微小RNA mir-145在乳腺癌細胞中調(diào)控Nanog的機制與功能研究

駱啟聰，張　環(huán)，陳蓉珊，陳　剛，米彥軍

(廈門大學附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361003)

?

微小RNA mir-145在乳腺癌細胞中調(diào)控Nanog的機制與功能研究

駱啟聰，張環(huán)，陳蓉珊，陳剛，米彥軍

(廈門大學附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361003)

目的：探討mir-145在乳腺癌細胞中對Nanog的調(diào)控作用及功能.方法：采用熒光定量PCR檢測乳腺癌細胞系中mir-145與Nanog表達水平，利用流式細胞術比較不同乳腺癌細胞系中腫瘤干細胞比例，懸浮培養(yǎng)瘤球并比較瘤球與貼壁細胞間mir-145、Nanog的表達差異，過表達mir-145后檢測Nanog表達水平與報告基因活性，流式細胞術檢測mir-145表達升高后乳腺癌干細胞比例，平板克隆形成實驗檢測mir-145表達升高后乳腺癌細胞成瘤能力.結果：T-47D細胞表達高水平的mir-145和低水平的Nanog，MDA-MB231表達低水平的mir-145和高水平的Nanog，MDA-MB231細胞乳腺癌干細胞比例高于T-47D細胞，瘤球細胞中的mir-145表達水平低于貼壁細胞，而Nanog表達水平高于貼壁細胞.過表達mir145降低Nanog表達水平與報告基因活性，降低乳腺癌干細胞比例與平板克隆形成能力.結論：mir-145能夠調(diào)控Nanog表達水平，影響乳腺癌細胞干細胞特性.

乳腺癌；Nanog；mir-145；腫瘤干細胞

在中國癌癥已成為非常重要的公共健康問題，癌癥發(fā)病率和死亡率不斷攀升，已成為疾病死因之首.乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，已成為威脅女性健康的主要惡性腫瘤，而且乳腺癌死亡率有升高趨勢[1].經(jīng)過術后標準治療后的乳腺癌，仍有約30%患者最終出現(xiàn)復發(fā)轉移，既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞在此過程中發(fā)揮重要作用.

腫瘤干細胞是腫瘤內(nèi)部一小部分具有特殊標記的細胞，具有自我更新、無限增殖和多向分化的能力，對常規(guī)化療藥物和放療有更強的耐受能力，能夠轉移、形成新的腫瘤，是腫瘤復發(fā)的主要原因[2].腫瘤干細胞的特征包括表達多潛能基因(Oct4、Sox2、Nanog)、能夠自我更新、形成瘤球和耐藥性等[3].

多潛能基因Nanog是維持胚胎干細胞自我更新和增殖的轉錄因子，在多種惡性腫瘤中表達異常，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4].Nanog表達水平高的乳腺癌病人預后差，可作為三陰性乳腺癌病人的預后因素[5].近年來對Nanog等多潛能基因的研究已成為熱點，但對Nanog等因子的調(diào)控機制研究較少.本研究通過研究miR145 在乳腺癌中對Nanog表達的調(diào)控機制，為今后開發(fā)乳腺癌新的治療措施提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

乳腺癌細胞系MDA-MB231、T47D購自中科院上海細胞庫，DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基、B-27、EGF、bFGF、insulin、胎牛血清購自Gibco，miRNA逆轉錄試劑盒與檢測試劑盒購自Qiagen，逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自東洋坊.

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞系MDA-MB231、T47D在10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當細胞長滿細胞培養(yǎng)皿底80% ～ 90% 時，進行傳代，傳代時吸除培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液洗2 次，0.5 mL 0.25%胰酶進行消化，0.5 mL完全培養(yǎng)基中和胰酶消化液后，1, 200 × g 離心4 min，棄上清，加入培養(yǎng)基吹散細胞.根據(jù)實驗需要，將細胞接種于不同規(guī)格的培養(yǎng)板中進行培養(yǎng).

1.2.2微球體培養(yǎng)

微球體培養(yǎng)富集乳腺癌干細胞參照文獻報道的方法進行[6,7].收集處于對數(shù)生長期的T-47D、MDA-MB231 乳腺癌細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，PBS 緩沖液洗2 次后離心并細胞計數(shù)，加入瘤球培養(yǎng)基[EGF(20 ng /mL)、bFGF(10ng /mL)、胰島素(5 μg /mL)和1×B-27 的DMEM/F12 培養(yǎng)基]重懸，使細胞密度為1×103個/mL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，每2日加入100μL新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至1 周時，300 × g離心5 min 收集微球體，用于后續(xù)實驗.

