血中的表達(dá)水平及其對直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

趙航，郭燕，許元鴻

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市中心醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胰腺外科，遼寧 沈陽 110001）

白介素22在直腸癌患者外周血中的表達(dá)水平及其對直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

趙航1，郭燕2，許元鴻3

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市中心醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胰腺外科，遼寧 沈陽 110001）

目的探討白介素-22（IL-22）在直腸癌患者外周血中的表達(dá)水平及其對直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響機(jī)制。方法選取2014年2月-2015年6月該院就診的50例直腸癌患者為研究組，同期在該院體檢的健康者50例為對照組，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測直腸癌患者及正常人群外周血中IL-22的表達(dá)水平；在人直腸癌細(xì)胞系SW480中轉(zhuǎn)染IL-22小干擾R NA（IL-22 siR NA）及陰性對照，并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qR T-PCR）、ELISA及免疫印跡法（Western blot）檢測沉默后IL-22在mR NA及蛋白水平的表達(dá)變化；然后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖改變；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的改變，Western blot檢測STAT3的蛋白表達(dá)水平及其磷酸化水平（pSTAT3）。結(jié)果IL-22在直腸癌患者外周血中的表達(dá)水平高于正常對照人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；SW480轉(zhuǎn)染IL-22 siR NA后，IL-22表達(dá)水平下降（P<0.05）。干擾IL-22后SW480細(xì)胞增殖能力和遷移能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。干擾IL-22后，pSTAT3表達(dá)水平降低。結(jié)論IL-22在直腸癌患者外周血中高表達(dá)，在直腸癌細(xì)胞系中沉默IL-22可抑制細(xì)胞增殖和遷移，沉默IL-22抑制STAT3，表明IL-22可能通過調(diào)控STAT3參與調(diào)節(jié)直腸癌的發(fā)展。

白介素-22；直腸癌；增殖；遷移；STAT3

根據(jù)世界衛(wèi)生組織癌控項(xiàng)目的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年我國直腸癌新發(fā)約25萬例，死亡約13萬例，直腸癌已成為我國第5大致死性腫瘤[1]。直腸癌高致死性的主要原因是腫瘤耐藥和腫瘤轉(zhuǎn)移，研究發(fā)現(xiàn)早期直腸癌經(jīng)充分治療后5年生存率可達(dá)80%～90%[2]，而當(dāng)直腸癌發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移后，患者的5年生存率不足10%[3]。因此對直腸癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究有助于尋找有效的癌癥治療手段，提高患者生存率。白介素-22（Interleukin-22，IL-22）是IL-10細(xì)胞因子家族成員之一，由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，通過與其特異性IL-10 R2和IL-22R1受體復(fù)合物結(jié)合作用于組織細(xì)胞。IL-22與受體結(jié)合后，參與調(diào)控生存信號通路、細(xì)胞增殖、發(fā)育異常、血管生成等過程，在黏膜固有免疫防御、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-5]。已有研究報(bào)道，IL-22在銀屑病、消化道、肺、肝臟等腫瘤中存在異常作用[6-8]，然而目前關(guān)于IL-22在直腸癌中的研究較少報(bào)道。本研究通過檢測IL-22在直腸癌患者及正常人群外周血中的表達(dá)水平，探討IL-22對直腸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1臨床資料

選取2014年2月-2015年6月于本院治療的50例直腸癌患者作為研究組，其中男28例，女22例；年齡34～61歲。所有患者均為初診，手術(shù)后標(biāo)本經(jīng)病理確診為直腸癌Ⅲ期。選取同期在本院進(jìn)行健康檢查的50例正常人作為對照組，其中男24例，女26例；年齡32～60歲。兩組患者年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2主要試劑

RIMP 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、胰酶均購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，MTT試劑盒購于生工生物工程（上海）有限公司，酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購于美國Corning公司，IL-22 siRNA及陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，IL-22、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子購自Cell Signaling Technology公司，二抗購自中杉金橋，β-actin購于Sigma公司，酶標(biāo)儀（Bio-Rad 680）購于美國。

1.3酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測直腸癌患者及正常人群外周血中IL-22的表達(dá)水平

