人參皂苷Re對ADP、PAF、AA誘導家兔血小板聚集功能的影響*

閆海峰，代向東，樊克濤，王 怡

（天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193）

·實驗研究·

人參皂苷Re對ADP、PAF、AA誘導家兔血小板聚集功能的影響*

閆海峰，代向東，樊克濤，王 怡

（天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193）

［目的］研究人參皂苷Re對血小板聚集功能的影響。［方法］采用體外實驗通過Born法觀察人參皂苷Re對二磷酸腺苷鈉鹽（ADP）、血小板活化因子（PAF）、花生四烯酸（AA）誘導的家兔血小板聚集率的影響。［結果］人參皂苷Re體外抑制ADP、PAF、AA誘導的家兔血小板聚集差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。半數抑制濃度（IC50）分別為0.197、0.242、0.443 g/L。［結論］人參皂苷Re呈劑量依賴性抑制體外ADP、PAF、AA誘導的血小板聚集，且抗ADP誘導的血小板聚集作用強于PAF、AA。

人參皂苷Re；血小板聚集；二磷酸腺苷鈉鹽；血小板活化因子；花生四烯酸

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.05.07

人參皂苷Re是人參皂苷單體提取物的有效成分，屬于人參三醇型皂苷之一，是人參單體發(fā)揮藥理活性的主要成分之一。它不僅單存在于人參中，而且還分布于西洋參、高麗參、三七等植物中，但其分布遠少于人參中的含量。近年來，國內外對人參皂苷Re的藥理研究逐步深入，已有文獻報道其具有改善或者降低血糖、抗炎抗氧化、保護心肌損傷、抗心律失常、增強免疫功能、保護胃黏膜等作用［1-14］。但人參皂苷Re對于體外抑制血小板聚集功能的文獻作用尚未清楚論述。本研究僅從體外研究人參皂苷Re對二磷酸腺苷鈉鹽（ADP）、血小板活化因子（PAF）、花生四烯酸（AA）誘導的家兔血小板聚集率的影響并分析其抗血小板聚集的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人參皂苷Re（以下簡稱Re，純度≥95%），規(guī)格每瓶1 g（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號160301）。

1.2 實驗動物 日本大耳白兔，體質量2～2.6 kg，雄性20只，由北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供，普通級別，動物使用許可證號：SCXK（京）2015-0005。

1.3 試劑與儀器 二磷酸腺苷鈉鹽（ADP），每瓶100 mg（Sigma公司，批號A2754）；血小板活化因子（PAF），每瓶1 mg（Sigma公司，批號P4909）；花生四烯酸（AA），每瓶100 mg（東京化成工業(yè)株式會式，批號A0781）；枸櫞酸鈉（天津市贏達稀貴化學試劑廠，批號20150207）；鹽酸利多卡因注射液，規(guī)格5 mL∶0.1 g（河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號H13022313）；無水乙醇（天津市康德科技有限公司，批號1601025）；小牛血清蛋白（Solarbio公司，批號323N054）；Tris BuffeRed Saline（Sigma公司，批號1002043124）；570—VS血小板聚集儀 （美國CHRONO-LOG公司）；LDZ5-2低速自動平衡離心機（北京京立離心機有限公司）。

2 方法

2.1 樣本采集 大耳白家兔于清醒狀態(tài)下用利多卡因局部麻醉，分離出左側頸總動脈，長約2～3 cm，頸總動脈取血，3.8%的枸櫞酸鈉溶液抗凝（血∶抗凝劑=9∶1），緩慢顛倒軟管混合均勻，以1 000 r/min離心10 min，上清部分即為富血小板血漿（PRP），剩余部分以3 000 r/min離心10 min，上清部分即為貧血小板血漿（PPP），用全自動血細胞計數儀計數血小板，并用PPP調PRP，使血小板計數在（300～500）×109/L。

2.2 血小板聚集率的測定 通過570-VS血小板聚集儀測定血小板聚集率，根據Born法，將加入500 μL檢測標本的PPP放入PPP孔，加入500 μL檢測標本的PRP放入PRP孔，育溫5 min，對照組加入無水乙醇（終濃度為9.26‰）20 μL，實驗組加入人參皂苷Re（終濃度分別為0.056、0.112、0.448、0.896、1.792 g/L）20 μL。并育溫5 min，熒光基線穩(wěn)定在100/0的位置。每個比色杯分別加入ADP（終濃度為17.5 μmol/L）、PAF（終濃度為725.63μmol/mL）、AA（終濃度為0.3 mmol/L）20 μL，測定開始后，曲線運行6～9 min至平穩(wěn)時，按下“停止”按鈕。通過儀器描記出來的聚集曲線檢測血小板聚集率，并計算聚集抑制率。

聚集抑制率（%）=（無水乙醇組聚集率-實驗組聚集率）/無水乙醇組聚集率×100%

2.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件包進行數據統(tǒng)計，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），數據以均數±標準差（±s）表示。

3 結果

3.1 ADP誘導的體外家兔血小板聚集率的影響 與對照組比較，人參皂苷Re 0.112～1.792 g/L呈劑量依賴性抑制ADP誘導的家兔血小板聚集（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 人參皂苷Re對ADP誘導的正常家兔血小板聚集率的影響（±s）