1.2.3細胞轉染與感染

細胞轉染：T-47D細胞和MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，過夜后分別用Lip3000將質(zhì)粒DNA、miRNA mimics轉染入T-47D和MDA-MB-231細胞，轉染6小時后換液.37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).轉染過程按Lipofectamine3000說明書進行.

病毒包裝：293T細胞接種于6cm皿中，過夜后用6μg pLV-mir145質(zhì)粒、3μg pSPAX2質(zhì)粒、1μg pMD2.G質(zhì)粒轉染，轉染后6小時換液，37 ℃孵箱中培養(yǎng)48小時后收集上清并測量滴度.

病毒感染：將對數(shù)生長期的T-47D、MDA-MB231 細胞接種于6 孔板中(10×105/孔)，用慢病毒(滴度：1.5×105～2.3×105TU/mL)感染細胞，實驗分轉染組及陰性對照組，每組設3 個復孔，培養(yǎng)24 h 后，轉為完全培養(yǎng)液培養(yǎng).感染72 h 后，加入嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉細胞.

1.2.4總RNA提取及熒光定量PCR檢測

總RNA的提?。翰捎肨rizol試劑提取，操作按照說明書進行.

逆轉錄反應：miRNA逆轉錄按miScript Reverse Transcription Kit說明書配置逆轉錄反應體系20μL，含4μLmiScript RT Buffer，1μL miScript Reverse Transcriptase Mix，1μg Total RNA.逆轉錄反應條件為37℃ 60min，95℃ 5min.mRNA基因逆轉錄按東洋坊ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書進行.

實時熒光定量PCR：miRNA的檢測按miScript SYBR Green PCR Kit說明書進行.Mir145與U6引物序列購買自北京天根生物科技有限公司.20μL體系中含10μL QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(2×)，2μL miScript Universal Primer(10×)，2μL mir145引物或U6引物，2μL逆轉錄產(chǎn)物.反應條件為95℃預變性15min，1個循環(huán)；94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，40個循環(huán).mRNA的檢測按東洋坊Realtime PCR Master Mix說明書進行.

反應在羅氏480熒光定量PCR儀上進行.利用儀器上自帶的系統(tǒng)軟件分析，可觀察擴增曲線和熔解曲線，并對cDNA的含量進行定量分析，計算樣本的△△Ct值.通過2-△△Ct方法分析基因的相對表達情況.

1.2.5報告基因檢測

以5×104細胞/孔的接種量將細胞接種于24孔板中，24h后采用脂質(zhì)體轉染法將所需的各種DNA，包括mir145表達或抑制質(zhì)粒、熒光素酶報告基因和β-半乳糖苷酶表達質(zhì)粒共轉入細胞中轉染6小時后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液后，細胞用PBS洗一次，之后加100ul裂解液(50mM Tris，0.1% TritonX-100，1mM DTT，pH7.4)，4℃放置10min后，刮下，收集，13000rpm離心5min后取上清110μL).將30μL細胞裂解液與120μL β-半乳糖苷酶測定液混合，于37℃孵育至黃色出現(xiàn)為止，加入80μL 1M Na2CO3終止反應，于酶標儀410nm測吸收值，以此作為β-半乳糖苷酶的相對活性，用于內(nèi)對照，以標定轉染效率.將70μL細胞裂解液與20μL熒光素酶檢測試劑混勻,立即用SPECTR FLUOR plus 檢測發(fā)出的熒光信號.該熒光信號與相應的β-半乳糖苷酶OD值之比標定后的LUC相對活性.

2　結果

2.1乳腺癌細胞中mir-145表達水平與干細胞特性具有相關性

通過檢測乳腺癌細胞系T-47D、MDA-MB231細胞中mir-145、Nanog表達水平與乳腺癌干細胞比例(圖1)，發(fā)現(xiàn)mir-145在T-47D細胞中的表達水平是MDA-MB231細胞的3.54倍(p<0.05),而Nanog在T47D細胞中的表達水平只有MDA-MB231細胞的20%(p<0.05)(圖1 A).流式細胞術檢測乳腺癌干細胞比例發(fā)現(xiàn)(圖1 B )，T-47D細胞中乳腺癌干細胞比例(0.13%)遠少于MDA-MB231細胞中的乳腺癌干細胞比例(77.39%)，具有顯著性差異(p<0.01).為進一步研究mir-145與Nanog在乳腺癌干細胞中的表達相關性，利用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)富集乳腺癌干細胞，通過熒光定量PCR檢測mir-145與Nanog的表達水平(圖1 C).相比較與貼壁細胞中的表達量，mir-145在瘤球中的表達水平均低于貼壁細胞中的表達水平，具有顯著性差異(p<0.05).

