熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌多重PCR檢測方法的建立

胡冰雪，舒沿沿，潘道東,2,，曾小群，吳　振

（1.寧波大學(xué) 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.南京師范大學(xué) 國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097）

熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌多重PCR檢測方法的建立

胡冰雪1，舒沿沿1，潘道東1,2,*，曾小群1，吳振1

（1.寧波大學(xué) 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.南京師范大學(xué) 國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097）

針對肉制品中易污染的熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌等有害微生物，通過3 種標(biāo)準(zhǔn)菌株及肉制品建立多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，實現(xiàn)肉制品中這3 種菌的同時、快速檢測。利用熒光假單胞菌的gyrB基因、沙門氏菌的invA基因和單增李斯特菌的hlyA基因設(shè)計3 對特異性引物，在確定引物特異性的基礎(chǔ)上，對3 種標(biāo)準(zhǔn)菌株及在冷卻肉上過夜富集后進(jìn)行靈敏度檢測。結(jié)果表明，該多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法對于同時檢測這3 種有害微生物具有高度的特異性；同時檢測這3 種菌時，純菌DNA檢測限可達(dá)1 pg/μL；將3 種菌一起接種到冷卻肉中35 ℃過夜培養(yǎng)后，熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的檢測限分別可達(dá)到9、5、70 CFU/mL。

多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；檢測方法；熒光假單胞菌；沙門氏菌；單增李斯特菌

肉制品因其需求量大、營養(yǎng)豐富及易于消化等特點而受到各個年齡階層的歡迎。然而，由于其水分含量高、必需營養(yǎng)物質(zhì)豐富，為各種腐敗菌、致病菌的生長繁殖提供了基質(zhì)，導(dǎo)致肉制品容易受到各種微生物污染［1］。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種嗜冷微生物，易污染冷藏中的生肉、生牛乳等高脂肪、高蛋白的食品，在冷藏的生肉、碎肉中都是優(yōu)勢菌群。臨床研究表明，P. fluorescens自溶后釋放內(nèi)毒素，內(nèi)毒素中的磷脂成分污染了血制品，會導(dǎo)致病人輸血后產(chǎn)生不可逆的休克、彌漫性血管內(nèi)凝血［2］，是典型的條件致病菌。沙門氏菌（Salmonella）存在地域性廣、發(fā)病率高和大范圍食物污染等特點，在引起食物中毒的病原菌中一直占據(jù)首位［3-4］。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）在4 ℃仍可生長，主要通過肉乳及其制品引起人的感染發(fā)病，成為僅次于Salmonella感染引起的第二號致命的食源性感染疾?。?］。因此，快速檢測和鑒別冷卻肉中有害微生物是保障肉品質(zhì)量安全，防止食源性疾病爆發(fā)的有效手段。

對于食品微生物的檢測方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)法過程繁瑣、耗時長、工作量大，一般需要4～7 d才能出檢測結(jié)果。免疫學(xué)方法具有特異性好、敏感度高的優(yōu)點，但由于微生物血清型復(fù)雜，檢測中常出現(xiàn)假陽性結(jié)果，陽性結(jié)果需要其他實驗進(jìn)一步確認(rèn)。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）成為肉制品中有害微生物檢測的重要技術(shù)手段［6］。在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的多重-PCR（multiplex PCR，m-PCR）技術(shù)，是在普通PCR基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，同時擴(kuò)增出多個目的核酸片段，快速檢測或鑒定多種微生物的技術(shù)［7］，該技術(shù)不需要大量、昂貴的實驗設(shè)備進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，同時對于肉制品中主要的有害微生物又能實現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)、高特異性和高靈敏度的檢測［8］。然而，m-PCR方法的建立主要集中于Salmonella［9］、L. monocytogenes［10］等典型致病菌，對于極易污染肉乳制品的P. fl uorescens快速、有效的檢測方法尚不成熟。雖然目前尚未出現(xiàn)由P. fl uorescens所引起的大規(guī)模食物中毒事件，但隨著人們飲食習(xí)慣的改變、冰箱的普及和不合理使用，食品中該菌對健康的危害及引起食物中毒的可能性會越來越越大，因此建立該菌的快速檢測方法迫在眉睫。但是假單胞菌屬是一個很大的群體，Palleroni等［11］研究表明其至少可以分為5 個生物變型，這就使得其分子生物學(xué)檢測方法的建立存在一定難度，PCR方法是現(xiàn)階段最快速最有效的檢測P. fluorescens的技術(shù)，而其m-PCR檢測方法的建立極不成熟。