抽取清晨空腹時(shí)外周血2 ml置于EDTA抗凝管中，離心后分離上層血漿，置入-80℃冰箱冷凍保存。ELISA實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，最后用Bio-Rad酶標(biāo)儀在450nm處檢測吸光值。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人直腸癌細(xì)胞株SW480培養(yǎng)使用RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、青霉素（100u/ml）和鏈霉素（100u/ml）。轉(zhuǎn)染前胰酶消化細(xì)胞，以培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個(gè)/ml，接種至6孔板，每孔2 ml，置于37℃、5%二氧化碳CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中過夜。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合率時(shí)，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染IL-22小干擾RNA（IL-22 siRNA）及陰性對照，48 h后分別提取RNA和蛋白質(zhì)檢測IL-22沉默效率。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

收集轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞，加入Trizol裂解后，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行總RNA提取，然后使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。聚合酶鏈反?yīng)條件：95℃變性30s，60℃退火30s，70℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參。IL-22正向引物：5'-AT GAGTTTTTCCCTTATGGGGAC-3'，反向引5'-GCTGG AAGTTGGACACCTCAA-3'；β-actin正向引物：5'-A AAGACCTGTACGCCAACAC-3'，反向引物：5'-GTCA TACTCCTGCTTGCTGAT-3'[9]。

1.6Western blot檢測蛋白水平

收集轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白提取，蛋白變性后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V轉(zhuǎn)膜10 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，使用脫脂奶粉室溫封閉1h，加入一抗：IL-22（1︰1 000），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（1︰500），磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子（1︰500），4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗（1︰2 000），室溫孵育2 h，暗室壓片。以β-actin（1︰8 000）為內(nèi)參。

1.7MTT檢測細(xì)胞增殖能力

將轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞以1000個(gè)/孔接種至96孔板，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中。24h后在培養(yǎng)孔加入10μl MTT溶液（5 mg/ml），混勻后置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)后棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜，并置于搖床上振蕩10min，待結(jié)晶物充分溶解后，使用酶標(biāo)儀檢測上清液在490nm處的吸光值，連續(xù)記錄3d的OD值。

1.8劃痕實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種至6孔板，每孔2ml，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%~90%匯合率時(shí)取出，用10μl槍頭在細(xì)胞表面劃痕，PBS清洗去除劃下的細(xì)胞。劃痕后0和48 h拍照觀察遷移率。遷移率=（0 h時(shí)面積-48h時(shí)面積）/0h時(shí)面積×100%

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均符合正態(tài)分布，組間比較用Student’s t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1直腸癌患者外周血中IL-22水平變化

研究組與對照組患者外周血中IL-22分別為（19.47±7.99）pg/ml和（8.27±1.54）pg/ml，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.733，P=0.000），研究組直腸癌患者外周血中IL-22表達(dá)水平較對照組升高。

2.2沉默IL-22后表達(dá)水平

SW480細(xì)胞系轉(zhuǎn)染IL-22 siRNA及陰性對照組，兩組mRNA、蛋白水平的沉默結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=44.152，P=0.000；t=25.460，P= 0.000），轉(zhuǎn)染IL-22 siRNA后SW480細(xì)胞系分泌的IL-22（見圖1A）及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的IL-22水平（見圖1B和1C）均下降。

圖1　沉默表達(dá)IL-22表達(dá)水平（±s）

圖2　沉默表達(dá)IL-22對直腸細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

2.3沉默表達(dá)IL-22對直腸癌增殖和遷移能力的影響

MTT結(jié)果顯示，沉默IL-22的結(jié)腸癌細(xì)胞系與陰性對照組比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.054，P=0.000），沉默IL-22在72h時(shí)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的增殖（見圖2A）。劃痕結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 14.064，P=0.000），轉(zhuǎn)染IL-22 siRNA 48h后，SW480細(xì)胞遷移率降低（見圖2B、C）。

2.4干擾IL-22對直腸癌細(xì)胞STAT3表達(dá)的影響

STAT3的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平（pSTAT3）（見圖3A）檢測結(jié)果采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=44.927，P=0.000），沉默IL-22后，STAT3表達(dá)變化不大，但pSTAT3表達(dá)水平較陰性對照組降低，表明沉默IL-22抑制STAT3的活化。見圖3。

