PAX8、WT-1、HER2在不同轉(zhuǎn)移方式的晚期卵巢上皮性癌中的差異表達(dá)

王麗麗郭紅燕張雪輝張馨田

PAX8、WT-1、HER2在不同轉(zhuǎn)移方式的晚期卵巢上皮性癌中的差異表達(dá)

王麗麗①郭紅燕②張雪輝①?gòu)堒疤铫?/p>

目的：探討PAX8、WT-1、HER2在不同轉(zhuǎn)移方式的晚期卵巢上皮性癌中的表達(dá)差異，為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。方法：收集臨床樣本，按照轉(zhuǎn)移方式分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組1例、混合轉(zhuǎn)移組14例和盆腹腔轉(zhuǎn)移組5例。采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測(cè)PAX8、WT-1、HER2在20例不同轉(zhuǎn)移方式的晚期卵巢上皮性癌中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：PAX8、WT-1、HER2在20例患者中均有表達(dá)；混合轉(zhuǎn)移組PAX8、WT-1、HER2基因表達(dá)高于盆腹腔轉(zhuǎn)移組。結(jié)論：PAX8、WT-1、HER2基因的表達(dá)可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移方式有關(guān)，可能成為提示預(yù)后的基因指標(biāo)并對(duì)臨床有一定提示作用，但仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

PAX8； WT-1； HER2； 晚期卵巢上皮性癌； 差異表達(dá)

First-author's address：Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China

卵巢上皮性癌是全球致死率最高的婦科惡性腫瘤之一，多見(jiàn)于中老年婦女，目前手術(shù)及化療是其一線治療方案。盡管手術(shù)技術(shù)不斷提高，化療藥物不斷更新，卵巢上皮性癌患者的預(yù)后卻仍未得到顯著改善，原因主要是卵巢的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)。卵巢癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，70%～80%的患者確診時(shí)已是晚期，而晚期病例往往缺乏有效的治療手段，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其死亡的主要原因［1］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)這與卵巢上皮性癌的異質(zhì)性有關(guān)，異質(zhì)性在臨床上的體現(xiàn)主要是：即使是相同組織學(xué)類型的晚期卵巢上皮性癌，轉(zhuǎn)移途徑卻截然不同，如部分病例以盆腹腔廣泛播散轉(zhuǎn)移為主，淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移；部分病例已出現(xiàn)廣泛的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但盆腹腔無(wú)廣泛的播散灶；另一些患者盆腹腔及淋巴結(jié)均可見(jiàn)廣泛的腫瘤轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)PAX8、WT-1、HER2三種基因與卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本文旨在探討PAX8、WT-1、HER2在不同轉(zhuǎn)移類型的晚期卵巢上皮性癌中的表達(dá)含量的差異，從而為臨床的診斷、治療、預(yù)后評(píng)估提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集北京大學(xué)第三醫(yī)院臨床病理診斷為Ⅲ期和Ⅳ期的20例卵巢上皮性癌患者的組織標(biāo)本，并將其分為三組：其中僅1例患者只出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，病灶局限在盆腔，無(wú)腹腔轉(zhuǎn)移（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組）；14例患者盆腹腔和淋巴結(jié)均有轉(zhuǎn)移（混合轉(zhuǎn)移組）；5例患者盆腹腔廣泛轉(zhuǎn)移，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為陰性（盆腹腔轉(zhuǎn)移組）。其中年齡≤45歲者6例，＞45歲者共14例；20例患者的組織病理學(xué)類型均為漿液性癌；除淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中1例患者為ⅢA1期外，其余均為ⅢA1期以上，其中ⅢA2期1例，ⅢB期5例，ⅢC期和Ⅳ期有13例；3例患者病理學(xué)分級(jí)為低級(jí)別，余17例為高級(jí)別。