鑒于此，本研究旨在建立一種應(yīng)用于復(fù)雜食品基質(zhì)如冷卻肉中P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes的同時、快速、高效的m-PCR檢測方法，對于肉制品的常規(guī)監(jiān)測及減少有害微生物的潛在危害具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1實驗菌株

實驗所用菌株名稱和來源見表1，部分菌株從菌種庫直接購買，另外一部分由浙江省疾病預(yù)防控制中心提供。實驗菌株均用甘油管-40 ℃保藏。

表1　菌株及引物特異性驗證Table1　Specificity of the primers for different bacterial strains

1.1.2培養(yǎng)基與試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；實驗所用引物序列由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，測序工作委托上海生工完成；DNA聚合酶等PCR反應(yīng)試劑 北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA抽提試劑盒（D3350） 大連寶生物工程有限公司。

1.1.3儀器與設(shè)備

Multigene Thermal Cycler型PCR儀 美國Labnet公司；Universal HoodⅡ型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TH-YJ-1450A/B型凈化工作臺 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司；Centerifuge 5415R型臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Mini Drop型超微量分光光度計 上海依科賽生物制品有限公司；H2500R-2型和H-2050R型高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYCP-31DN型核酸電泳儀 北京六一生物科技有限公司；AL204型和PL4002型電子天平、FE20型實驗室pH計 美國Mettler Toledo公司；GT16-3M型迷你離心機(jī) 杭州米歐儀器有限公司；HtPot40型恒溫金屬浴麥稷橋國際貿(mào)易有限公司；HJ-4型磁力攪拌器 常州申光儀器有限公司；QHZ-12A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)［12-15］中提到的3 種菌的特異性靶基因，即P. fluorescens的gyrB基因、Salmonella的invA基因和L. monocytogenes的hlyA基因，應(yīng)用Primer premier 5.0設(shè)計引物，確保引物之間無二聚體形成，并對各引物間的互補(bǔ)性、最佳退火溫度進(jìn)行了分析，獲得了3 對特異性引物（表2）。3 對引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，擴(kuò)增片段大小依次為271、482 bp和592 bp。

表2　3對引物序列及相關(guān)參數(shù)Table2　Sequences and parameters of the primers

1.2.2細(xì)菌DNA提取

購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株采用推薦培養(yǎng)基活化后涂平板，挑取單個菌落在35 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，根據(jù)渾濁度判斷細(xì)菌生長狀況，待生長至穩(wěn)定期后取3 mL菌液，按Omega biotek公司Bacteria DNA Kit試劑盒（D3350）的操作說明提取細(xì)菌基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.3單重PCR反應(yīng)體系的建立

單重PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5 μL，各2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，2.5 U/μL的DNA聚合酶0.75 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的瓊脂糖、120 V電壓進(jìn)行凝膠電泳，割膠回收后的產(chǎn)物送上海生工測序鑒定。

1.2.4m-PCR反應(yīng)體系建立及優(yōu)化

以P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes提取的DNA為模板，與各種反應(yīng)試劑混合在一起進(jìn)行m-PCR反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化，以建立最佳的m-PCR方法。優(yōu)化的條件主要包括引物濃度配比、退火溫度、退火時間、DNA聚合酶量等。

1.2.5m-PCR特異性實驗

m-PCR引物特異性實驗分為兩部分，首先是驗證引物對目標(biāo)菌DNA的特異性：分別向3 種目標(biāo)菌的單一DNA、兩兩混合DNA、全部混合DNA中加入3 對混合引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其次是驗證引物對非目標(biāo)菌DNA沒有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。

