熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌多重PCR檢測(cè)方法的建立

胡冰雪，舒沿沿，潘道東,2,，曾小群，吳　振

（1.寧波大學(xué) 浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.南京師范大學(xué) 國(guó)家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097）

熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌多重PCR檢測(cè)方法的建立

胡冰雪1，舒沿沿1，潘道東1,2,*，曾小群1，吳振1

（1.寧波大學(xué) 浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.南京師范大學(xué) 國(guó)家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097）

針對(duì)肉制品中易污染的熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌等有害微生物，通過(guò)3 種標(biāo)準(zhǔn)菌株及肉制品建立多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，實(shí)現(xiàn)肉制品中這3 種菌的同時(shí)、快速檢測(cè)。利用熒光假單胞菌的gyrB基因、沙門氏菌的invA基因和單增李斯特菌的hlyA基因設(shè)計(jì)3 對(duì)特異性引物，在確定引物特異性的基礎(chǔ)上，對(duì)3 種標(biāo)準(zhǔn)菌株及在冷卻肉上過(guò)夜富集后進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。結(jié)果表明，該多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法對(duì)于同時(shí)檢測(cè)這3 種有害微生物具有高度的特異性；同時(shí)檢測(cè)這3 種菌時(shí)，純菌DNA檢測(cè)限可達(dá)1 pg/μL；將3 種菌一起接種到冷卻肉中35 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的檢測(cè)限分別可達(dá)到9、5、70 CFU/mL。

多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；檢測(cè)方法；熒光假單胞菌；沙門氏菌；單增李斯特菌

肉制品因其需求量大、營(yíng)養(yǎng)豐富及易于消化等特點(diǎn)而受到各個(gè)年齡階層的歡迎。然而，由于其水分含量高、必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，為各種腐敗菌、致病菌的生長(zhǎng)繁殖提供了基質(zhì)，導(dǎo)致肉制品容易受到各種微生物污染［1］。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種嗜冷微生物，易污染冷藏中的生肉、生牛乳等高脂肪、高蛋白的食品，在冷藏的生肉、碎肉中都是優(yōu)勢(shì)菌群。臨床研究表明，P. fluorescens自溶后釋放內(nèi)毒素，內(nèi)毒素中的磷脂成分污染了血制品，會(huì)導(dǎo)致病人輸血后產(chǎn)生不可逆的休克、彌漫性血管內(nèi)凝血［2］，是典型的條件致病菌。沙門氏菌（Salmonella）存在地域性廣、發(fā)病率高和大范圍食物污染等特點(diǎn)，在引起食物中毒的病原菌中一直占據(jù)首位［3-4］。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）在4 ℃仍可生長(zhǎng)，主要通過(guò)肉乳及其制品引起人的感染發(fā)病，成為僅次于Salmonella感染引起的第二號(hào)致命的食源性感染疾病［5］。因此，快速檢測(cè)和鑒別冷卻肉中有害微生物是保障肉品質(zhì)量安全，防止食源性疾病爆發(fā)的有效手段。

對(duì)于食品微生物的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)法過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大，一般需要4～7 d才能出檢測(cè)結(jié)果。免疫學(xué)方法具有特異性好、敏感度高的優(yōu)點(diǎn)，但由于微生物血清型復(fù)雜，檢測(cè)中常出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果需要其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）成為肉制品中有害微生物檢測(cè)的重要技術(shù)手段［6］。在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的多重-PCR（multiplex PCR，m-PCR）技術(shù)，是在普通PCR基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目的核酸片段，快速檢測(cè)或鑒定多種微生物的技術(shù)［7］，該技術(shù)不需要大量、昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，同時(shí)對(duì)于肉制品中主要的有害微生物又能實(shí)現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)、高特異性和高靈敏度的檢測(cè)［8］。然而，m-PCR方法的建立主要集中于Salmonella［9］、L. monocytogenes［10］等典型致病菌，對(duì)于極易污染肉乳制品的P. fl uorescens快速、有效的檢測(cè)方法尚不成熟。雖然目前尚未出現(xiàn)由P. fl uorescens所引起的大規(guī)模食物中毒事件，但隨著人們飲食習(xí)慣的改變、冰箱的普及和不合理使用，食品中該菌對(duì)健康的危害及引起食物中毒的可能性會(huì)越來(lái)越越大，因此建立該菌的快速檢測(cè)方法迫在眉睫。但是假單胞菌屬是一個(gè)很大的群體，Palleroni等［11］研究表明其至少可以分為5 個(gè)生物變型，這就使得其分子生物學(xué)檢測(cè)方法的建立存在一定難度，PCR方法是現(xiàn)階段最快速最有效的檢測(cè)P. fluorescens的技術(shù)，而其m-PCR檢測(cè)方法的建立極不成熟。

