參草通脈顆粒影響慢性心力衰竭大鼠血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究*

孫曉輝，王 懿，張 艷

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847）

參草通脈顆粒影響慢性心力衰竭大鼠血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究*

孫曉輝1，王 懿2，張 艷1

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847）

［目的］觀察參草通脈顆粒對心力衰竭大鼠血栓形成的影響。［方法］選取80只大鼠，隨機(jī)取20只為正常對照組，其余大鼠經(jīng)冠脈結(jié)扎法配合力竭式游泳、節(jié)食等方法造成慢性心力衰竭模型，將造模成功的大鼠分為模型組、中藥治療組、西藥治療組，共4組，均以灌胃給藥或蒸餾水28 d。利用蛋白免疫印跡法測定各組血栓素B2 （TXB2）、降纖酶原抑制物（PAI-Ⅰ）的變化情況及血清腦鈉素（BNP）的濃度，用比色法測定高能磷酸鹽（ATP）濃度。［結(jié)果］與正常對照組相比，模型組及各組大鼠TXB2、PAI-Ⅰ及BNP含量顯著升高（P＜0.01），ATP水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，中藥治療組和西藥治療組TXB2、PAI-Ⅰ及BNP含量明顯降低（P＜0.01），ATP明顯升高（P＜0.01）；西藥治療組與中藥治療組血清中TXB2、PAI-Ⅰ明顯降低（P＜0.01），ATP和BNP含量無明顯差異（P＞0.05）。［結(jié)論］中藥復(fù)方參草通脈顆?？娠@著降低心力衰竭大鼠BNP的含量水平，降低血小板活化作用，減少心力衰竭后血栓的發(fā)生，能夠改善線粒體能量代謝，改善心功能，抑制或逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。

參草通脈顆粒；慢性心力衰竭；血栓；高能磷酸鹽；血清腦鈉素；血栓素B2；降纖酶原抑制物

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.05.08

慢性心力衰竭（CHF，以下簡稱慢性心衰）是由于心肌梗死、心肌病、血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷過重、炎癥等多種原因引起的心肌損傷，造成心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，最后導(dǎo)致心室泵血或充盈功能低下的一種嚴(yán)重威脅人們健康的疾病。隨著近年來對慢性心衰的發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，證實(shí)多數(shù)CHF的并發(fā)癥與血栓有關(guān)，心力衰竭（以下簡稱心衰）患者肺栓塞、腦卒中和周圍動(dòng)脈栓塞事件發(fā)生比一般人群高，同時(shí)研究證實(shí)CHF的發(fā)生與血小板的的激活、血栓的形成和線粒體能量代謝有關(guān)，其中血栓的形成與血清中血栓素B2（TXB2）和降纖酶原抑制物（PAI-Ⅰ）的含量相關(guān)［1-2］。目前，中醫(yī)藥治療CHF的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，本研究通過觀察中藥復(fù)方參草通脈顆粒干預(yù)慢性心衰大鼠，探討其影響血栓形成的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治慢性心衰提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇SPF級(jí)12周齡雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量250～300 g［由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2010-0001］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 參草通脈顆粒:由人參、黃芪、丹參、紅花、益母草、茯苓及葶藶子組成（由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥制劑中心制備成顆粒劑）。賴諾普利片，每片10 mg（由上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)HI0960265）。TXB2、PAI-Ⅰ試劑盒購自蘇州大學(xué)血栓與止血研究室，試劑批號(hào)MB0311。血清腦鈉素（BNP）試劑盒，購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。高能磷酸鹽（ATP）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要儀器 HX-300小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)），多功能酶標(biāo)儀（anthos2010型），SONOS5500彩色多譜勒超聲心動(dòng)圖（Agilent公司生產(chǎn)）。