1.2.6m-PCR靈敏度實驗

首先，將3 種菌的DNA質(zhì)量濃度調(diào)整為102ng/μL，再梯度稀釋為101、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL，采用優(yōu)化后的方法進(jìn)行m-PCR擴(kuò)增，測定能檢測到PCR擴(kuò)增條帶的最低模板質(zhì)量濃度。

1.2.7人工模擬污染肉制品檢測靈敏度

污染肉湯樣品的方法參照Kumar等［16］的方法稍作改進(jìn)。取100 g冰鮮鴨肉加入100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，徹底漂洗后在無菌均質(zhì)袋中均質(zhì)1 min，分成10 等分，3 000 r/min離心5 min，懸浮液取出后用0.45 μm濾膜過濾，過濾好的肉湯冷藏于-20 ℃條件下待用。

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的3 種菌梯度稀釋，并對10-6、10-7、10-8、10-94個稀釋度分別進(jìn)行平板計數(shù)。同時接入3 種菌的梯度稀釋液，使得每20 mL肉湯中3 種菌的最終濃度分別為100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL，對照組接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液。接種好菌液的肉湯在200 r/min條件下振蕩10 min，使菌體充分懸浮，再往每份肉湯中加入80 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，使得樣品體積∶總體積≈1∶10，將肉湯與培養(yǎng)基混合均勻后在35 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，各濃度梯度取1 mL菌液用Omega biotek公司bacteria DNA kit（D3350）提取DNA作為PCR模板，從而確定m-PCR方法檢測3 種菌在肉制品中過夜富集后的靈敏度。

2　結(jié)果與分析

2.1單重PCR特異性實驗

圖1　單重PCR產(chǎn)物的凝膠電泳Fig.1　Agarose gel electrophoresis of simplex PCR products

3 種目標(biāo)菌進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，驗證引物與模板之間的特異性，實驗結(jié)果如圖1所示。泳道1的擴(kuò)增條帶位于500～700 bp之間，與L. monocytogenes的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度的實驗預(yù)期相符；泳道2的擴(kuò)增條帶位于400～500 bp之間，與Salmonella的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度的實驗預(yù)期相符；泳道3的擴(kuò)增條帶位于200～300 bp之間，與P. fluorescens的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度的實驗預(yù)期相符。將PCR擴(kuò)增后的3 個目的片段測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析，比對結(jié)果顯示，測序結(jié)果與NCBI中L. monocytogenes相應(yīng)基因序列的同源性為100%，與Salmonella相應(yīng)基因序列的同源性為99%，與P. fl uorescens相應(yīng)基因序列的同源性為99%。

2.2m-PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件的優(yōu)化

分別對3 種目標(biāo)菌的3 對引物濃度配比、退火溫度、退火時間、DNA聚合酶量進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果（圖2）如下：10×PCR緩沖液5 μL，各2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，2.5 U/μL的DNA聚合酶1 μL，3 種菌的上、下游引物各1 μL，模板各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)過程如下：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，61.7 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)3 條清晰的條帶，大小分別約為592、482、271 bp。

圖2　m-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.2　Optimization of multiplex PCR reaction conditions

2.3m-PCR反應(yīng)特異性實驗結(jié)果

為驗證本實驗所用引物的特異性，上述3 對引物先與P. fl uorescens、Salmonella、L. monocytogenes 3 種目標(biāo)菌的DNA進(jìn)行錯配，按照上述優(yōu)化后的m-PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。其中，泳道1為三模板，2～4為雙模板，5～7為單一模板，均加入3 對混合引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明每對引物只與對應(yīng)模板結(jié)合，擴(kuò)增出了相應(yīng)大小的目的片段。

同時，驗證3 對引物與其他非致病菌如浙江省疾病預(yù)防控制中心提供的Pseudomonas putida、Pseudomonas stutzeri、Listeria sake、Listeria sheep、Shigella、Vibrio harveyi、Vibrio vulnifi cus、Escherichia coli ATCC25922、Staphylococcus aureus ATCC6538進(jìn)行PCR反應(yīng)。以所有實驗菌株提取的單一DNA為模板，同時加入3 對引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

