載血卟啉單甲醚納米高分子微球的制備及顯像實驗

陳 飛CHEN Fei郝 蘭HAO Lan嚴思靜YAN Sijing鄒建中ZOU Jianzhong

作者單位1. 重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院 重慶400016 2. 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 重慶400016

載血卟啉單甲醚納米高分子微球的制備及顯像實驗

陳 飛1CHEN Fei郝 蘭2HAO Lan嚴思靜1YAN Sijing鄒建中1ZOU Jianzhong

作者單位1. 重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院 重慶400016 2. 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 重慶400016

Chongqing University of Medical Sciences Institute of Biomedical Engineering， Chongqing 400016， China

Address Correspondence to： ZOU Jianzhong E-mail： zoujz@haifu.com.cn

中國醫(yī)學影像學雜志2016年 第24卷 第8期：632-636

Chinese Journal of Medical Imaging 2016 Volume 24 （8）： 632-636

目的 制備出一種載血卟啉單甲醚（HMME）的聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）多功能造影劑（MBPLGA-HMME，MB： Microbubble），檢測MBPLGA-HMME的基本性質(zhì)以及HMME包裹在PLGA微球上后，性質(zhì)改變情況，探討其集顯像與治療一體化的可行性。資料與方法 采用雙乳化法制備MBPLGA-HMME，對其結(jié)構(gòu)、形態(tài)、載藥率等性質(zhì)進行檢測，采用體外成像比較HMME藥物與MBPLGA-HMME超聲/光聲成像改變情況以及進行初步體內(nèi)光聲成像。結(jié)果 MBPLGA-HMME溶于雙蒸水后呈淡紅色懸液，顯微鏡下觀察MBPLGA-HMME呈球形，形態(tài)規(guī)則，大小均勻無聚集、粘連現(xiàn)象，能發(fā)出紅色熒光，HMME均勻分布在微球上，光學顯微鏡和透射電鏡均可見MBPLGA-HMME為殼核結(jié)構(gòu)，外有一層明顯的黑色的殼膜，HMME主要分布于PLGA微球殼上。體外光聲成像顯示，MBPLGA-HMME溶液濃度為408 μmol/L、816 μmol/L、1632 μmol/L的平均光聲信號強度分別為0.2009±0.0636、0.3789±0.0431、0.5380±0.0997；同樣濃度梯度下，HMME溶液的平均光聲信號值分別為0.0738±0.0133、0.1137±0.0065、0.2170±0.0270，組間和組內(nèi)兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義，但藥物性質(zhì)基本未改變。MBPLGA-HMME經(jīng)靜脈注入荷瘤鼠體內(nèi)后，可進行體內(nèi)光聲顯像。結(jié)論 本研究成功制備載血卟啉單甲醚藥物的MBPLGA-HMME，HMME藥物水溶性得到改善，其基本的吸光性質(zhì)得以保持，可進行體內(nèi)外超聲/光聲成像。

造影劑；血卟啉類；聚合物；聚乙醇酸；乳酸；光聲成像

血卟啉單甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether，HMME）是光動力療法和聲動力療法最常用的光敏劑和聲敏劑［1-4］，具有組成單一、性能穩(wěn)定、腫瘤選擇性高、對正常組織光毒性低等優(yōu)點，是一種具有廣闊前景的藥物。但也存在副反應，如色素沉著、瘙癢、局部疼痛等，并且難溶于水，在水中易團聚，影響其生物效率和對能量的吸收等性質(zhì)［5］，限制了其臨床應用。HMME自帶紅色熒光，卻很少有報道將其用于成像研究，能否利用HMME吸收光這個特性進行成像，實現(xiàn)診療一體化呢？如何解決顯像的同時不改變其基本性質(zhì)而實現(xiàn)治療效果，且在此過程中能實現(xiàn)降低藥物的副反應以及增強其水溶性，提高藥物在腫瘤部位的積累呢？納米載體可以將藥物和診斷探針整合到一起，實現(xiàn)診療一體化［6］。光聲成像是近年來發(fā)展起來的一種無損醫(yī)學成像方法，它結(jié)合了光學成像的高對比度特性和超聲成像的高穿透深度特性，可以提供高分辨率和高對比度的組織成像［7］。本實驗利用生物相容性和安全性良好的高分子納米材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic acid-glycolic acid，PLGA）［8］，嘗試將HMME包裹到PLGA上，制備出一種集超聲顯像和治療一體的多功能造影劑。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 PLGA（50∶50，相對分子質(zhì)量12 ku，濟南岱罡生物工程有限公司）、HMME（上海笛柏化學品技術(shù)有限公司）、聚乙烯醇（pol vinyl alcohol，PVA，美國Sigma公司）、SONICS超聲聲振儀、XHF-D高速分散均質(zhì)機、瓊脂糖凝膠粉（美國Sigma公司）、ZNCLBS智能數(shù)顯磁力攪拌器、Eppendorf 5804（R）多功能高速離心機、紫外分光光度儀UV-2600（上海元析儀器有限公司），Malvern 3000SSA型激光粒徑測量儀（美國Zetasizer）、Vevo?LAZR光聲成像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司）。

