轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白小鼠血小板黏附聚集功能的變化*

賀可貴，閔祥棟，王云，韓紀(jì)舉，辛?xí)悦?，趙曉民

（1.泰山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 泰安 271016；2.泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000）

轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白小鼠血小板黏附聚集功能的變化*

賀可貴1，閔祥棟1，王云2，韓紀(jì)舉2，辛?xí)悦?，趙曉民1

（1.泰山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 泰安 271016；2.泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000）

目的探討轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白小鼠血小板黏附和聚集功能的變化。方法選用12～14周齡轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白小鼠和C57BL/6J小鼠，戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，肝素抗凝，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血小板參數(shù)，灌流小室法測(cè)定血小板在膠原面的黏附變化，比濁法測(cè)定不同濃度二磷酸腺苷誘導(dǎo)下的血小板最大聚集率。結(jié)果與轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白雄性小鼠比較，雌性小鼠的血小板數(shù)、血小板平均體積、血小板壓積、黏附率和最大聚集率（二磷酸腺苷3、10和30μmol）下降（P<0.05）；與C57BL/6J雌性小鼠比較，轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白小鼠血小板數(shù)降低（P<0.05）。結(jié)論轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白雌雄小鼠之間血小板數(shù)、血小板平均體積、血小板壓積和黏附聚集功能有差異，轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白小鼠與C57BL/6J雌性小鼠之間血小板數(shù)也有差異。

血小板；轉(zhuǎn)基因；增強(qiáng)綠色熒光蛋白；黏附；聚集

轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）小鼠是在C57BL/6J小鼠的基因組中導(dǎo)入ACTB-EGFP基因，在小鼠體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生熒光蛋白。在紫色光照射下，該蛋白產(chǎn)生綠色熒光，也使得小鼠整個(gè)身體呈現(xiàn)綠色熒光。除毛發(fā)和紅細(xì)胞外，ACTB-EGFP基因在其他細(xì)胞中均能表達(dá),因此，在熒光顯微鏡下其他組織均可產(chǎn)生熒光[1-2]。目前,綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠是一種重要的工具小鼠，現(xiàn)已在發(fā)育、免疫、細(xì)胞生物學(xué)等研究中不可或缺[3]，為胚胎干細(xì)胞、人類基因功能、人體組織工程和克隆器官等提供基礎(chǔ)研究。

血小板黏附聚集功能在出血和缺血性疾病中起重要作用，利用轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠進(jìn)行黏附功能的測(cè)定及熒光成像具有操作簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于活體動(dòng)物體內(nèi)成像[4-6]。由于血小板在熒光顯微鏡下顯示熒光，因此不需染色，黏附實(shí)驗(yàn)圖像采集可直接在熒光顯微鏡下進(jìn)行，計(jì)算黏附面積或者熒光強(qiáng)度即可，簡(jiǎn)單方便。關(guān)于轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠黏附聚集功能的研究較少，目前YANG等人[7]將EGFP作為Gz敲除的報(bào)告基因，觀察血小板Gz對(duì)聚集的影響。付斌等人[8]對(duì)血小板特異性整合蛋白儀αⅡbβ3有所研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠血小板黏附聚集功能進(jìn)行測(cè)定，并與C57BL/6J小鼠進(jìn)行比較，為該小鼠血小板方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用12～14周齡轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠和C57BL/ 6J小鼠各15只，體重20～25g。轉(zhuǎn)基因C57BL/16-Tg（ACTB-EGFP）10 sb/J小鼠由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心惠贈(zèng)，C57BL/6J小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）20120001]，飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～26℃，相對(duì)濕度50%～70%，光照明暗交替12 h/d，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。

1.2儀器

CHRONO-LOG血小板聚集分析儀（美國(guó)Chrono-Log公司，MODEL 700型），臺(tái)式離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司，TG16-WS型），全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（深圳市康普電子有限公司，PE-6800VET型），灌流小室由荷蘭烏特勒茲大學(xué)血栓與止血實(shí)驗(yàn)室提供，循環(huán)水式多用真空泵（鄭州城科工貿(mào)有限公司，SHB-Ⅲ型），數(shù)顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠，BT-100B型），顯微鏡（日本Olympus公司，BX51型），Image-Pro Plus-Version 4.0 for WindowsTM圖像采集分析處理系統(tǒng)，電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，JA31001型）。

