3種含氮雜環(huán)類藥物的手性色譜拆分及其制劑中對(duì)映體含量的測(cè)定

全思思，陳　智，吳學(xué)昊，湯遜尤，淮文蓓，張　薇，葉連寶，范華均*

(1. 廣東藥科大學(xué)　藥學(xué)院，廣東　廣州　510006；2. 廣東藥科大學(xué)　基礎(chǔ)學(xué)院，廣東　廣州　510006)

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3種含氮雜環(huán)類藥物的手性色譜拆分及其制劑中對(duì)映體含量的測(cè)定

全思思1，陳智1，吳學(xué)昊1，湯遜尤1，淮文蓓1，張薇2，葉連寶1，范華均1*

(1. 廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006；2. 廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州510006)

采用纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)手性固定相，利用反相高效液相色譜法研究了奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮3種含氮雜環(huán)類手性藥物的色譜拆分行為?？疾炝肆鲃?dòng)相組成、pH值和柱溫對(duì)3種藥物對(duì)映體分離的影響，并對(duì)其拆分機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，采用甲醇-水為流動(dòng)相，通過(guò)添加醋酸或氨水調(diào)節(jié)pH值和控制柱溫，可使3種藥物的對(duì)映體得到完全分離(RS>1.5)，根據(jù)各自優(yōu)化的色譜條件建立了這3種手性藥物對(duì)映體的分析方法，并應(yīng)用于其制劑的含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)單、可靠。關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜法;含氮雜環(huán)類藥物;纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯);手性固定相;手性色譜拆分

奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮均屬于含氮雜環(huán)類藥物，在臨床上廣泛使用。其結(jié)構(gòu)中均含有1個(gè)手性碳原子，因而存在兩種手性對(duì)映體(圖1)。由于對(duì)映體之間存在明顯的藥理藥效和毒副作用差異，而臨床上因大量以外消旋體形式給藥，常引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)[1]。如奧沙西泮常用作焦慮、失眠癥、酒精戒斷以及精神抑郁的輔助用藥，但其S-對(duì)映體的活性比R-對(duì)映體高100～200倍[2];羅格列酮是治療糖尿病的藥物，其藥理作用主要由S-對(duì)映體產(chǎn)生，其R-對(duì)映體不僅藥效低，而且有較強(qiáng)的副作用[3-4];吡格列酮兩個(gè)對(duì)映體在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)過(guò)程具有立體選擇性[5]。近年來(lái)，手性色譜拆分方法迅速成為解決對(duì)映體分離和測(cè)定最有力的工具[6]，這對(duì)于手性藥物拆分及其藥理、毒副作用、代謝機(jī)制研究以及手性藥物質(zhì)量控制具有重要意義。在手性色譜法中以高效液相色譜(HPLC)應(yīng)用最廣，除了采用在流動(dòng)相中添加手性拆分劑以外，利用各種手性固定相(CSP)是更簡(jiǎn)便、高效的拆分方法[6-7]。Aso等[8]用N-(叔丁胺基羰基)-L-纈氨酰胺基丙基硅膠手性柱，研究了奧沙西泮對(duì)映體在水溶液中消旋化的動(dòng)力學(xué)行為;Vree等[9]用Chiral AGP蛋白質(zhì)手性柱對(duì)奧沙西泮和替馬西泮進(jìn)行了拆分。Chuong等[10]用Cyclobond-I-2000 SP環(huán)糊精衍生物手性固定相測(cè)定了奧沙西泮口服給藥后兔血漿中奧沙西泮對(duì)映體的濃度。近年來(lái)，以直連淀粉和纖維素為基質(zhì)的多糖手性固定相基于其多碳手性中心常被用于手性藥物的拆分[11]。Du[12]和高珊等[4]采用正相色譜(正己烷-異丙醇70∶30)在纖維素-3,5-二氯苯基氨基甲酸酯鍵合型手性柱上對(duì)吡格列酮或羅格列酮進(jìn)行了拆分，均取得良好的分離效果。Jamali等[13]分別用HPLC和CE法在不同pH值下研究了吡格列酮和羅格列酮的拆分效果，其中采用纖維素三(4-甲基苯甲酸酯)(CTMB)手性固定相的拆分效果不理想。He等[14]采用CTMB手性固定相在正相條件下拆分了奧沙西泮對(duì)映體，但分析時(shí)間長(zhǎng)，且不能完全分離。本文以甲醇-水為流動(dòng)相，在反相色譜條件下研究了奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮3種含氮雜環(huán)類手性藥物在CTMB 固定相上的手性色譜拆分行為，建立了這3種藥物對(duì)映體的分析方法。結(jié)果表明，以甲醇-水為流動(dòng)相，采用反相色譜法在CTMB手性固定相上可以拆分奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮的對(duì)映體，據(jù)此建立了測(cè)定這3種藥物制劑對(duì)映體含量的分析方法，結(jié)果較為滿意。