1.2載HMME的PLGA納米微球（MBPLGA-HMME）的制備 采用雙乳化法制備：①稱取25 mg PLGA和2 mg HMME粉末溶于2 ml三氯甲烷；②待PLGA和HMME完全溶解后，加入200 μl去離子水采用超聲聲振儀，連續(xù)波振蕩45 s，功率80 W，可得淡紅色乳化液（W/O微球）；③加入2.5 ml 5%PVA，高速分散均質(zhì)機以13000 r/min，均質(zhì)2 min（W/O/W微球）；④室溫下磁力攪拌器攪拌2 h，充分揮發(fā)三氯甲烷；雙蒸水高速離心洗滌3～5次（5000 r/min，5 min），收集MBPLGA-HMME；⑤在真空冷凍干燥機中將收集的MBPLGA-HMME冷凍干燥48 h后充入C3F8氣體，可得MBPLGA-HMME凍干粉，放入4℃冰箱中備用。在上述第①步中不加HMME，其余步驟相同，可獲得空白MBPLGA。

1.3瓊脂凝膠模型制備 電子天平稱取500 mg瓊脂凝膠粉，放入500 ml干凈燒杯中，加入200 ml雙蒸水，加熱至沸騰，使其完全溶解于雙蒸水中，并攪拌去除溶液中的氣體，倒入凝膠模具中并按實驗需求插入200 μl槍頭，放置于陰涼干燥的壞境中自然冷卻，待完全冷卻后取出200 μl槍頭，即制成實驗所需凝膠孔洞模型，放入4℃冰箱備用。

1.4裸鼠人卵巢癌（SKOV3）移植瘤模型的建立 SKOV3細胞由重慶醫(yī)科大學超聲研究所贈與。將鋪滿培養(yǎng)瓶的SKOV3細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，離心去上清液，加入少量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，吹打使細胞混勻，分裝至新培養(yǎng)瓶（一傳二），再加入適量含血清培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的孵箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的SKOV3細胞經(jīng)消化、離心、重懸于無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度為3× 107個/ml；取5只BALB/c裸小鼠（4～5周齡，重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供），右側(cè)臀部皮下接種0.5 ml/只（1.5×107），2周后成瘤，3周左右腫瘤長徑為1～2 cm時用于實驗。

1.5MBPLGA-HMME一般特性檢測 取適量MBPLGA-HMME凍干粉，用雙蒸水稀釋復溶后，顯微鏡觀察其大小、分布情況以及微球包裹藥物情況，Malvern激光粒徑測量儀檢測微球粒徑大小。

1.6紫外分光光度儀測定微球的包封率、載藥率 將HMME溶解于二甲基亞砜（DMSO）溶液分別配成0.618 μmol/L、1.632 μmol/L、2.448 μmol/L、3.264 μmol/L、4.080 μmol/L、4.896 μmol/L 的溶液。先取2 ml DMSO溶液置于比色杯中，進行調(diào)零；再取2 ml HMME溶液（3.264 μmol/L），用200～800 nm波長的紫外光進行掃描，測得HMME溶液最大吸收波長在401 nm處，此為HMME的特征吸收峰［9］，本研究以此來測定包封率及載藥率，另外在500～700 nm還出現(xiàn)4個中強吸收峰，其中一個強吸收峰，其波長在622 nm處，此可作為選擇光聲成像激發(fā)波長的依據(jù)。然后各取2 ml上述不同濃度的HMME溶液分別置于波長為401 nm處測量OD值，作濃度-吸光度標準曲線。最后取2 ml空白PLGA和MBPLGA-HMME（兩者的理論濃度均為3.264 μmol/L）溶液加入比色杯中，置于紫外分光光度儀檢測槽中，測OD值，根據(jù)標準曲線，計算出實際藥物含量，按以下公式算出微球的包封率和載藥率。