1.2 主要生化試劑

1.2.1 化學(xué)試劑 包括Trizol、DEPC、瓊脂糖、溴酚藍(lán)、溴化乙錠、三氯甲烷、無(wú)水乙醇、異丙醇。

1.2.2 分子量標(biāo)準(zhǔn) Maker Ⅴ。

1.2.3 試劑盒 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（購(gòu)自Thermo公司），IQTMSYBR Green Supermix（購(gòu)自Bio-rad公司）。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成 普通引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由北京奧科公司合成；Realtime PCR引物由Takara公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2.5 主要儀器 微量低溫高速離心機(jī)（Biofuge Stratos）購(gòu)自Heraeus Instrument公司，凝膠成像分析系統(tǒng)（Gel Doc 2000）購(gòu)自Bio-Rad公司，MyCycler?PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司，高壓蒸汽消毒器購(gòu)自SANYO公司，Bio-rad Minioption PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 提取組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 本實(shí)驗(yàn)采用Trizol試劑（購(gòu)自Invitrogen公司）提取卵巢癌組織中的總RNA，并用紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度及純度，最后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（購(gòu)自Thermo公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.2 檢測(cè)PAX8、WT-1、HER2的相對(duì)表達(dá)量 筆者采用Real-time PCR方法進(jìn)一步檢測(cè)PAX8、WT-1、HER2三種基因在這20例卵巢上皮性癌患者的卵巢癌組織中的cDNA相對(duì)表達(dá)量，選定β-actin作為內(nèi)參基因，從而計(jì)算目標(biāo)基金相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)過(guò)程和數(shù)據(jù)分析均于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理系實(shí)驗(yàn)室完成，引物合成由Takara公司完成，引物序列和PCR反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)在Bio-rad Minioption PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）儀中進(jìn)行，反應(yīng)體系如下：

Antisense primer PAX8CACTCCATTTGCTTGGCTCTTGGTGGTGCTATACCTTCACAG WT1TACCCAGGCTGCAATAAGAGATATTTTAAGCCTTTGGTGTCTTTTGAGCTGGTC HER2ATGAGCTACCTGGAGGATGTCCAGCCCGAAGTCTGTAATTT β-actinTCCACGAAACTACCTTCAACTCGGCAATGCCAGGGTACAT PCR conditions 95℃×5 min，40 cycles of 95 ℃×5 s，58 ℃×15 s GeneSense primer

ComponentVolume（μL）Primer（Forward and reverse）2 SYBR Green master mix（購(gòu)自Bio-rad公司）10 cDNA2 ddH2O6

2 結(jié)果

2.1 三組患者PAX8、WT-1、HER2基因表達(dá)分布情況比較 PAX8、WT-1、HER2三種基因在20例患者中均有表達(dá)，表達(dá)分布如圖1。

2.2 PAX8、WT-1、HER2在盆腹腔轉(zhuǎn)移組和混合轉(zhuǎn)移組中差異表達(dá) 由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組僅有1例，易導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)，故進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)未列入比較?；旌限D(zhuǎn)移組中三種基因的表達(dá)均高于盆腹腔轉(zhuǎn)移組，在混合轉(zhuǎn)移組中，HER2基因的表達(dá)量約為盆腹腔轉(zhuǎn)移組的3.5倍，PAX-8基因的表達(dá)量約為盆腹腔轉(zhuǎn)移組的2.5倍，而WT-1基因的表達(dá)量約為盆腹腔轉(zhuǎn)移組的2倍，見(jiàn)圖2。

3 討論

PAX8基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子配對(duì)盒基因家族，PAX家族蛋白是均由128個(gè)氨基酸形成的高度保守區(qū)域，該配對(duì)盒可識(shí)別特異DNA結(jié)合部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，控制基因調(diào)節(jié)?，F(xiàn)已證明，PAX8在胚胎發(fā)育中具有重要作用，尤其是對(duì)甲狀腺、腎臟、Wolffian管和Mullerian管的形成起關(guān)鍵作用，但在胚胎成熟后，PAX8的表達(dá)量大幅減少。

圖1 三組PAX8、WT-1、HER2基因表達(dá)分布

圖2 PAX8、WT-1、HER2在盆腹腔轉(zhuǎn)移組和混合轉(zhuǎn)移組中差異表達(dá)