圖1　mir-145與Nanog表達相關性及與干細胞特性的關系

2.2mir-145對Nanog的調(diào)控機制

通過生物信息學工具網(wǎng)站MirTarBase檢索mir-145的靶基因，發(fā)現(xiàn)Nanog基因的3’-UTR上存在潛在的mir-145結合位點(圖2 A).雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果顯示(圖2 B)，在293T細胞中，mir-145-mimics轉染組與Control組相比，mir-145過表達能夠顯著抑制包含Nanog 3’UTR 的螢火蟲熒光素酶報告基因的活性(p< 0.05)；當Nanog 3’UTR中的miR-145 結合位點發(fā)生突變后，mir-145過表達對報告基因的抑制作用消失，即mir-145-mimics轉染組與Control組相比的差異無統(tǒng)計學意義(圖2 B).在乳腺癌細胞T-47D中過表達mir-145 mimics后熒光定量PCR檢測Nanog表達水平， mir-145 mimics轉染組與Control組相比，mir-145 過表達進一步降低Nanog表達水平(圖2 C).以上結果充分說明，mir-145 是通過與Nanog 基因的3’UTR 相互作用，負調(diào)控靶基因Nanog的表達.

圖2　mir-145靶向調(diào)控Nanog基因表達

2.3mir-145調(diào)控Nanog影響乳腺癌干細胞特性

通過流式細胞術與平板克隆形成實驗檢測mir-145表達水平對乳腺癌干細胞特性的影響，結果顯示，乳腺癌細胞系MDA-MB231細胞中過表達mir-145后乳腺癌干細胞群(CD24-CD44+)比例降低(圖3 A)，差異具有顯著意義(p< 0.05).平板克隆實驗結果也證實(圖3 B)，MDA-MB231細胞中過表達mir-145后，形成的克隆數(shù)量降低，差異具有顯著意義(p< 0.05).

圖3　mir-145影響乳腺癌干細胞特性

3　討論

Nanog作為轉錄因子在維持胚胎干細胞多潛能性過程中發(fā)揮重要作用[8]，雖然在成體組織中不表達，但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9,10]，在乳腺癌中Nanog高表達與乳腺癌患者預后不良相關，激活MDR1基因表達誘導乳腺癌細胞耐藥[11].在MCF7細胞及MDA-MB231細胞中免疫染色發(fā)現(xiàn)Nanog只在一小部分細胞中表達[12].這與腫瘤干細胞所占比例相符.研究發(fā)現(xiàn)在MCF7細胞中過表達Nanog引起乳腺癌干細胞群的擴展[13].另外，在乳腺癌細胞中抑制Nanog引起細胞增殖減慢、克隆形成減少以及轉移能力減弱[4].最新研究發(fā)現(xiàn)采用TALEN和CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除Nanog基因具有抑制腫瘤生長、轉移和增強化療敏感度的效果[14,15]，Nanog基因敲除、抑制Nanog表達及功能可單獨或協(xié)同發(fā)揮腫瘤治療性作用[16]，提示Nanog可作為腫瘤治療的潛在靶點.然而目前對腫瘤細胞中Nanog基因異常激活和調(diào)控的分子機制尚未完全闡明.對這些關鍵問題研究的不斷深入，將為全面揭示Nanog在腫瘤中的作用提供更多的實驗證據(jù)，同時也為腫瘤分子診斷和靶向治療提供新的思路和方法.

microRNAs 是哺乳動物體內(nèi)普遍存在的一類非編碼小分子RNA，具有重要的基因調(diào)節(jié)作用，在腫瘤干細胞中同樣發(fā)揮重要作用.我們的研究發(fā)現(xiàn)mir-145能夠調(diào)控干細胞多能基因Nanog，并體現(xiàn)為乳腺癌干細胞特性的改變，可用于乳腺癌的治療.miRNA mimic 是一種化學合成的RNA 寡核苷酸，可模擬內(nèi)源miRNA，提高細胞內(nèi)miRNA 水平，增強miRNA 的功能.通過將mir-145 mimics 導入乳腺癌細胞中，可能降低乳腺癌病人耐藥風險、轉移和復發(fā)的幾率，提高患者生存率.基于脂質(zhì)體技術平臺的miRNA藥物輸送技術已進行臨床試驗，對實體瘤患者進行嘗試性治療.這一技術可以使得miRNA類藥物到達人體內(nèi)部的組織.而外泌體由于其在血液中的穩(wěn)定性與靶向性，將可能成為新一代的藥物輸送平臺.將mir-145包裝在外泌體中，通過外泌體膜表面的特異蛋白靶向乳腺癌干細胞，將有可能徹底消滅乳腺癌干細胞，達到完全治愈乳腺癌患者的目標.

