乳腺癌患者外周血GSTM1、GSTT1基因表達與多西紫杉醇化療效果的關(guān)系

胥軍，叢支亮，郭亮，牛學(xué)才，閆召華

(1濟南市槐蔭人民醫(yī)院，濟南 250021；2濟南市第四人民醫(yī)院)

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乳腺癌患者外周血GSTM1、GSTT1基因表達與多西紫杉醇化療效果的關(guān)系

胥軍1，叢支亮2，郭亮2，牛學(xué)才2，閆召華2

(1濟南市槐蔭人民醫(yī)院，濟南 250021；2濟南市第四人民醫(yī)院)

目的觀察乳腺癌患者外周血谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶M1(GSTM1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶T1(GSTT1)基因表達與多西紫杉醇化療效果的關(guān)系。方法乳腺癌患者300例，均采用多西紫杉醇化療，Multiplex-PCR檢測患者化療前外周血GSTM1、GSTT1基因，觀察GSTM1、GSTT1基因陽性與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系、患者化療效果及不良反應(yīng)。結(jié)果300例乳腺癌患者GSTM1基因陽性126例，GSTT1基因陽性222例。雌激素受體陽性乳腺癌患者GSTM1基因陽性率較雌激素受體陰性低(P<0.01)，雌激素受體陽性乳腺癌患者GSTT1基因陽性率較雌激素受體陰性低(P<0.05)。GSTM1基因陽性、陰性患者CR+PR分別為50、99例，兩者比較，P<0.05。GSTT1基因陽性、陰性患者CR+PR分別為93、56例，兩者比較，P<0.05。GSTM1基因陽性、陰性患者發(fā)生化療不良反應(yīng)情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，GSTT1基因陽性、陰性患者發(fā)生化療不良反應(yīng)情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論乳腺癌GSTM1和GSTT1基因表達陰性者接受多西紫杉醇化療效果好，且不增加不良反應(yīng)的發(fā)生。

乳腺癌；谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶M1；谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶T1；多西紫杉醇

研究表明，谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶M1(GSTM1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶T1(GSTT1)基因具有多態(tài)性，與藥物代謝酶的活力改變有關(guān)。多西紫杉醇是廣譜抗腫瘤藥物，對乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、白血病均有效，其中治療乳腺癌、肺癌效果顯著[1]。多西紫杉醇抗腫瘤的療效已經(jīng)得到多項大規(guī)模臨床試驗的證實,但不同患者對多西紫杉醇的應(yīng)答差異很大，在接受多西紫杉醇治療的患者中約有10%會發(fā)生過敏反應(yīng)，主要包括中性粒細胞減少、血紅蛋白減少、惡心嘔吐、疲勞、體液潴留等[2,3]。多西紫杉醇藥物作用過程涉及藥物代謝、轉(zhuǎn)運及作用靶點基因，其中一些遺傳多態(tài)性位點的單獨作用可能是微弱的，而很多位點的聯(lián)合與累積作用會導(dǎo)致藥物效應(yīng)產(chǎn)生較大差異[4]。不同個體對藥物的敏感性和不良反應(yīng)存在明顯差異，為減少臨床治療的盲目性，實行個體化給藥，開展多西紫杉醇藥物基因組學(xué)研究及其應(yīng)用非常必要[5]。本研究觀察了乳腺癌患者外周血GSTM1、GSTT1基因表達與多西紫杉醇化療效果的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2013年1月～2015年8月在濟南市第四人民醫(yī)院住院的乳腺癌患者300例。納入標準：術(shù)后經(jīng)病理形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)確診；采用多西紫杉醇化療；化療前美國東岸癌癥臨床研究合作組織(ECOG)評分0～2分；預(yù)計生存期>3個月；符合化療的指征和基本要求；知情同意。排除不能耐受化療者，已進行化療者，合并其他惡性腫瘤者。年齡40～67(56.9±13.8)歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移212例；TNM分期Ⅰ期62例、Ⅱ期70例、Ⅲ期36例、Ⅳ期132例；浸潤性導(dǎo)管癌238例，浸潤性小葉癌52例，其他10例。

1.2主要儀器及試劑紫外分光光度計(N2S，上海儀電分析儀器有限公司)；超凈工作臺(AIRTECH，蘇凈集團安泰公司)；臺式低溫高速冷凍離心機(3K3,Sigma,美國)；實時熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI step one plus，美國)；普通酶標儀(DG-3022，美國)；雜交Chamberll(Coming，美國);凝膠成像儀(CapitalBio；中國)；GeneChip?Scanner (Affymetrix，美國)。DNA Blood Kit D3392-01(美國OMEGA公司)；DNA Marker DM500(康為世紀生物科技有限公司)；5×TBE Buffer(康為世紀生物科技有限公司)；其他試劑均為本地產(chǎn)分析純試劑。