有研究表明，在某些癌癥細(xì)胞中，PAX8的表達(dá)量較高，如原發(fā)性及轉(zhuǎn)移性卵巢上皮性腫瘤［2-3］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PAX8在卵巢漿液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞癌及卵巢上皮包涵囊腫中存在高表達(dá)，可以用于區(qū)分漿液性卵巢癌與惡性間皮瘤，也可以區(qū)分卵巢癌與乳腺癌［4-5］。另外，有報(bào)道證實(shí)PAX8對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖中起關(guān)鍵性作用，在16%的原發(fā)性卵巢腫瘤中擴(kuò)增，有望成為治療卵巢癌的藥物靶點(diǎn)［6-7］。

WT-1基因位于人11號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶，長(zhǎng)約50 kb，有10個(gè)外顯子，富含“GC”同源序列。WT-1基因是在對(duì)遺傳腎臟胚胎腫瘤（Wilm's tumor）的分子遺傳學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的，并最先在腎母細(xì)胞癌中被定義為抑癌基因，但近來(lái)的研究表明它也有癌基因的作用，同時(shí)WT-1基因也可以激活某些基因的轉(zhuǎn)錄［8］。WT-1基因的正常功能是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制其過(guò)分增殖，當(dāng)WT1基因發(fā)生突變、缺失或失活，則失去調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。WT-1基因編碼的蛋白也具有極為復(fù)雜的生理功能，它同時(shí)具有活化和抑制的雙重作用，在多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起著重要作用［9］。

文獻(xiàn)［10］報(bào)道，WT-1在卵巢漿液性乳頭狀癌的陽(yáng)性表達(dá)率高，而在卵巢子宮內(nèi)膜樣癌和大多數(shù)子宮內(nèi)膜漿液性乳頭狀癌表達(dá)則呈陰性，這可能對(duì)卵巢上皮性癌的分類診斷有所幫助。Goldstein等［11］在30例卵巢漿液性乳頭狀癌中研究發(fā)現(xiàn)有29例WT-1陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為97%，而18例子宮內(nèi)膜漿液性乳頭狀癌WT-1均為陰性。亦有研究表明，WT-1基因在52/67（93%）的卵巢漿液性癌中都有表達(dá)，但在粘液性癌、子宮內(nèi)膜癌和透明細(xì)胞癌中并沒(méi)有觀察到此現(xiàn)象。另外WT-1表達(dá)與卵巢漿液性癌的分級(jí)和分期有關(guān)［12］。以上均說(shuō)明WT-1基因可以作為診斷漿液性卵巢癌和判斷漿液性卵巢癌分期分級(jí)的指標(biāo)。

HER2即c-erbB-2基因編碼的跨膜受體樣蛋白，是表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）家族的成員之一。HER2基因在正常情況下處于非激活狀態(tài)，當(dāng)受到體內(nèi)外某些因素作用后，該基因被異常激活，HER2蛋白異常高表達(dá)，進(jìn)而引起瀑布式的連鎖反應(yīng)，啟動(dòng)胞內(nèi)異常增殖的傳導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和遷移，從而誘發(fā)腫瘤形成。一方面，HER2與其他受體結(jié)合成異二聚體后能發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能；另一方面，HER2的異二聚體使EGFR在細(xì)胞膜過(guò)表達(dá)，加速了細(xì)胞的增殖，以上兩點(diǎn)與HER2在腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)、侵犯和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

有研究表明，15%～30%的卵巢癌在HER2/neu蛋白過(guò)度表達(dá)，HER2/neu蛋白過(guò)度表達(dá)與卵巢癌患者較短存活期呈負(fù)相關(guān)，可作為預(yù)后因素，HER2的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［13-14］。Suo等［15］發(fā)現(xiàn)HER2蛋白表達(dá)水平高低與卵巢癌的分化程度關(guān)系密切，在多數(shù)低分化的卵巢癌組織中HER2的表達(dá)水平較高。文獻(xiàn)［16-17］對(duì)164例晚期卵巢癌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中HER2過(guò)表達(dá)率為16%，但未發(fā)現(xiàn)HER2過(guò)表達(dá)與臨床病理參數(shù)、組織學(xué)類型及病理分期有相關(guān)性。經(jīng)上述研究提示：PAX8、WT-1、HER2與卵巢上皮性癌本身特征和浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，故筆者選取上述三種基因分別分析在不同轉(zhuǎn)移方式的Ⅲ期和Ⅳ期卵巢上皮性癌中的表達(dá)差異。