1.3藥物與試劑

戊巴比妥鈉（Merck，北京金鑫天佑分裝），0.9%生理鹽水（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司），二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）（美國(guó)Sigma公司），牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）（美國(guó)Sigma公司），肝素鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司）。膠原的制備：斷頭處死老年大鼠（>50周齡），取鼠尾洗凈后置于75%酒精中浸泡5min，取出尾腱后在生理鹽水中浸泡1h，吸干水分稱重、剪碎，放入0.1 mol醋酸溶液中（4%）攪拌溶解。4℃放置24 h后4 000 r/min離心15min取上清即成。

1.4血小板參數(shù)測(cè)定

動(dòng)物以戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，心臟取血肝素抗凝[9]，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板數(shù)、血小板平均體積、血小板壓積和血小板平均寬度。再將血液分成兩部分，分別檢測(cè)血小板黏附率和聚集率。

1.5血小板黏附率測(cè)定

用氮?dú)鈬姌寣?.1 mol醋酸溶解的膠原蛋白均勻噴到蓋玻片（1.2 mm×1.2 mm）上，每片膠原蛋白含量20μg。在1%BSA中封閉15min后，包被膠原蛋白的蓋玻片放置在灌流小室上，調(diào)整血液流速，流經(jīng)灌流小室產(chǎn)生300/s切變率，每只動(dòng)物的肝素抗凝血灌流時(shí)間分別為4和5min，重復(fù)3次。血液灌流結(jié)束，HEPES溶液沖洗蓋玻片，分別經(jīng)戊二醛、甲醇固定，May-Grünwald-Giemsa液染色，在400倍鏡下每片隨機(jī)選取10個(gè)視野，Image-Pro Plus-Version 4.0 for WindowsTM圖像采集分析處理系統(tǒng)計(jì)算各視野血小板黏附率（血小板面積/整個(gè)視野面積），10個(gè)視野血小板黏附率的均值為單次血小板黏附率，3次血小板黏附率的均值為一只動(dòng)物的血小板黏附率[10]。

1.6血小板聚集率檢測(cè)

將肝素抗凝血離心（1 100 r/min）10 min，吸出上層富血小板血漿后，再以3 800 r/min離心10 min制備貧血小板血漿。先用貧血小板血漿調(diào)整富血小板血漿血小板數(shù)為300×109/L，再用生理鹽水將血小板數(shù)調(diào)整至200×109/L，貧血小板血漿按照同比例加生理鹽水稀釋作為聚集參照，應(yīng)用CHRONO-LOG血小板聚集分析儀，分別加入終濃度為3、10和30μmol ADP，測(cè)定血小板最大聚集率來(lái)反映血小板聚集率的變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Instat V3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板參數(shù)變化

轉(zhuǎn)基因EGFP雄性小鼠與轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠血小板數(shù)、血小板平均體積、血小板壓積比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)基因EGFP雄性小鼠血小板數(shù)、血小板平均體積、血小板壓積高于轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠；轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠與C57BL/6J雌性小鼠血小板數(shù)比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.517，P=0.002），轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠血小板數(shù)低于C57BL/6J雌性小鼠；但轉(zhuǎn)基因EGFP和C57BL/6J雄性小鼠之間和C57BL/6J雄性小鼠與雌性小鼠之間上述血小板參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1　轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板參數(shù)比較（±s）

表1　轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板參數(shù)比較（±s）

注：1）與轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠比較，P<0.05；2）與C57BL/6J雌性小鼠比較，P<0.05

組別血小板數(shù)（×109/L）血小板壓積/%轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠雄性659.3±47.31）9.7±0.41）8.3±0.20.60±0.01）雌性503.1±34.52）8.2±0.98.1±0.50.45±0.1 t值5.9663.4060.8303.355 P值0.0000.0090.4300.010 C57BL/6J小鼠雄性628.9±66.89.9±1.08.5±0.60.6±0.1雌性588.7±24.68.9±0.48.3±0.30.5±0.1 t值1.2622.0760.6671.581 P值0.2420.0720.5240.153血小板平均體積/fl血小板分布寬度/%