圖3　m-PCR特異性實驗Fig.3　Specificity of the m-PCR assay

2.4m-PCR靈敏度實驗結(jié)果

首先將從3 種菌提取的DNA質(zhì)量濃度調(diào)整為102ng/μL，再按照101、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL分別進(jìn)行質(zhì)量濃度梯度稀釋，采用建立的m-PCR方法擴(kuò)增后，結(jié)果顯示模板質(zhì)量濃度為10-3ng/μL時能出現(xiàn)微弱的條帶，當(dāng)模板質(zhì)量濃度低于10-3ng/μL時條帶消失，因此能同時檢測到3 種菌的最低模板質(zhì)量濃度為10-3ng/μL（圖4）。

圖4　m-PCR靈敏度實驗Fig.4　Sensitivity of the m-PCR assay

2.5人工模擬污染實際樣品的靈敏度檢測結(jié)果

考慮到冷卻肉中原有腐敗菌的數(shù)量和肉品基質(zhì)對目標(biāo)菌生長和檢測的影響，本實驗利用人工模擬實際樣品污染，對m-PCR方法檢測實際樣品時的靈敏度進(jìn)行了測定。通過富集培養(yǎng)之后，模擬肉湯中P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes的檢測限分別為9、5、70 CFU/mL（表3）。

表3　人工模擬肉制品污染的m-PCR靈敏度檢測Table3　Sensitivity of m-PCR for detection of artificially contaminated meat samples

3　討 論

傳統(tǒng)的檢測手段和PCR方法不利于帶有多種微生物的復(fù)雜食品樣品的檢測，因此兼顧檢測技術(shù)的自身優(yōu)勢和企業(yè)操作性的m-PCR已成為一種同時檢測多種微生物的快速、可靠的手段，隨著m-PCR技術(shù)的不斷建立和發(fā)展，檢測靈敏度將不斷提高，在一定程度上，m-PCR可能發(fā)展成一種半定量甚至定量的檢測方法［17］，在各大檢測技術(shù)中心具有良好的應(yīng)用前景。本研究利用該技術(shù)成功建立了同時檢測P. fluorescens、Salmonella、 L. monocytogenes的方法，適用于肉乳制品中這3 種菌的同時快速檢測。

m-PCR技術(shù)中，靶基因的選擇直接決定著檢測方法的可靠性和真實性。P. fluorescens的PCR檢測方法還處于起步階段，而其m-PCR檢測方法的建立有待更多的研究。Scarpellini等［18］針對16S rRNA基因設(shè)計了引物16SPSEFLuF/R，建立了區(qū)別P. fluorescens及第一組假單胞菌的方法；Martins等［19］根據(jù)apr基因設(shè)計出一對PCR引物檢測奶粉中的假單胞菌等嗜冷微生物；Irenehanning等［20］利用gyrB基因分析導(dǎo)致冷凍雞肉腐敗的微生物，將P. fl uorescens和莓實假單胞菌這兩種細(xì)菌和其他假單胞菌分開；楊一林［12］通過生物信息學(xué)篩選共得到P. fl uorescens的4 個備選檢測靶點gyrB、16S～23S rDNA基因區(qū)間序列、AraC、PFLU，設(shè)計引物并進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果表明依據(jù)gyrB基因設(shè)計的引物擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段一致，且無非特異性擴(kuò)增。因此本實驗選擇P. fluorescens的gyrB基因作為檢測的靶基因。目前檢測Salmonella的靶基因有ssrA、ompC、invA、pefA、sefA、agfA等，研究表明特異性最強(qiáng)的有pefA、sefA和invA，其中報道的已有2 000多種Salmonella血清型的菌株帶有侵襲蛋白基因invA，很多研究也表明該基因序列為屬間特有［13］，因此本實驗選擇Salmonella的invA基因作為檢測的靶基因。對于L. monocytogenes，很多研究針對不同的獨立基因（iap、inlB、16S rRNA等）進(jìn)行檢測，應(yīng)用最多的為編碼溶血素的基因hlyA［14］，相關(guān)研究已證明其種屬特異性［15］，因此本實驗選擇L. monocytogenes的hlyA基因作為檢測的靶基因。根據(jù)選定的3 個靶基因設(shè)計3 對特異性引物，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果與預(yù)期目的片段長度相符，且上海生工測序后的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析，表明即為目標(biāo)菌株。