本文研究結(jié)果表明：PAX8、WT-1、HER2三種基因在20例患者中均有表達(dá)；混合轉(zhuǎn)移組中三種基因的表達(dá)含量均高于盆腹腔轉(zhuǎn)移組，其中HER2基因的表達(dá)量約為盆腹腔轉(zhuǎn)移組的3.5倍，PAX-8基因的表達(dá)量約為盆腹腔轉(zhuǎn)移組的2.5倍，而WT-1基因的表達(dá)量約為盆腹腔轉(zhuǎn)移組的2倍。這對(duì)于臨床工作具有一定的提示作用：PAX8、WT-1、HER2基因表達(dá)與晚期卵巢上皮性癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為提示預(yù)后情況的基因指標(biāo)，并且通過(guò)檢測(cè)基因表達(dá)的含量可能為手術(shù)方式的選擇提供一定的參考。但是由于所收集的病例數(shù)較少，在分析混合轉(zhuǎn)移組和盆腹腔轉(zhuǎn)移組的PAX8、WT1、HER2基因相對(duì)表達(dá)量時(shí)，兩者之間并沒(méi)有出現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組只有1例，為了避免統(tǒng)計(jì)誤差的出現(xiàn)未將其納入研究，所以筆者無(wú)法分析只有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，病灶局限在盆腔這類患者的基因相對(duì)表達(dá)量與其他兩組的差異。然而，本次研究只是作為基礎(chǔ)研究的一次初試，并且已經(jīng)顯示出了一定的臨床價(jià)值，以后將收集更多的組織樣本分析不同轉(zhuǎn)移方式晚期卵巢上皮性癌中三種基因的差異表達(dá)，還要在早期卵巢上皮性癌患者以及正常卵巢組織中進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，以期找到新的可靠的卵巢腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述，卵巢上皮性癌是致死率極高的婦科腫瘤，同時(shí)也是一種高度異質(zhì)性的疾病。在臨床上主要體現(xiàn)在：相同組織學(xué)類型的卵巢上皮性癌卻存在不同的生物學(xué)行為（即臨床表現(xiàn)不同），治療效果和預(yù)后也不盡相同。PAX8、WT-1、HER2三種基因與卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。盆腹腔和淋巴結(jié)均有轉(zhuǎn)移時(shí)三種基因的表達(dá)高于只有盆腹腔轉(zhuǎn)移而淋巴結(jié)陰性者，這對(duì)臨床有一定指導(dǎo)作用，可能成為提示預(yù)后情況的基因指標(biāo)或者為手術(shù)方式的選擇提供一定的基礎(chǔ)。但是需擴(kuò)大組織樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］ Rose S L，Goodheart M J，DeYoung B R，et al.P21 expression predicts outcome in p53-null ovarian carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2003，9（3）：1028.

［2］ Mittag J，Winterhager E，Bauer K，et al.Congenital hypothyroid female pax8-deficient mice are infertile despite thyroid hormone replacement therapy［J］.Endocrinology，2007，148（2）：719.

［3］ Bouchard M，de Caprona D，Busslinger M，et al.Pax2 and Pax8 cooperate in mouse inner ear morphogenesis and innervation［J］. BMC Dev Bio1，2010，10（1）：1-17.

［4］ Bowen N J，Logani S，Dickerson E B，et al.Emerging roles for PAX8 in ovarian cancer and endosalpingeal development［J］. Gynecol Oncol， 2007，104（2）：331-337.

［5］ Kroll T G，Sarraf P，Pecciarini L，et al.PAX8-PPAR gamma1 fusion oncogene in human thyroid carcinoma［J］.Science，2000，289（5483）：1357.