其中Cm為MBPLGA-HMME內(nèi)HMME的含量，Ct為HMME總量，Wi為包入納米微球中的HMME含量，WT為PLGA質(zhì)量（g）。

1.7體外成像 運用Vevo?LAZR光聲成像系統(tǒng)，各取200 μl濃度為1632 μmol/L的HMME和MBPLGA-HMME溶液，加入凝膠模型中，采用探頭頻率為21 MHz，波長為680～970 nm的脈沖激光進行全波長輻照，選取藥物最大激發(fā)波長。在選定激發(fā)波長下，再分別檢測不同濃度（1632 μmol/L、816 μmol/L、408 μmol/L）的MBPLGA、MBPLGA-HMME和HMME超聲及光聲信號的強度變化。

1.8體內(nèi)成像 取成瘤3周左右的荷瘤鼠，經(jīng)腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉約0.2 ml麻醉。將MBPLGA-HMME復溶于生理鹽水中，稀釋成1632 μmol/L，按6 ml/kg經(jīng)瘤鼠尾靜脈注射0.2 ml（實際HMME量約0.15 mg），MBPLGA-HMME逐漸在腫瘤部位積累，30～ 60 min后采用光聲成像系統(tǒng)觀察成像情況。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件。各組間和組內(nèi)平均光聲信號強度比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1MBPLGA-HMME的一般特性 MBPLGA-HMME外觀呈紅色粉末狀，復溶于雙蒸水后呈淡紅色懸液，MBPLGA呈乳白色。光學顯微鏡顯示，MBPLGA-HMME呈球形，大小均勻，形態(tài)規(guī)則，無聚集、粘連現(xiàn)象（圖1A）。激光共聚焦顯微鏡下可見MBPLGA-HMME呈紅色熒光，HMME均勻分布在微球上（圖1B）；光學顯微鏡和透射電鏡均可見MBPLGA-HMME呈球形，為殼核結(jié)構(gòu)，外有一層明顯的黑色的殼膜，HHME主要分布于微球殼上（圖1A、C）。Malvern激光粒徑儀測得MBPLGA、MBPLGA-HMME的平均粒徑分別為（483.80±75.42）nm和（497.26±68.25）nm（圖1D、E）。

圖1　顯微鏡下觀察納米微球。A. 光鏡圖（×400）；B. 激光共聚焦顯微鏡圖（×400）；C.透射電鏡圖（×70.0K）；D. MBPLGA粒徑分布；E. MBPLGA-HMME粒徑分布

2.2MBPLGA-HMME的包封率和載藥率測定 MBPLGA未出現(xiàn)紫外吸收峰，MBPLGA-HMME和HMME溶液的紫外光譜圖顯示兩者的特征性吸收峰均在401 nm，未出現(xiàn)移位現(xiàn)象。另外，在500～700 nm還出現(xiàn)4個中強吸收峰，其中一個強吸收峰，其波長在622 nm處，此峰可作為選擇光聲成像激發(fā)波長的依據(jù)（圖2A箭頭所示）。采用紫外分光光度法所得HMME的標準曲線（圖2B），直線回歸方程：y=0.1588x－0.0013，R2=0.9998；根據(jù)公式計算得到MBPLGA-HMME的包封率為（76.45±0.93）%，載藥率為（6.12±0.18）%。

2.3體外成像

2.3.1超聲顯像 在超聲模式下，雙蒸水、HMME溶液呈無回聲（圖3A、B），其回聲強度低于周圍凝膠模型；MBPLGA、MBPLGA-HMME溶液均可顯影（圖3A、B），其回聲強度高于雙蒸水和HMME溶液及周圍凝膠模型，并且MBPLGA-HMME溶液在不同濃度下回聲強度隨濃度降低逐漸減弱（圖3C）；而不同濃度HMME溶液均未顯影，其回聲強度始終低于周圍凝膠模型（圖3D）。