2 方法

2.1 慢性心衰大鼠造模 從80只未予任何處理的正常大鼠中隨機(jī)選取20只設(shè)為正常對照組（簡稱正常組）。其余60只大鼠參照文獻(xiàn)［3］制備CHF大鼠模型。常規(guī)喂養(yǎng)1周后，每100 g體質(zhì)量用10%水合氯醛0.3 mL腹腔麻醉大鼠，麻醉后固定，行經(jīng)喉氣管插管術(shù)連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，每分鐘80次，潮氣量為0.7～0.8 mL。備皮后經(jīng)碘伏消毒，約在其左側(cè)第3、4肋間橫向切開皮膚約1.5 cm長度，打開胸腔，暴露心臟，找到左冠狀動(dòng)脈前降支，在起源點(diǎn)下2～4mm處用6號(hào)線結(jié)扎至周圍心肌變白，將心臟放回胸腔，處理好胸腔內(nèi)外源性污物，快速逐層縫合第3、4肋間、肌層及皮膚，并將青霉素鈉外敷于傷口處，待大鼠呼吸平穩(wěn)后停小動(dòng)物呼吸機(jī)，恢復(fù)胸腔負(fù)壓，動(dòng)物能夠自主呼吸后，拔出氣管插管針。小鼠連接至心電圖機(jī)，心電圖顯示ST-T段抬高為結(jié)扎成功。手術(shù)后注射每日青霉素鈉4×104U，每日1次，持續(xù)3 d，以防感染。常規(guī)喂養(yǎng)1周，第2周將其飼料減少1/2使大鼠饑餓，同時(shí)每日進(jìn)行1次力竭式游泳，以大鼠口吐氣泡，四肢無擺動(dòng)來判斷已完全疲勞，即刻撈起。持續(xù)2周。期間，大鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)度減低，毛色無光澤、脫毛等體征，且經(jīng)多普勒超聲心動(dòng)圖檢測左室射血分?jǐn)?shù)（EF）≤60%為慢性心衰造模成功，列入觀察對象。造模成功后第2天給藥，見圖1。

圖1 大鼠造模前（正常組）與造模后（模型組）超聲

2.2 動(dòng)物分組及給藥方法 將造模成功后的37只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：模型組（13只）、中藥治療組（12只）、西藥治療組（12只）。正常組隨機(jī)取出13只以盡量使樣本數(shù)保持均衡。正常組和模型組予蒸餾水灌胃，每次3 mL，每日1次。用藥組按人鼠劑量換算，給藥劑質(zhì)量（g/kg）=人的劑量（g）×系數(shù)（0.018）/所求動(dòng)物體質(zhì)量（kg）。西藥治療組（簡稱西藥組）予賴諾普利1.5mg/（kg·d）；中藥治療組（簡稱中藥組）予參草通脈5.75 g/（kg·d）。兩組藥物均溶于3 mL蒸餾水，每日1次灌胃，各組均用藥28 d。

2.3 標(biāo)本采集處理 28 d后，各組大鼠禁食不禁水12 h，經(jīng)大鼠尾靜脈采血后，麻醉處死全部大鼠。取大鼠心臟心肌組織，各組隨機(jī)取10只，每只大鼠心臟按標(biāo)準(zhǔn)處理，備2份，其于液氮中冷凍后在-80℃條件下保存待檢測，比色法測定ATP濃度，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）測定BNP、TXB2及PAI-Ⅰ含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組間采用單因素方差分析（one-way AONVA）進(jìn)行比較，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 參草通脈顆粒對CHF大鼠血清BNP水平的影響 見表1。

表1 各組大鼠血清中BNP含量（±s） μg/L

表1 各組大鼠血清中BNP含量（±s） μg/L

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，#P＜0.01。

組別正常組模型組中藥組西藥組n 10 10 10 10 BNP 215.97±14.74 499.07±52.85#330.18±21.60*#324.27±29.78*#

與正常組相比，模型組、中藥組及西藥組BNP水平均升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示心衰時(shí)血清BNP含量呈上升趨勢；同模型組比較，中藥組與西藥組BNP水平降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明藥物治療可減少BNP的生成；中藥組與西藥組BNP含量比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明中藥組與西藥組療效相當(dāng)。