圖1　奧沙西泮、吡格列酮及羅格列酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chemical structures of oxazepam, pioglitazone and rosiglitazone

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司);DL-360A超聲清洗器(上海之信儀器有限公司);Shimadzu 2550 UV-Vis分光光度計(jì)。

奧沙西泮、鹽酸吡格列酮、羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，廣州全奧化工產(chǎn)品有限公司);奧沙西泮片(北京益民藥業(yè)有限公司);鹽酸吡格列酮片(天津武田藥品有限公司);羅格列酮鈉片(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司);無(wú)水乙醇、氨水(分析純，廣州化學(xué)試劑廠);甲醇(色譜純，德國(guó)默克公司);冰醋酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.2試液的配制

分別精密稱取一定量的奧沙西泮、鹽酸吡格列酮、羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇超聲溶解，并稀釋、定容，配制成400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)按需要逐級(jí)稀釋。

1.3色譜條件

色譜柱：Phenomenon Lux 5 μ Cellulose-3(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動(dòng)相由0.01%氨水或醋酸(用冰醋酸或氨水調(diào)節(jié)pH值)與不同比例的甲醇組成，使用時(shí)過(guò)0.22 μm濾膜，采用恒組成等度洗脫;紫外檢測(cè)器,奧沙西泮、鹽酸吡格列酮、羅格列酮的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為229，224，244 nm;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣體積20 μL。

2　結(jié)果與討論

2.1流動(dòng)相組成對(duì)手性分離的影響

根據(jù)3種含氮雜環(huán)類手性藥物的性質(zhì)，以甲醇-水為基礎(chǔ)溶劑，分別考察了不同比例的流動(dòng)相組成對(duì)3種藥物對(duì)映體分離的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著流動(dòng)相中甲醇比例的降低，奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮對(duì)映體的保留能力和選擇性提高，當(dāng)甲醇-水的體積比分別50∶50，70∶30和70∶30時(shí)，可將3種手性藥物的對(duì)映體完全拆分，其分離度Rs分別為2.02，2.67 和1.96。

表1　流動(dòng)相組成對(duì)3種含氮雜環(huán)類藥物對(duì)映體分離的影響Table 1　Effect of the composition of mobile phases on the separation of enantiomers for the three N-heterocyclic drugs

tR:retention time；Rs:resolution

2.2pH值對(duì)拆分的影響

對(duì)于含氮雜環(huán)化合物，由于N上的孤對(duì)電子易與H+發(fā)生作用，流動(dòng)相pH值會(huì)影響其存在形式，因此在手性柱的pH值耐受范圍內(nèi)，按上述流動(dòng)相組成以氨水和冰醋酸為介質(zhì)考察了pH值(4.0，6.0，8.0)對(duì)3種手性藥物對(duì)映體拆分的影響(圖2)。由圖2可知，隨著pH值的變化，奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮表現(xiàn)出不同的色譜行為。奧沙西泮和羅格列酮的對(duì)映體在中性和弱酸性條件下更易分離，而吡格列酮對(duì)映體的分離度則隨著pH值的減小而增大，但色譜峰更易拖尾，在pH 8.0時(shí)峰形最佳。這表明酸度控制在pH 6.0～8.0有利于3種含氮雜環(huán)化合物以合適的存在形式進(jìn)行分離。