圖3　沉默表達(dá)IL-22對STAT3的影響（x±s）

3 討論

直腸癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高、臨床上常見的胃腸道腫瘤，在女性中發(fā)病率處于惡性腫瘤的第2位，僅次于乳腺癌；在男性中發(fā)病率處于惡性腫瘤的第3位，僅次于肺癌、前列腺癌。每年全世界范圍內(nèi)的新增病例約為120萬例，死亡人數(shù)60多萬例/年[10]。在我國，隨著人們生活水平的不斷提高和飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病率及死亡率也逐年升高，年平均增長率為4%，嚴(yán)重危害國人的身心健康。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程及其復(fù)雜，炎癥在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用已得到廣泛認(rèn)可，其中細(xì)胞因子在抗腫瘤免疫機(jī)制和腫瘤逃避免疫機(jī)制中起著重要作用[11]。IL-22是IL-10細(xì)胞因子家族的成員，主要由輔助T淋巴細(xì)胞17（Th17細(xì)胞）、Th22、自然殺傷細(xì)胞22（NK22）等分泌產(chǎn)生[12]。IL-22的功能是參與抗微生物防御，保護(hù)和修復(fù)組織損傷[13]；此外，IL-22作為腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子，還參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等重要過程，在不同的組織中發(fā)揮不同的作用[14-15]。同時(shí)，因?yàn)镮L-22受體表達(dá)的組織特異性，以IL-22作為腫瘤治療的分子靶標(biāo)，可抑制腫瘤免疫同時(shí)減少副反應(yīng)。因此對直腸癌IL-22表達(dá)及作用機(jī)制的研究可為直腸癌的治療提供依據(jù)。

本研究檢測直腸癌患者及正常人群外周血中IL-22的表達(dá)，結(jié)果顯示，直腸癌患者外周血中IL-22的表達(dá)水平均高于正常人群，表明IL-22與直腸癌發(fā)生、發(fā)展有密切的聯(lián)系。前期研究表明，IL-22在肝癌患者外周血中高表達(dá)且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。在肺癌中，IL-22高表達(dá)且可增加肺癌細(xì)胞的耐藥性[8]。在結(jié)直腸癌中，IL-22表達(dá)水平與腫瘤分期有明顯相關(guān)，且耐藥性患者血清中IL-22水平升高[16-17]。同時(shí)在結(jié)直腸癌動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，IL-22在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用[18]。本結(jié)果與前期研究基本一致。研究時(shí)在直腸癌細(xì)胞系SW480中沉默IL-22，結(jié)果顯示直腸癌細(xì)胞增殖及遷移速度減慢，提示IL-22可能參與結(jié)腸癌的發(fā)展過程。IL-22可參與激活JAK-STAT、MAPK等信號通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)沉默IL-22抑制STAT3的磷酸化，表明IL-22可能通過調(diào)控STAT3信號通路進(jìn)而促進(jìn)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述，IL-22在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，直腸癌患者外周血中IL-22表達(dá)水平的檢測可為直腸癌的免疫治療提供潛在靶點(diǎn)。

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（申海菊編輯）

Expression level of IL-22 in peripheral blood of colorectal carcinoma patients and its effect on cancer cell proliferation and migration

Hang Zhao1，Yan Guo2，Yuan-hong Xu3
（1.Department of General Surgery，the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China；2.Jinzhou Central Hospital，Jinzhou，Liaoning 121000，China；3.Department of Pancreatic Surgery，the First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang，Liaoning 110001，China）

Objective To investigate the expression level of IL-22 in peripheral blood of colorectal carcinoma（CRC）patients and the effect on cancer cell proliferation and migration.Methods Fifty CRC patients in our hospital from February 2014 to June 2015 were selected as study group，and 50 people who had medical examination in the same period were selected as control group.ELISA was used to detect the expression of IL-22 in in peripheral blood of the CRC patients and normal controls.IL-22 siRNA and negative control were transfected into SW480 cells，and qRT-PCR，ELISA and Western blot were used to detect the expression levels of IL-22 mRNA and protein.MTT and wound healing were used to detect the proliferation and migration ability respectively.Western blot was adopted to STAT3 and pSTA3 levels.Results The plasma level of IL-22 in the CRC patients was significantly higher than that in the normal controls（P＜0.05）.The mRNA and protein levels of IL-22 in the SW480 cells were significantly reduced after transfection of IL-22 siRNA（P＜0.05）.The proliferation and migration abilities of the SW480 cells were markedly reduced after knockdown of IL-22（P＜0.05）.The level of pSTAT3 was decreased after knockdown of IL-22. Conclusions The expression level of IL-22 in peripheral blood of CRC patients increases.Knockdown of IL-22 inhibits CRC cell proliferation and migration，and suppresses the activation of STAT3，suggesting IL-22 may participate in regulation of CRC progression by regulating STAT3.

IL22；rectal cancer；proliferation；migration；STAT3

R 735.37

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.012

1005-8982（2016）19-0058-05

2016-03-01

許元鴻，E-mail：dht656gf@139.com