［6］ Paulette M F，Dan W，Damanzoopinder S，et al.Pair Box 8（PAX8）protein expression in high grade，late stage（stageⅢAnd Ⅳ） ovarian serous carcinoma［J］.Gynecol Oncol，2012，127（1）：198.

［7］ Cheung H W，Cowley G S，Weir B A，et al.Systematic investigation of genetic vulnerabilities across cancer cell lines reveals lineage-specific dependencies in ovarian cancer［J］.Proc Natl Acad Sci，2011，108（30）：12 372.

［8］ Pritchard-Jones K，Hastie N D.Wilms' tumour as a paradigm for the relationship of cancer to development［J］.Cancer Surv，1990，9（3）：555.

［9］ Werner H.Increased expression of the insulin-like growth factor 1 receptor gene，IGF1R，in Wilms tumor is correlated with modulation of IGF1R promoter activity by the WT-1 Wilms tumor gene product［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（12）：5828.

［10］ Wang Z Y.The Wilms' tumor gene product，WT-1，represses transcription of the platelet-derived growth factor A-chain gene［J］.J Biol Chem，1992，267（31）：21 999.

［11］ Goldstein N S，Uzieblo A.WT-l immunoreactivity in uterine papillary serous carcinomas is different from ovarian serous carcinomas［J］.Am J Clin pathol，2002，117（4）：541.

［12］ Al-Hussaini M，Stockman A，F(xiàn)oster H，et al.WT-1 assists in distinguishing ovarian from uterine serous carcinoma and in distinguishing between serous and endometrioid ovarian carcinoma［J］.Histopathology，2004，4（2）：109.

［13］ Huang L W，Garrett A P，Bell D A，et al.Diferential expression of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 protein and mRNA in epithelial ovarian tumours［J］.Gynecol Oncol，2000，77（3）：369.

［14］ Sebastian S，Settleman J，Reshkin S J，et al.The complexity of targeting EGFR signaling in cancer：from expression to turnover［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1766（1）：120.

［15］ Suo Z，Karbovo E，Trope C G，et al.Papillary serous carcinoma of the ovary：an ultrastructural and immunohistochemieal study［J］.Ultrastruct Pathol，2004，28（3）：141.

［16］ Camilleri-Broet S，Hardy-Bessard A C，Le-Tourneau A，et al.HER-2 overerexpression is an independent marker of poor prognosis of advanced primary ovarian carcinoma，a multicenter study of the G1NECO group［J］.Ann Oncol，2004，15（1）：104.

［17］ Gessler M，Poustka A，Cavenee W，et al.Homozygous deletion in Wilms tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping［J］.Nature，1990，343（6260）：774.

Differential Expression of PAX 8，WT-1 and HER2 in Advanced Epithelial Ovarian Cancer with Different Metastatic Modes

WANG Li-li，GUO Hong-yan，ZHANG X ue-hui，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（27）：020-024

Objective：To explore the differential expression of PAX8，WT-1 and HER2 in advanced epithelial ovarian cancer with different metastatic modes and provide some theoretical basis for clinical treatment. Method：The clinical samples were collected，they were divided into lymph node metastasis group of 1 case，mixed metastasis group of 14 cases and pelvic-abdominal metastasis group of 5 cases according to the metastasis ways.The relative expression of PAX8，WT-1 and HER2 in 20 patients with advanced epithelial ovarian cancer were detected by real-time quantitative fluorescent PCR method.Result：20 cases all had expressed PAX8，WT-1 and HER2.The expression of PAX8，WT-1 and HER2 in mixed metastasis group was higher than that of pelvicabdominal metastasis group.Conclusion：The expression of PAX8，WT-1 and HER2 may be associated with the metastasis way of tumor，and probably become the genetic indicators for clinical work，but it is necessary to expand the sample for further validation.

PAX8； WT-1； HER2； Advanced epithelial ovarian carcinoma； Differential expression

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.27.006

①北京大學(xué)附屬第三醫(yī)院 北京 100191

②北京大學(xué)第三醫(yī)院

③中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院

郭紅燕

（2016-07-17） （本文編輯：李穎）