表1 人參皂苷Re對ADP誘導的正常家兔血小板聚集率的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.2 PAF誘導的體外家兔血小板聚集率的影響 與對照組比較，人參皂苷Re 0.112～1.792 g/L呈劑量依賴性抑制PAF誘導的家兔血小板聚集（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

3.3 AA誘導的體外家兔血小板聚集率的影響 與對照組比較，人參皂苷Re 0.112～1.792 g/L呈劑量依賴性抑制AA誘導的家兔血小板聚集（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

4 討論

血小板在參與止血和血栓形成的過程中起著重要的作用，當血管內皮損失或者受刺激時，血管內皮暴露的細胞外基質將與血小板結合，血小板活化發(fā)生聚集形成血栓，血栓的過度形成將會導致一系列的心腦血管疾病的發(fā)生，因此，抗血小板聚集治療（抑制血小板活化）對于減少或防止血栓栓塞性疾病起著重要的角色。血小板的活化主要有3條途徑［15］：二磷酸腺苷（ADP）、花生四烯酸（AA）、血小板活化因子（PAF），目前，抗血小板聚集的藥物主要有血栓烷A2（TXA2）抑制藥（阿司匹林）、ADP受體拮抗藥（氯吡格雷）、磷酸二酯酶抑制藥（雙嘧達莫）、糖蛋白IIb/IIIa受體抑制藥等其他抗血小板藥［16-17］。但都有著不同的藥物不良反應，比如腦出血或胃腸道出血，還可造成血小板或中性粒細胞減少、再生障礙性貧血等［18-21］。因此，中醫(yī)藥抗血小板的治療逐步成為國內外研發(fā)的熱點，尤其是一些抗血小板治療的同時且不良反應較少的中藥，現(xiàn)有文獻表明中藥或中成藥復方及單體的有效成分均有抗血小板聚集的作用，如益氣活血方、補陽還五湯、白藜蘆醇等，其抗血小板的聚集作用通過降低血栓素B2 （TXB2），升高6-酮-PGF1α的含量及可能抑制血小板內PKC活性有關［22-24］。

表2 人參皂苷Re對PAF誘導的體外家兔血小板聚集率的影響（±s）

表2 人參皂苷Re對PAF誘導的體外家兔血小板聚集率的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 終濃度（g/L）血小板聚集率（%）對照組- 59.5±3.84人參皂苷Re 0.056 57.7±3.74 0.112 55.2±4.71* 0.448 42.1±3.41** 0.896 35.7±2.98** 1.792 23.5±3.14**抑制率（%）-3.03 7.23 29.24 40.00 60.50 IC50（g/L）0.242

表3 人參皂苷Re對AA誘導的體外家兔血小板聚集率的影響（±s）

表3 人參皂苷Re對AA誘導的體外家兔血小板聚集率的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 終濃度（g/L）血小板聚集率（%）對照組- 64.6±3.27人參皂苷Re 0.056 63.3±3.89 0.112 58.6±5.44* 0.448 49.7±6.80** 0.896 41.4±5.64** 1.792 30.2±4.61**抑制率（%）-2.01 9.29 23.07 35.91 52.25 IC50（g/L）0.443

本研究旨在研究人參皂苷Re體外對ADP、PAF、AA誘導的家兔血小板聚集的影響，通過本實驗可知人參皂苷Re 0.112 g/L組有抑制ADP、PAF、AA誘導的體外家兔血小板聚集的作用（P＜0.05），人參皂苷Re 0.448、0.896、1.792 g/L組與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且有明顯的量效關系，實驗表明人參皂苷Re可能不是通過某一特異受體發(fā)揮抗血小板聚集的作用，而是從多種途徑發(fā)揮抑制血小板聚集的作用，從人參皂苷Re半數抑制濃度（分別為0.197、0.242、0.443 g/L）上可以看出人參皂苷Re對于ADP抑制血小板聚集作用強于PAF、AA，人參皂苷Re抗血小板聚集作用可能主要通過ADP途徑發(fā)揮抗血小板聚集的作用，也許通過抑制血小板表面上的受體來降低鈣離子（Ca2+）的釋放，阻止血小板的黏附、聚集的作用，有待進一步研究。

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Effection of Ginsenoside Re on ADP，PAF，AA-induced platelet aggregation

YAN Hai-feng，DAI Xiang-dong，F(xiàn)AN Ke-tao，WANG Yi
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the effect of ginsenoside Re on platelet aggregation function.［Methods］In vitro，through the Born law，effect of ginsenoside Re on sodium salt adenosine diphosphate（ADP），platelet-activating factor（PAF），arachidonic acid（AA）-induced platelet aggregation rate of.［Results］Ginsenoside Re in vitro ADP，PAF，AA-induced platelet aggregation was statistically significant difference （P＜0.05，P＜0.01），median inhibiting concentration（IC50），0.197 g/L，0.242 g/L，and 0.443 g/L respectively.［Conclusion］The ginsenoside Re in a dosedependent inhibition of in vitro ADP，PAF，AA-induced platelet aggregation，and ADP-induced platelet aggregation was stronger than PAF，AA.

ginsenoside Re；platelet aggregation；ADP；PAF；AA

R285.5

A

1673－9043（2016）05－0310-04

2016-05-07）

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目資助（2012CB518404）。

閆海峰（1987-），男，碩士研究生，研究方向為方劑學。

王 怡，E-mail:vip-wangyi@126.com。