1.3GSTM1、GSTT1基因檢測方法化療前采取外周血5 mL于EDTA抗凝管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?50 μL解凍標本至經(jīng)高溫消毒滅菌的1.5 mL離心管，加入250 μL的OB蛋白酶和25 μL的BufferBL，充分混勻。65 ℃水浴，每隔5 min充分混勻1次。加入260 μL無水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)移至套在2 mL收集管的Hibind DNA柱子中，室溫離心(10 000 r/min×2 min)。將收集管轉(zhuǎn)移至干凈的收集管中，加入500 μL的HB Buffer，室溫離心(10 000 r/min×2 min)，棄去濾液。加入700 μL的DNA wash buffer，室溫離心(10 000 r/min×2 min)，棄去濾液，重復(fù)進行兩次。于1.5 mL離心管上，加入50 μL 65 ℃預(yù)熱的Elution buffer到柱子中央基質(zhì)上。靜置5 min，室溫離心(10 000 r/min×2 min)，保留洗脫液。采用微量分光光度儀進行DNA質(zhì)量鑒定。采用Multiplex-PCR檢測GSTM1和GSTT1基因。GSTM1和GSTT1基因PCR引物由上海西寶生物有限公司合成。GSTM1引物序列：上游5′-GAACTCCCTGAAA-AGCTAAAGC-3′，下游5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′。GSTT1引物序列：上游5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3′，下游5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′。以β-globin作為內(nèi)參，其引物序列：上游5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′，下游5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min起始模板預(yù)變性，循環(huán)1次；95 ℃ 45 s循環(huán)中模板變性；60 ℃ 20 s退火；72 ℃ 45 min延伸。反應(yīng)共循環(huán)45次。結(jié)果判斷：GSTM1和GSTT1非缺失基因型者的DNA樣品經(jīng)PCR擴增后分別產(chǎn)生215、480 bp片段，缺失基因型者無相應(yīng)的擴增條帶。

1.4多西紫杉醇化療療效及不良反應(yīng)判斷化療2個療程后，參照實體瘤療效評價標準評定療效：所有目標病灶消失，維持4周為CR；基線病灶長徑總和縮小≥30%，維持4周為PR；基線病灶長徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶為PD；基線病灶長徑總和有縮小但未達PR或有增加但未達PD為SD。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

300例乳腺癌患者GSTM1基因陽性126例，GSTT1基因陽性222例。雌激素受體陽性乳腺癌患者GSTM1基因陽性率較雌激素受體陰性低(P<0.01)，雌激素受體陽性乳腺癌患者GSTT1基因陽性率較雌激素受體陰性低(P<0.05)，見表1。GSTM1基因陽性、陰性患者CR+PR分別為50、99例，兩者比較，P<0.05。GSTT1基因陽性、陰性患者CR+PR分別為93、56例，兩者比較，P<0.05。GSTM1基因陽性、陰性患者發(fā)生化療不良反應(yīng)情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，GSTT1基因陽性、陰性患者發(fā)生化療不良反應(yīng)情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

3　討論

乳腺癌為女性常見惡性腫瘤，其患病率在世界范圍內(nèi)逐年增高，且具有發(fā)病率年輕化的趨勢，是嚴重威脅婦女健康及生命的主要疾病之一[6]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，乳腺癌患者的預(yù)后不斷改善，生存率不斷提高。多西紫杉醇是一種對乳腺癌很有效的新型化療藥物，已廣泛用于局部晚期以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療，顯著改善了乳腺癌患者的預(yù)后。既往研究發(fā)現(xiàn)了一些多西紫杉醇藥效相關(guān)基因標記，但多數(shù)局限于一個或者少數(shù)相關(guān)基因，而多西紫杉醇在體內(nèi)的作用過程涉及到多基因及多因素。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)是一種重要的Ⅱ相解毒酶，它可催化外來化合物與還原型谷胱甘肽結(jié)合，形成的結(jié)合物毒性下降且易于排出體外。因此，在保護細胞免受化學(xué)有害物的攻擊方面具有重要的作用[7]。GSTM1和GSTT1是GST家族成員，兩者均對外源性化學(xué)物質(zhì)有解毒的功能，而兩者的純合子缺失變異基因型被證實失去酶活性[8]。GSTM1基因長約12 950 kb，位于1p13.3，編碼中性的GST-u同工酶，在乳腺、肝臟、腦組織、胃腸組織中均有表達，是煙草誘導(dǎo)致癌作用的遺傳易感性標志物。GSTT1基因長約12 090 kb，位于22q11.2，編碼堿性的GST-θ同工酶，在肝臟和紅細胞中均有表達[9]。GSTM1和GSTT1基因表達產(chǎn)物可防御內(nèi)外源性毒性物質(zhì)對細胞的損傷[10]。本研究結(jié)果表明，乳腺癌患者GSTM1和GSTT1基因表達與雌激素受體表達有關(guān)，GSTT1、GSTM1基因缺失可能降低了雌激素?zé)o活性代謝進程。乳腺癌是激素依賴性腫瘤，雌激素的代謝產(chǎn)物可與DNA結(jié)合形成加合物直接引起基因改變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[11]。可見，GSTT1、GSTM1基因缺失可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，GSTM1基因陰性患者療效高于GSTM1陽性患者，GSTT1基因陰性患者療效高于GSTT1陽性患者，推測原因為GSTM1、GSTT1基因缺失導(dǎo)致GST-u同工酶和GST-θ同工酶不能表達，使多西紫杉醇的有效濃度提高。且本研究發(fā)現(xiàn)GSTM1和GSTT1基因與多西紫杉醇化療不良反應(yīng)均無關(guān)。

表1　　　　GSTM1、GSTT1基因陽性與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

表2　　　　GSTM1、GSTT1基因與多西紫杉醇化療不良反應(yīng)的關(guān)系(例)

綜上所述，乳腺癌GSTM1和GSTT1基因表達陰性者接受多西紫杉醇化療效果好，且不增加不良反應(yīng)的發(fā)生。

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濟南市科技計劃項目(201401072)。

閆召華(E-mail： Yanzhaohua70@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.031

R737.9

B

1002-266X(2016)23-0090-03

2015-12-03)