2.2轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板黏附率

表2　轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板黏附率比較（%±s）

表2　轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板黏附率比較（%±s）

注：?與轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠比較，P<0.05

血小板黏附率灌流4min灌流5min轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠雄性52.4±7.8?56.5±8.9雌性42.9±4.451.9±7.2 t值2.3720.899 P值0.0450.355 C57BL/6J小鼠雄性48.4±7.257.0±5.1雌性44.0±4.756.6±4.8 t值1.1440.128 P值0.2860.902組別

轉(zhuǎn)基因EGFP雄性小鼠與轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠血小板黏附率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，灌流時(shí)間為4 min時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)基因EGFP雄性小鼠血小板黏附率高于轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠；但轉(zhuǎn)基因EGFP和C57BL/6J雄性小鼠之間和C57BL/6J雄性小鼠與雌性小鼠之間血小板黏附率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.3轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板最大聚集率

轉(zhuǎn)基因EGFP雄性小鼠與轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠不同ADP濃度下的血小板最大聚集率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)基因EGFP雄性小鼠不同ADP濃度下的血小板最大聚集率高于轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠；C57BL/6J雄性小鼠與C57BL/6J雌性小鼠不同ADP濃度下的血小板最大聚集率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C57BL/6J雄性小鼠不同ADP濃度下的血小板最大聚集率高于C57BL/6J雌性小鼠；但轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠之間不同ADP濃度下的血小板最大聚集率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3　轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板最大聚集率比較（%±s）

表3　轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板最大聚集率比較（%±s）

注：1）與轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠比較，P<0.05；2）與C57BL/6J雌性小鼠比較，P<0.05

組別血小板最大聚集率ADP 3μmolADP 10μmolADP 30μmol轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠雄性53.9±4.11）62.3±1.21）69.3±8.11）雌性33.0±1.455.0±1.756.0±1.7 t值10.7877.8443.593 P值0.0000.0000.007 C57BL/6J雄性49.8±7.52）66±3.72）69.8±5.72）雌性34.8±1.753.5±0.660.2±3.9 t值4.3617.4573.108 P值0.0000.0000.015

3 討論

血小板活化在出血、止血和血栓形成過(guò)程中非常重要，與多種疾病有關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈疾病、腦血管疾病等，也是炎癥易化及進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。血小板活化重要的表現(xiàn)為黏附和聚集功能的增強(qiáng)[11]。了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血小板的活化有助于利用該種動(dòng)物開展相關(guān)疾病的研究[12]。

研究血小板參數(shù)是評(píng)價(jià)血小板功能的基本指標(biāo)。轉(zhuǎn)基因EGFP雄性小鼠血小板數(shù)、血小板平均體積、血小板壓積高于轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠，提示轉(zhuǎn)基因EGFP雌雄小鼠之間血小板功能可能有差別，這種差異也存在于C57BL/6J雌雄小鼠之間。另外,. 6J雌性小鼠。

為進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠血小板功能，筆者觀察了血小板黏附、聚集變化。與上述血小板參數(shù)變化相似，灌流時(shí)間為4 min時(shí)轉(zhuǎn)基因EGFP雄性小鼠血小板黏附率高于轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠，進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠血小板功能的性別差異。但轉(zhuǎn)基因EGFP和C57BL/6J雄性小鼠之間和C57BL/6J雄性小鼠與雌性小鼠之間血小板黏附率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同ADP濃度下，轉(zhuǎn)基因EGFP雄性小鼠的血小板最大聚集率高于轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠；同樣，不同ADP濃度下，C57BL/6J雄性小鼠的血小板最大聚集率高于C57BL/6J雌性小鼠；但不同ADP濃度下，轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠之間的血小板最大聚集率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