2.3.2光聲顯像 MBPLGA在不同濃度均未出現(xiàn)光聲信號。HMME和MBPLGA-HMME溶液均在激光波長694 nm處出現(xiàn)了最強的光聲信號峰（圖4A、B箭）。MBPLGA-HMME和HMME溶液不同濃度梯度下均出現(xiàn)了較強的光信號（紅色），且隨溶液濃度的升高，信號也逐漸變強（圖4C、D），兩者光聲信號值（表1）與濃度成正比，濃度越高其光聲信號越強。但在成像過程中，HMME溶液中光信號值達到最大后，隨輻照時間延長，其值降低，差異有統(tǒng)計學意義；而MBPLGA-HMME隨輻照時間的延長，光聲信號一直穩(wěn)定在較高水平；且兩組在相同濃度下，MBPLGA-HMME光聲信號強度均大于HMME溶液，差異有統(tǒng)計學意義。

圖2　A. HMME和MBPLGA-HMME（理論濃度3.264 μmol/L）的紫外吸收光譜圖；B. HMME濃度-吸光度標準曲線

圖3　超聲B模式下。A. 雙蒸水與MBPLGA顯像圖；B. MBPLGA-HMME與HMME溶液顯像圖；C. 濃度從左至右分別為1632 μmol/L、816 μmol/L、408 μmol/L 的MBPLGA-HMME溶液超聲圖；D. 濃度從左至右分別為1632 μmol/L、816 μmol/L、408 μmol/L 的HMME溶液超聲圖

圖4　A. MBPLGA-HMME溶液的光聲信號圖；B. HMME溶液的光聲信號圖，兩者均在694 nm處出現(xiàn)最大光聲信號峰；C. 濃度從上至下分別為c1（1632 μmol/L）、c2（816 μmol/L）、c3（408 μmol/L）的MBPLGA-HMME溶液光聲信號光譜圖；D. 同樣濃度梯度（d1、d2、d3）下，HMME溶液光聲信號光譜圖

表1　不同濃度HMME和MBPLGA-HMME溶液平均光聲信號（PA AVR/Area）強度比較

2.4體內(nèi)成像 超聲模式下，腫瘤呈類圓形，邊界欠清，低回聲，內(nèi)部回聲不均勻（圖5A）；彩色多普勒血流成像顯示腫瘤內(nèi)部和周邊出現(xiàn)現(xiàn)狀、分枝狀彩色血流（圖5B）。光聲成像模式下，可見明顯光聲信號（紅色）主要分布在腫瘤周邊血供豐富區(qū)域，與血流信號走向一致（圖5C）。

圖5　MBPLGA-HMME體內(nèi)腫瘤成像。A.超聲圖；B. 彩色多普勒成像；C. 光聲成像圖

3 討論

本研究選用包封率高、穩(wěn)定性和生物相容性好且體內(nèi)血液循環(huán)時間長的高分子材料PLGA作為載體，制備出包裹HMME藥物的納米微球。通過顯微鏡下觀察，可得HMME成功包裹至PLGA高分子微球上，能發(fā)出紅色熒光，HMME主要位于PLGA微球壁上，包封率和載藥量分別為（76.45±0.93）%、（6.12±0.18）%，再次證明PLGA微球可以攜載HMME，且主要位于微球壁中［10］。MBPLGA-HMME粒徑為（497.26±68.25）nm，遠小于紅細胞（8 μm），能夠通過毛細血管進入腫瘤組織內(nèi)，在腫瘤組織中累積，提高其藥物濃度。