對于一個有效的m-PCR方法，退火溫度、時間、引物濃度配比、Mg2+濃度與模板量的平衡等因素是非常重要的［21］。該方法優(yōu)化得到實驗條件為引物濃度0.2 μmol/L、退火溫度61.7 ℃、退火時間20 s、DNA聚合酶量2.5 U，這些條件的優(yōu)化有利于m-PCR檢測純目標(biāo)菌株及人工模擬肉制品同時污染3 種目標(biāo)菌株時得到更明確、清晰的條帶，從而得到更為準(zhǔn)確的檢測限。m-PCR方法具有靈敏度高的優(yōu)點，劉貝貝［22］根據(jù)無乳鏈球菌的sip基因、海豚鏈球菌的LctO基因以及P. fluorescens基因組的16SPSEFLuF/16SPSER基因序列設(shè)計引物，建立m-PCR方法，結(jié)果顯示能同時檢測到3 種菌的最低核酸濃度為6.557×10-2ng/μL。Zheng Pingguan等［23］用m-PCR特異性擴(kuò)增L. monocytogenes的hlyA基因，Salmonella的invA基因，大腸桿菌O157：H7的rfbE基因，金黃色葡萄球菌的nuc基因以及小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的ail基因，優(yōu)化后的m-PCR方法在豬肉制品中的檢測水平分別為9、142、670、51、33 CFU/mL。本研究建立的m-PCR方法同時檢測3 種純菌的DNA時，檢測限可達(dá)1 pg/μL；人工模擬3 種菌同時污染肉制品，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes的檢測限分別可達(dá)到9、5、70 CFU/mL。有報道表明大多數(shù)致病菌導(dǎo)致人體感染往往是其攝入量已超過103CFU/mL［24］，因此建立m-PCR方法的靈敏度對于威脅公共衛(wèi)生安全的P. fluorescens、Salmonella和L. monocytogenes的檢測是有效的。

4　結(jié) 論

本實驗優(yōu)化得到的m-PCR擴(kuò)增條件為引物濃度0.2 μmol/L、退火溫度61.7 ℃、退火時間20 s、DNA聚合酶量2.5 U，這些條件的優(yōu)化提高了反應(yīng)體系的特異性和靈敏度。建立的m-PCR方法同時檢測到P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes的DNA質(zhì)量濃度為1 pg/μL；人工模擬3 種菌同時污染肉制品經(jīng)過夜培養(yǎng)后，3 種菌的檢測限分別可達(dá)到9、5、70 CFU/mL。

本研究建立的檢測肉制品中常見的3 種有害微生物的m-PCR方法具有很高的特異性和靈敏度，該方法的建立相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法可節(jié)約大量的勞力、試劑、時間等，對于某些企業(yè)或分析檢驗中心大批量樣品的監(jiān)測具有指導(dǎo)意義。

［1］ LI M Y, ZHOU G H, XU X L, et al. Changes of bacterial diversity and main flora in chilled pork during storage using PCR-DGGE［J］. Food Microbiology, 2006, 23（7）： 607-611. DOI：10.1016/j.fm.2006.01.004.

［2］ PENA C, SUAREZ C, OCAMPO-SOSA A, et al. Effect of adequate single-drug vs combination antimicrobial therapy on mortality in Pseudomonas aeruginosa bloodstream infections： a post hoc analysis of a prospective cohort［J］. Clinical Infectious Diseases, 2013, 57（2）：208-216. DOI：10.1093/cid/cit223.Epub2013Apr11.