3.2 參草通脈顆粒對CHF大鼠血清血栓素TXB2，PAI-Ⅰ的影響 見表2。

表2 各組大鼠血清TXB2 PAI－Ⅰ變化（±s） μg/L

表2 各組大鼠血清TXB2 PAI－Ⅰ變化（±s） μg/L

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，#P＜0.01。

組別正常組模型組中藥組西藥組n 10 10 10 10 TXB2 032.450±5.065 123.688±14.262#41.750±5.946#* 064.375±7.501#* PAI-Ⅰ14.175±2.152 43.400±7.651#25.900±6.286*#29.713±4.529*#

與正常組相比，模型組、中藥組及西藥組TXB2、PAI-Ⅰ含量顯著升高（P＜0.01），提示心衰時(shí)血清TXB2、PAI-Ⅰ含量呈上升趨勢；同模型組比較，中藥組與西藥組TXB2、PAI-Ⅰ水平顯著降低（P＜0.01），說明中西藥物治療均可降低TXB2、PAI-Ⅰ的生成，且中藥組優(yōu)于西藥組（P＜0.01）。

3.3 參草通脈顆粒對CHF大鼠細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的影響 見圖2。

與正常組相比，模型組、中藥組與西藥組ATP濃度降低顯著（P＜0.01），提示心衰時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降；與模型組比較，中藥組與西藥組ATP濃度提高（P＜0.01）；中藥組與西藥組ATP濃度比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4 討論

慢性心衰屬于中醫(yī)的“胸痹”、心悸”、“怔忡”、“水腫”等病證的范疇。根據(jù)多年的臨床觀察和大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)慢性心衰的主要病機(jī)為氣虛血瘀水停［4］，參草通脈顆粒是經(jīng)過多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出來的以益氣活血為主要功效治療慢性心衰的經(jīng)驗(yàn)方，療效顯著。方中以人參和黃芪為君藥以益氣助陽，以丹參、紅花、三七3味藥為臣藥活血通脈，加益母草祛瘀生新、強(qiáng)心利尿，葶藶子與茯苓瀉肺逐水、強(qiáng)心。諸藥合用，起到化瘀不傷血，利水不傷陰，補(bǔ)氣而無溫燥之弊，是標(biāo)本兼治慢性心衰的良方。研究中藥復(fù)方參草通脈顆粒治療CHF的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步廣泛應(yīng)用于臨床提供更有利的依據(jù)。

圖2 各組大鼠細(xì)胞中ATP濃度

目前，研究表明慢性心衰與血栓形成或血栓栓塞的危險(xiǎn)性增加有關(guān)。在CHF患者中，此類事件的發(fā)生率可顯著上升，并與臨床預(yù)后有密切關(guān)系。慢性心衰血栓事件的發(fā)病機(jī)制可從以下3個(gè)方面論述：血流異常、血管壁異常和血成分異常［5］。心衰發(fā)生時(shí)易導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)被激活，血漿中血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素水平升高，使血管內(nèi)皮損害/功能不全。在此情況下，外界病理或生理刺激因子可促使血小板活化，過度聚集導(dǎo)致血栓前狀態(tài)或血栓栓塞癥。研究表明血栓素A2（TXA2）可直接引起血小板聚集及二磷酸腺苷（ADP）的釋放，且具有強(qiáng)烈的血小板聚集和血管收縮作用。同時(shí)TXA2本身很不穩(wěn)定，在體液中的半衰期僅為30～60 s，然后迅速變成穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2，所以常用TXB2反映TXA2的水平，可評價(jià)血小板的活化程度［6］。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，PAI-Ⅰ合成與釋放異常，引起PAI-Ⅰ活性變化，影響了纖溶系統(tǒng)的功能。研究表明，心功能越差，血小板釋放PAI-Ⅰ越多，外周靜脈血中濃度越高，血小板活化程度越高，血液高凝狀態(tài)越重［7］。BNP的合成分泌受心室容量負(fù)荷和室壁張力的影響，血BNP含量能夠直接反映心室功能，是評價(jià)心衰嚴(yán)重程度的主要指標(biāo)之一。研究表明BNP含量與心衰的程度、左室舒張末徑呈現(xiàn)正相關(guān)，與EF呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)［8］。且能量代謝主要作用是維持細(xì)胞代謝、結(jié)構(gòu)和功能等方面內(nèi)容［9］。心臟需要大量能量來維持自身收縮功能，正常心肌能量供應(yīng)時(shí)線粒體的氧化呼吸鏈和ATP的生成是偶聯(lián)的，心衰發(fā)生時(shí)線粒體有氧氧化功能受抑制，偶聯(lián)機(jī)制被破壞，線粒體數(shù)量增加，同時(shí)能量代償期增加，呼吸功能和ATP的合成受到抑制。由此心衰時(shí)，能量代謝異常貫穿于心肌從代償性肥大到衰竭的全過程，促進(jìn)線粒體DNA的合成，改善心肌能量代謝狀況，是減輕或預(yù)防心衰的發(fā)生主要靶點(diǎn)。本研究證明了影響血栓形成的TXB2和PAI-Ⅰ與ATP的含量與慢性心衰發(fā)生密切相關(guān)。