EGFP被廣泛用于報(bào)告基因來(lái)檢測(cè)目標(biāo)基因在特定組織和器官的表達(dá)。迄今為止，體外研究發(fā)現(xiàn)EGFP對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒害，大部分在體研究結(jié)果與體外研究結(jié)果一致。SHEEN等[13]證實(shí)，在玉米轉(zhuǎn)基因植株中，即使EGFP在細(xì)胞中有很高的表達(dá)量，對(duì)細(xì)胞也不會(huì)產(chǎn)生明顯毒害。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，轉(zhuǎn)基因EGFP雌雄小鼠之間血小板功能有差異，但除了轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠血小板數(shù)低于C57BL/6J雌性小鼠外，轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠血小板和C57BL/6J小鼠血小板之間是無(wú)差異，提示轉(zhuǎn)EGFP基因可能會(huì)對(duì)小鼠血小板有影響，但仍需進(jìn)一步確定。

轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠是在C57BL/6J小鼠的基礎(chǔ)上構(gòu)建成功，但在血小板參數(shù)等指標(biāo)上確實(shí)存在差異，這與田小蕓等[1]所得出的結(jié)論一致。病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠部分胸腺發(fā)育缺陷，推測(cè)綠色熒光蛋白可能影響動(dòng)物的發(fā)育[14]，提示這也可能是EGFP基因影響雌性小鼠血小板功能的原因。

每個(gè)品種品系的動(dòng)物都有其自身的生物學(xué)特征，這也是區(qū)別其他動(dòng)物的基礎(chǔ)[2]，由于性別不同某些生理特性有所不同[1]。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)血小板參數(shù)指標(biāo)中，雄性小鼠的血小板數(shù)、血小板平均體積、血小板壓積高于雌性小鼠；血小板功能指標(biāo)中，雄性小鼠的血小板黏附面積和最大聚集率均高于雌性小鼠，雖然雌雄之間有差異，但在正常波動(dòng)范圍內(nèi)[15-19]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板參數(shù)、黏附和聚集功能變化的測(cè)定，觀察兩種小鼠及其性別之間的差異，為轉(zhuǎn)基因C57BL/6-Tg（ACTB-EGFP）10 sb/J小鼠資料庫(kù)的建立提供參考。但轉(zhuǎn)基因EGFP雌性小鼠血小板功能改變的內(nèi)在機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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（申海菊編輯）

Changes of platelet adhesion and aggregation function in transgenic EGFP mice*

Ke-gui He1，Xiang-dong Min1，Yun Wang2，Ji-ju Han2，Xiao-ming Xin1，Xiao-min Zhao1
（1.School of Pharmacology Sciences，Taishan Medical University，Taian，Shandong 271016，China；2.Institute of Atherosclerosis，Taishan Medical University，Taian，Shandong 271000，China）

Objective To measure the changes of platelets adhesion and aggregation function in transgenic enhanced green fluorescent protein（EGFP）mice.Methods Transgenic EGFP and C57BL/6J mice（12-16 weeks，both male and female）were used for the present study.The mice were anesthetized with Pentobarbital sodium and blood was taken from the heart anticoagulated with Heparin.Platelet parameters were measured using an automated blood cell analyzer.Platelet adhesion on collagen surface was evaluated using a welldefined perfusion chamber.The maximum aggregation rate of platelets induced by ADP was determined by turbidimetry.Results In transgenic EGFP mice，platelet count，mean platelet volume（MPV），plateletcrit（PCT），adhesion rate and the maximum aggregation rate（ADP final concentration was 3 μmol，10 μmol and 30 μmol respectively）of the female mice were decreased compared with those of the male ones（P＜0.05）.In the female mice，platelet count of the transgenic EGFP mice were decreased compared with that of the C57BL/6J mice（P＜0.05）.Conclusions There are differences in platelet count，MPV，PCT，adhesion rate and the maximum aggregation rate between male and female transgenic EGFP mice.There is also difference in platelet countbetween female transgenic EGFP mice and C57BL/6J mice.

platelet；transgene；enhanced green fluorescent protein；adhesion；aggregation

R 331.143

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.002

1005-8982（2016）19-0006-05

2016-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81173061）；泰山地產(chǎn)中藥研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心基金，山東省自然科學(xué)基金（No：ZR2014HQ007），泰安市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No：201440774-25）

賀可貴，現(xiàn)在寧陽(yáng)縣人民醫(yī)院臨床藥學(xué)部。E-mail：hekegui0724@yeah.net

趙曉民，E-mail：zhaoxiaominty@163.com