圖2　pH值對(duì)奧沙西泮(A)、吡格列酮(B)、羅格列酮(C)對(duì)映體拆分的影響Fig.2　Effect of pH value on chiral separation of oxazepam(A), pioglitazone(B) and rosiglitazone(C)

2.3溫度對(duì)手性分離的影響

在上述合適的流動(dòng)相條件下，考察了柱溫對(duì)奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮各對(duì)映體拆分的影響，結(jié)果顯示，柱溫對(duì)奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮對(duì)映體的拆分有較大影響。溫度降低有利于提高奧沙西泮和吡格列酮的分離度，保留時(shí)間也隨之增加，但色譜峰拖尾加劇;而羅格列酮的分離度則隨著溫度升高而增大，且保留時(shí)間縮短，色譜峰形更好。故選擇奧沙西泮、鹽酸吡格列酮和羅格列酮對(duì)映體的拆分柱溫分別為25，30，40 ℃。

因此確定最佳色譜條件分別為：奧沙西泮：甲醇-0.01%醋酸溶液(50∶50，pH 6.0)，柱溫25 ℃;吡格列酮：甲醇-0.01%氨水溶液(60∶40，pH 8.0)，柱溫30 ℃;羅格列酮：甲醇-0.01%氨水溶液(65∶35，pH 8.0)，柱溫40 ℃。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮對(duì)映體的拆分分離度均大于1.5(圖3)，且峰形良好，能滿足分析要求。

圖3　奧沙西泮(A)、吡格列酮(B)和羅格列酮(C)對(duì)映體拆分的色譜圖Fig.3　HPLC chromatograms of the enantiomeric separation of oxazepam(A), pioglitazone(B) and rosiglitazone(C)

2.4色譜拆分機(jī)理的探討

色譜拆分結(jié)果表明，3種手性藥物在CTMB上的色譜保留能力依次為羅格列酮>吡格列酮>奧沙西泮，拆分能力則依次為吡格列酮>羅格列酮>奧沙西泮，保留作用大小并不能決定手性拆分能力[15]，而是取決于手性環(huán)境以及與目標(biāo)對(duì)映體的手性匹配作用。

根據(jù)“相互吸引-空間適應(yīng)”機(jī)理[16]：CSP中的纖維素為D(+)-吡喃型葡萄糖單元的聚合物，擁有5n個(gè)手性中心，在葡萄糖2,3,6位上苯甲酸酯衍生化后使極性小的藥物更易進(jìn)入其手性環(huán)境[17];奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮含有羰基或羥基等質(zhì)子給體或受體、電負(fù)性較大的N，O，S和Cl原子，以及含有富π電子的基團(tuán)，易于發(fā)生氫鍵作用、偶極-偶極相互作用及π-π鍵相互作用[5, 18-21]。但溫度對(duì)3種藥物手性拆分的影響不同：與奧沙西泮和吡格列酮相反，升高溫度(15～40 ℃)更易于羅格列酮在結(jié)構(gòu)上p-π共軛，有利于對(duì)映體與CSP作用，從而提高分離度[22-23]。

2.5線性范圍與檢出限

分別取適量的奧沙西泮、鹽酸吡格列酮和羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋，各配制成一系列不同濃度的溶液，按優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(ρ，μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按信噪比S/N≈3和S/N≈10分別計(jì)算其檢出限和定量下限(表2)。3種藥物對(duì)映體在5.0 ～ 40.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.998。檢出限為0.37～0.63 μg/mL；定量下限為1.18～2.03 μg/mL。