［3］ FREITAS C G, SANTANA A P, SILVA P H, et al. PCR multiplex for detection of Salmonella Enteritidis, Typhi and Typhimurium and occurrence in poultry meat［J］. International Journal of Food Microbiology, 2010, 139（1/2）： 15-22. DOI：10.1016/ j.ijfoodmicro.2010.02.007.Epub2010 Feb13.

［4］ OHL M E, MILLER S I. Salmonella： a model for bacterial pathogenesis［J］. Annual Review of Medicine, 2001, 52（1）： 259-274. DOI：10.1146/annurev.med.52.1.259.

［5］ GOULET V, HEDBERG C, MONNIER A, et al. Increasing incidence of listeriosis in France and other European countries［J］. Emerging Infectious Diseases, 2008, 14（5）： 734-740. DOI：10.3201/ eid1405.071395.

［6］ XU Y G, CUI L C, TIAN C Y, et al. A multiplex polymerase chain reaction coupled with high-performance liquid chromatography assay for simultaneous detection of six foodborne pathogens［J］. Food Control, 2012, 25（2）： 778-783. DOI：10.1016/j.foodcont.2011.12.014.

［7］ SEVERGNINI M, CREMONESII P, CONSOLANDI C, et al. Advances in DNA microarray technology for the detection of foodborne pathogens［J］. Food and Bioprocess Technology, 2011, 4（6）：936-953. DOI：10.1007/s11947-010-0430-5.

［8］ BAI S L, LI S C, YAO T, et al. Rapid detection of eight vegetable oils on optical thin-film biosensor chips［J］. Food Control, 2011, 22（10）：1624-1628. DOI：10.1016/j.foodcont.2011.03.019.

［9］ BABU L, REDDY P, MURALI H S, et al. Optimization and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of prominent foodborne pathogens of Enterobacteriaceae［J］. Annals of Microbiology, 2013, 63（4）： 1591-1599. DOI：10.1007/s13213-013-0622-0.

［10］ KUMAR A, GROVER S, BATISH V K. Exploring specific primers targeted against different genes for a multiplex PCR for detection of Listeria monocytogenes［J］. Biotech, 2015, 5（3）： 261-269. DOI：10.1007/s13205-014-0225-x.

［11］ PALLERONI N, KUNISAWA R, CONTOPOULOU R, et al. Nucleic acid homologies in the genus Pseudomonas［J］. International Journal of Systematic Bacteriology, 1973, 23（4）： 333-339. DOI：10.1099/00207713-23-4-333.

［12］ 楊一林. 熒光假單胞菌PCR檢測靶點的篩選及PCR檢測體系的建立［D］.上海： 上海交通大學(xué), 2011.

［13］ D'SOUZA D H, CRITZER F J, GOLDEN D A. Real-time reversetranscriptase polymerase chain reaction for the rapid detection of Salmonella using invA primers［J］. Foodborne Pathogens and Disease, 2009, 6（9）： 1097-1106. DOI：10.1089/fpd.2009.0322.

［14］ CHURCHILL R L, LEE H, HALL J C. Detection of Listeria monocytogenes and the toxin listeriolysin O in food［J］. Journal of Microbiological Methods, 2006, 64（2）： 141-170. DOI：10.1016/ j.mimet.2005.10.007.

［15］ CHOI W S, HONG C H. Rapid enumeration of Listeria monocytogenes in milk using competitive PCR［J］. International Journal of Food Microbiology, 2003, 84（1）： 79-85. DOI：10.1016/ S0168-1605（02）00401-4.

［16］ KUMAR S, BALAKRISHNA K, BATRA H. Detection of Salmonella enterica serovar Typhi （S. Typhi） by selective amplification of invA, viaB, fl iC-d and prt genes by polymerase chain reaction in mutiplex format［J］. Letters in Applied Microbiology, 2006, 42（2）： 149-154. DOI：10.1111/j.1472-765X.2005.01813.x.

［17］ SETTANNI L, CORSETTI A. The use of multiplex PCR to detect and differentiate food and beverage-associated microorganisms： a review［J］. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69（1）： 1-22. DOI：10.1016/j.mimet.2006.12.008.