MBPLGA-HMME與HMME藥物的紫外光譜吸收圖一致，未發(fā)生特征性吸收峰的移位，以及光聲成像系統(tǒng)檢測兩者最大光聲信號峰均在694 nm處，證實HMME包裹到PLGA微球上后，并未改變其藥物結(jié)構(gòu)和基本的吸光性質(zhì)。另外，在光聲成像過程中，HMME在DMSO溶液中光信號值達到最大后，隨輻照時間延長，光信號值降低。這是由于HMME的光物理性質(zhì)具有微環(huán)境敏感的特征［11］，在復雜的生物體環(huán)境內(nèi)會發(fā)生一系列的反應，從而影響其光敏和聲敏化活性，其中HMME的存在狀態(tài)就是一個重要的影響因素。HMME難溶于水且易在水溶液中產(chǎn)生自聚合現(xiàn)象或在有機溶劑中達到其以單體存在形式的最大閾值后，逐漸產(chǎn)生聚合反應，形成分子團樣的聚集體，而聚集體會引起其光譜特性的改變，降低其熒光量子產(chǎn)率，還會改變其光/聲敏化活性，最終影響治療效果［5，11］，所以出現(xiàn)這種情況可能是HMME在DMSO溶液中達到以單體存在形式的最大閾值，然后分子之間逐漸結(jié)合成二聚體，最終形成聚集體，影響其光物理性質(zhì)，導致上述情況出現(xiàn)。其中濃度為408 μmol/L組與816 μmol/L組光信號值差異無統(tǒng)計學意義，可能濃度為408 μmol/L已達到HMME在溶劑中以單體存在形式的最大值，開始出現(xiàn)少量聚集現(xiàn)象，816 μmol/L時已有部分形成聚合體，導致HMME之間化學鍵發(fā)生了改變，引起光信號值降低較大。而MBPLGA-HMME分散均勻且在一定時間內(nèi)隨輻照時間的延長，光聲信號一直穩(wěn)定在較高水平。另外，MBPLGA-HMME能進行體內(nèi)光聲成像。這可能是MBPLGA-HMME在水溶液中形成穩(wěn)定的混懸液，減少HMME在血液循環(huán)中的聚合反應，保持藥物之間不發(fā)生團聚，穩(wěn)定的存在血液循環(huán)中，隨血流逐漸在腫瘤部位中積累［11］。本實驗不足之處：體內(nèi)成像部分研究不夠深入以及還未進行急性細胞毒性實驗，后續(xù)體內(nèi)治療實驗還在開展中。

成功制備的MBPLGA-HMME能進行超聲和光聲成像。其基本性能檢測及成像實驗顯示，MBPLGA-HMME能穩(wěn)定的存在于水溶液中，增強HMME水溶性且未影響其作為治療藥物的基本吸光性質(zhì)，為其后續(xù)體外體內(nèi)顯像及治療提供基礎。

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（本文編輯 張建軍）

Preparation and Imaging Studies of Poly-lactic Acid-glycolic Acid Polymeric Nanoparticles Coated Hematoporphyrin Monomethyl Ether

Purpose To prepare the poly-lactic acid - glycolic acid （PLGA） polymeric nanoparticles coated hematoporphyrin monomethyl ether （HMME） as a multifunction contrast agent （MBPLGA-HMME， micro-bubble）， and detectits physical and pharmacological properties， as well as its application and feasibility of imaging. Materials and Methods MBPLGA-HMMEwas prepared by using multi-emulsion method. Its structure， morphology and concentration of HMME loaded on PLGA microcapsules were assessed. In vitro ultrasound/ photoacoustic imaging of HMME and MBPLGA-HMME microspheres were compared and in vivo preliminary photo acoustic imaging of MBPLGA-HMMEmicrospheres was performed. Results MBPLGA-HMMEwas showed as light red suspension after resolving in distilled water；observed as regular and uniformed spherical putamen structure with obvious black shell membrane without aggregation and adhesion， as well as emitting red fluorescence .HMME mainly distributed on the PLGA microspheres. Photoacoustic imaging in vitro showed that the average photoacoustce signal intensity of MBPLGA-HMMEwere 0.2009±0.0636， 0.3789± 0.0431， 0.5380±0.0997 under different concentrations （408 μmol/L， 816 μmol/L， 1632 μmol/L）， respectively， while the average photoacoustce signal intensity of HMME were 0.0738±0.0133， 0.1137±0.0065， 0.2170±0.0270 under the same concentration gradient. There was significant difference of signal intensity between two groups in the same concentration and within one group in different concentrations， while the basic pharmacology properties didn't change. Photoacoustic imaging of intravenous injected MBPLGA-HMMEcan be performed in mice with tumor. Conclusion PLGA microspheres coated with HMME was successfully prepared with improved water-soluble and light absorption properties， which can be used in ultrasound/photoacoustic imaging.

Contrast media； Hematoporphyrins； Polymers； Polyglycolic acid； Lactic acid； Photoacoustic imaging

鄒建中

國家973計劃項目（N2011CB707900）；國家自然科學基金（81127901，11274404，81201102）。

R445.1；R445.9

2016-03-08

2016-03-26

10.3969/j.issn.1005-5185.2016.08.020