表2　3種含氮雜環(huán)類藥物的線性范圍、線性方程、檢出限和定量下限Table 2　Linear range, regression equation, detection limit and quantitation limit of the three N-heterocyclic chiral drugs(n=3)

*A:peak area;ρ:mass concentration(μg/mL)

2.6實(shí)際樣品的測(cè)定

分別取奧沙西泮、鹽酸吡格列酮和羅格列酮鈉片劑樣品適量，經(jīng)甲醇超聲溶解后，取上層清液過(guò)濾，按其各自優(yōu)化的色譜條件測(cè)定，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表3)。結(jié)果表明，上述3種手性藥物對(duì)映體的加標(biāo)回收率為94.6%～106.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.07%～1.0%，測(cè)得片劑外消旋體標(biāo)示含量在101.4%～107.7%之間。

表3　3種含氮雜環(huán)類藥物中對(duì)映體和消旋體含量的測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 3　Quantitation of enantiomers andracematesfor the three N-heterocyclic chiral drugs (n=3)

3　結(jié)　論

本文采用纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)手性固定相系統(tǒng)地研究了流動(dòng)相組成、pH值和柱溫對(duì)奧沙西泮、吡格列酮和羅格列酮對(duì)映體分離的影響，探討了其在CSP上的拆分機(jī)理。結(jié)果表明：以甲醇-水為流動(dòng)相，通過(guò)氨水和醋酸調(diào)節(jié)pH值，在CSP上實(shí)現(xiàn)了各對(duì)映體的色譜拆分。利用優(yōu)化的色譜條件可建立這3種含氮雜環(huán)手性藥物對(duì)映體的測(cè)定方法，并成功應(yīng)用于片劑中3種藥物對(duì)映體含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確。

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Chiral Separation and Determination of Enantiomers of Three N-Heterocyclic Drugs in Tablets by Revered Phase High Performance Liquid Chromatography

QUAN Si-si1, CHEN Zhi1, WU Xue-hao1, TANG Xun-you1, HUAI Wen-bei1, ZHANG Wei2, YE Lian-bao1, FAN Hua-jun1*

(1. School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou510006, China;2. School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou510006, China)

A novel method for the determination of enantiomers of three N-heterocyclic drugs was developed by revered phase high performance liquid chromatography using cellulose-tris-(4-methylbenzoate) as chiral stationary phase(CSP). Enantioseparation of oxazepam,pioglitazone and rosiglitazone on the CSP were performed by using mixture of methanol and water as mobile phase. Effects of methanol-water ratio,pH value and temperature on chiral separation of three drugs were investigated,respectively.The results showed that their enantiomers were separated on the CSP with methanol-0.01% acetic acid solution(50∶50) at 25 ℃ under pH 6.0 for oxazepam, methanol-0.01% ammonia solution(60∶40) at 30 ℃ under pH 8.0 for pioglitazone,and methanol-0.01% ammonia solution(65∶35) at 40 ℃ under pH 8.0 for rosiglitazone,respectively. The mechanism of racemic resolution for three drugs was discussed.The proposed method was successfully applied in the determination of three drugs enantiomers in commercial tablets,with recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 94.6% -106.2% and 0.07%-1.0%,respectively.It was proved to be simple,reliable and accurate.

reversed phase high performance liquid chromatography(HPLC)；N-heterocyclic chiral drugs;cellulose-tris(4-methylbenzoate)；chiral stationary phase(CSP);enantioseparation

2016-02-26；

2016-03-29

廣東省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012A080800012);廣東省科技發(fā)展專項(xiàng)基金項(xiàng)目(2016A040403119)

范華均，博士，教授，研究方向：藥物提取分離及藥物分析，Tel：020-39352135，E-mail：junhuafan@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.017

O657.72;TQ460.72

A

1004-4957(2016)09-1167-05