［18］ SCARPELLINI M, FRANZETTI L, GALLI A. Development of PCR assay to identify Pseudomonas fluorescens and its biotype［J］. Fems Microbiology Letters, 2004, 236（2）： 257-260. DOI：10.1111/j.1574-6968.2004.tb09655.x.

［19］ MARTINS M L, DEARAUJO E F, MANTOVANI H C, et al. Detection of theaprgene in proteolytic psychrotrophic bacteria isolated from refrigerated raw milk［J］. International Journal of Food Microbiology, 2005, 102（2）： 203-211. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2004.12.016.

［20］ HANNING I, JARQUIN R, OLEARY A, et al. Polymerase chain reaction based assays for the detection and differentiation of poultry significant Pseudomonas［J］. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 2009, 17（4）： 490-502. DOI：10.1111/ j.1745-4581.2009.00185.x.

［21］ MARKOULATOS P, SIAFAKAS N, MONCANY M. Multiplex polymerase chain reaction： a practical approach［J］. Journal of Clinical Laboratory Analysis, 2002, 16（1）： 47-51. DOI：10.1002/jcla.2058.

［22］ 劉貝貝. 無乳鏈球菌、海豚鏈球菌及熒光假單胞菌多重PCR檢測方法的建立和應(yīng)用［D］. 成都： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

［23］ ZHENG P G, YUN J, FENG G, et al. Rapid and simultaneous analysis of five foodborne pathogenic bacteria using multiplex PCR［J］. European Food Research and Technology, 2013, 237（4）： 627-637. DOI：10.1007/s00217-013-2039-1.

［24］ CROOK J. EPA Guidelines for water reuse［C］//Washington： United States Environmental Protection Agency, 1991： 2907-2912.

A Multiplex PCR Method for Simultaneous Detection of Pseudomonas fluorescens, Salmonella and Listeria monocytogenes

HU Bingxue1, SHU Yanyan1, PAN Daodong1,2,*, ZENG Xiaoqun1, WU Zhen1
（1. Key Laboratory of Animal Protein Food Deep Processing Techhology of Zhejiang Province, Ningbo University, Ningbo 315211, China；2. Baranch of National Dairy Processing Technology Developing Center, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China）

Pseudomonas fluorescens （P. fluorescens）, Salmonella and Listeria monocytogenes （L. monocytogenes） are 3 species of bacteria that contaminate meat products. The aim of this work was to establish a feasible multiplex polymerase chain reaction （m-PCR） protocol for simultaneous and rapid detection of these 3 species of bacteria. The specifi c primers for the gyrB gene of P. fl uorescens, the invA gene of Salmonella and the hlyA gene of L. monocytogenes were designed and their specifi cities were determined. In addition, the sensitivities for detecting 3 standard strains and these strains enriched on meat overnight were tested as well. The results indicated that the m-PCR method had high specifi city and sensitivity. For simultaneous detection of these target microorganisms, the limit of detection （LOD） for pure DNA was 1 pg/μL, and the LOD for P. fl uorescens， Salmonella and L. monocytogenes were 9, 5, and 70 CFU/mL, respectively, by inoculating these 3 strains onto duck meat and overnight culturing at 35 ℃.

multiplex PCR； detection method； Pseudomonas fl uorescens； Salmonella； Listeria monocytogenes

10.7506/spkx1002-6630-201620036

R155.31

A

1002-6630（2016）20-0209-06

胡冰雪, 舒沿沿, 潘道東, 等. 熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌多重PCR檢測方法的建立［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 209-214. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620036. http：//www.spkx.net.cn

HU Bingxue, SHU Yanyan, PAN Daodong, et al. A multiplex PCR method for simultaneous detection of Pseudomonas fluorescens, Salmonella and Listeria monocytogenes［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 209-214. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620036. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-09

浙江省科技廳公益性項目（2014C32051）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD17B02-3）

胡冰雪（1992—），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：1411085832@nbu.edu.cn

潘道東（1964—），男，教授，博士，研究方向為畜乳產(chǎn)品加工與安全。E-mail：daodongpan@163.com