本研究中，實(shí)驗(yàn)大鼠心臟彩超顯示造模成功，BNP含量上升，提示心功能下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示中藥組和西藥組大鼠血清BNP含量下降，提示參草通脈顆?？擅黠@改善心功能。慢性心衰大鼠模型組與正常組相比TXB2、PAI-Ⅰ及BNP含量顯著升高（P＜0.01），ATP水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組大鼠相比，中藥組和西藥組TXB2、PAI-Ⅰ及BNP含量明顯下降（P＜0.01），ATP明顯升高（P＜0.01）；西藥組與中藥組血清中TXB2、PAI-Ⅰ明顯降低（P＜0.01），ATP和BNP含量無明顯差異（P＞0.05）。提示參草通脈顆粒能增加ATP合成，增強(qiáng)心肌收縮力，減輕心室重構(gòu)，減少TXB2、PAI-Ⅰ含量，降低血小板活化，從而降低血栓形成的危險(xiǎn)性，對防治慢性心衰引起血栓的發(fā)生有一定的作用。

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Experimental study on the effect of Shencao Tongmai granule on thrombosis in chronic heart failure rats

SUN Xiao-Hui1，WANG Yi2，ZHANG Yan1
（1.Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

［Objective］To observe the effect of the pulse of the herb on thrombosis in heart failure rats.［Methods］A total of 80 rats，twenty were randomly selected as the normal control group，the remaining rats by coronary artery ligation method with the exhaustive swimming and diet to make chronic heart failure model，the successful model of the rats were divided into model group，treatment group of Chinese medicine，western medicine treatment group，a total of 4 groups，all with intragastric administration or distilled water for 28 days.Thromboxane B2 were measured by Western blot assay （TXB2），fibrinolytic proenzyme inhibitor（PAI-Ⅰ）and the changes of serum brain natriuretic peptide （brain natriuretic peptide，BNP）for the determination of the concentration of high energy phosphate Colorimetry （adenosine triphosphate，ATP）concentration.［Results］Compared with the normal group，model group and the other groups of rats TXB2，PAI-Ⅰand BNP levels increased significantly（P＜0.01），ATP level were significantly decreased （P＜0.01）；compared with the model group，Chinese medicine group and Western medicinegroupTXB2，PAI-ⅠandBNPcontentdecreasedsignificantly（P＜0.01）.ATPdecreased significantly（P＜0.01）；TXB2，PAI-Ⅰof serum in medicine group and Chinese medicine group decreased significantly （P＜0.01），no significant difference between the ATP and BNP content（P＞0.05）.［Conclusion］Shencao Tongmai granule of the traditional Chinese medicine compound can significantly decrease the level of BNP content in rats with heart failure，reduce platelet activation，reduce the incidence of thrombosis after heart failure，can improve mitochondrial energy metabolism，improve heart function，inhibiting or reversing ventricular remodeling.

Shencao Tongmai granule；chronic heart failure；thrombosis；ATP；BNP；TXB2；PAI-Ⅰ

R541.6

A

1673-9043（2016）05-0314-04

2015-06-18）

沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目（F13-316-1-10）。

孫曉輝（1970-），男，主管中藥師，從事藥學(xué)研究工作。

張 艷，E-mail:yanzhang1016@126.com。