[1]Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,(2):115-132.

[2]Yu Z, Pestell T G, Lisanti M P, et al. Cancer stem cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2012,44:2144-2151.

[3]Prud'homme G J. Cancer stem cells and novel targets for antitumor strategies[J]. Curr Pharm Des, 2012,(19):2838-2849.

[4]Han J, Zhang F, Yu M, et al. RNA interference-mediated silencing of NANOG reduces cell proliferation and induces G0/G1 cell cycle arrest in breast cancer cells[J]. Cancer Lett, 2012,(1):80-88.

[5]Nagata T, Shimada Y, Sekine S, et al. KLF4 and NANOG are prognostic biomarkers for triple-negative breast cancer[J]. Breast Cancer, 2016:1-10.

[6]Zhang F, Song C, Ma Y, et al. Effect of fibroblasts on breast cancer cell mammosphere formation and regulation of stem cell-related gene expression[J]. Int J Mol Med, 2011,(3):365-371.

[7]Feifei N, Mingzhi Z, Yanyun Z, et al. MicroRNA expression analysis of mammospheres cultured from human breast cancers[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012,(11):1937-1944.

[8]Rodda D J, Chew J L, Lim L H, et al. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2[J]. J Biol Chem, 2005,280:24731-24737.

[9]Siu M K, Wong E S, Chan H Y, et al. Overexpression of NANOG in gestational trophoblastic diseases: Effect on apoptosis, cell invasion, and clinical outcome[J]. Am J Pathol, 2008,(4):1165-1172.

[10]Jeter C R, Badeaux M, Choy G, et al. Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates human tumor development[J]. Stem Cells, 2009,(5):993-1005.

[11]Bourguignon L Y, Peyrollier K, Xia W, et al. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells[J]. J Biol Chem, 2008,(25):17635-17651.

[12]Ling G, Chen D, Wang B, et al. Expression of the pluripotency markers Oct3/4, Nanog and Sox2 in human breast cancer cell lines[J]. Oncol Lett, 2012,(6):1264-1268.

[13]Liao W, Liaw C, Huang Y, et al.Cyclohexylmethyl flavonoids suppress propagation of breast cancer stem cells via downregulation of NANOG[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013,2013:170261.

[14]Ding Y, Yu A, Li C, et al. TALEN-mediated Nanog disruption results in less invasiveness, more chemosensitivity and reversal of EMT in Hela cells[J]. Oncotarget,2014,(18):8393-8401.

[15]Kawamura N, Nimura K, Nagano H, et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout of NANOG and NANOGP8 decreases the malignant potential of prostate cancer cells[J]. Oncotarget, 2015,(26):22361-22374.

[16]Noh K H, Lee Y H, Jeon J H, et al. Cancer vaccination drives Nanog-dependent evolution of tumor cells toward an immune-resistant and stem-like phenotype[J]. Cancer Res, 2012, (7): 1717-1727.Mechanism and Function of mir-145 on Regulating Nanog in Breast Cancer Cells

(責任編校：晴川)

LUO Qicong, ZHANG Huan, CHEN Rongshan, CHEN Gang, MI Yanjun

(The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen Fujian 361003, China)

Objective: To investigate the mechanism and function of mir-145 on regulating Nanog in breast cancer cells．Methods: Comparing the expression levels of mir-145 and Nanog of breast cancer cells using Real-Time PCR, comparing the population of cancer stem cells via FACS assay, and culturing and detecting the expression level of mir-145 and Nanog in breast cancer sphere. Breast cancer cells were transfected with mir-145 mimic. Fluorescent quantitative PCR was used to determine mir-145 and Nanog mRNA expression and dual reporter assay was used to determine Nanog protein expression．Results: T-47D cell expressed higher level of mir-145, lower level of Nanog, and smaller population of breast cancer stem cells, while MDA-MB231 cell expressed lower level of mir-145, higher level of Nanog, and larger population of breast cancer stem cells. The mir-145 expression level was lower in sphere and Nanog was higher in sphere comparing to adherent cells. The mir-145 overexpression in breast cancer cells inhibited Nanog mRNA and protein expression and reduced the stem cell population and colony-formation ability. Conclusion: mir-145 can regulate Nanog expression and reverse stemness of breast cencer cells.

breast carcinoma; Nanog; mir-145; cancer stem cell

2016-09-13

廈門科技惠民計劃項目(批準號：3502Z20134005).

駱啟聰(1983— )，男，福建泉州人，廈門大學附屬第一醫(yī)院助理研究員，博士.研究方向：腫瘤細胞生物學.

Q756

A

1008-4681(2016)05-0010-04