鑒于此，本研究旨在建立一種應(yīng)用于復(fù)雜食品基質(zhì)如冷卻肉中P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes的同時(shí)、快速、高效的m-PCR檢測(cè)方法，對(duì)于肉制品的常規(guī)監(jiān)測(cè)及減少有害微生物的潛在危害具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)所用菌株名稱和來(lái)源見表1，部分菌株從菌種庫(kù)直接購(gòu)買，另外一部分由浙江省疾病預(yù)防控制中心提供。實(shí)驗(yàn)菌株均用甘油管-40 ℃保藏。

表1　菌株及引物特異性驗(yàn)證Table1　Specificity of the primers for different bacterial strains

1.1.2培養(yǎng)基與試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)所用引物序列由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，測(cè)序工作委托上海生工完成；DNA聚合酶等PCR反應(yīng)試劑 北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA抽提試劑盒（D3350） 大連寶生物工程有限公司。

1.1.3儀器與設(shè)備

Multigene Thermal Cycler型PCR儀 美國(guó)Labnet公司；Universal HoodⅡ型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TH-YJ-1450A/B型凈化工作臺(tái) 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司；Centerifuge 5415R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Mini Drop型超微量分光光度計(jì) 上海依科賽生物制品有限公司；H2500R-2型和H-2050R型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYCP-31DN型核酸電泳儀 北京六一生物科技有限公司；AL204型和PL4002型電子天平、FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 美國(guó)Mettler Toledo公司；GT16-3M型迷你離心機(jī) 杭州米歐儀器有限公司；HtPot40型恒溫金屬浴麥稷橋國(guó)際貿(mào)易有限公司；HJ-4型磁力攪拌器 常州申光儀器有限公司；QHZ-12A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)［12-15］中提到的3 種菌的特異性靶基因，即P. fluorescens的gyrB基因、Salmonella的invA基因和L. monocytogenes的hlyA基因，應(yīng)用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，確保引物之間無(wú)二聚體形成，并對(duì)各引物間的互補(bǔ)性、最佳退火溫度進(jìn)行了分析，獲得了3 對(duì)特異性引物（表2）。3 對(duì)引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，擴(kuò)增片段大小依次為271、482 bp和592 bp。

表2　3對(duì)引物序列及相關(guān)參數(shù)Table2　Sequences and parameters of the primers

1.2.2細(xì)菌DNA提取

購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌株采用推薦培養(yǎng)基活化后涂平板，挑取單個(gè)菌落在35 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)，根據(jù)渾濁度判斷細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，待生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后取3 mL菌液，按Omega biotek公司Bacteria DNA Kit試劑盒（D3350）的操作說(shuō)明提取細(xì)菌基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.3單重PCR反應(yīng)體系的建立

單重PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5 μL，各2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，2.5 U/μL的DNA聚合酶0.75 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的瓊脂糖、120 V電壓進(jìn)行凝膠電泳，割膠回收后的產(chǎn)物送上海生工測(cè)序鑒定。

1.2.4m-PCR反應(yīng)體系建立及優(yōu)化

以P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes提取的DNA為模板，與各種反應(yīng)試劑混合在一起進(jìn)行m-PCR反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化，以建立最佳的m-PCR方法。優(yōu)化的條件主要包括引物濃度配比、退火溫度、退火時(shí)間、DNA聚合酶量等。

1.2.5m-PCR特異性實(shí)驗(yàn)

m-PCR引物特異性實(shí)驗(yàn)分為兩部分，首先是驗(yàn)證引物對(duì)目標(biāo)菌DNA的特異性：分別向3 種目標(biāo)菌的單一DNA、兩兩混合DNA、全部混合DNA中加入3 對(duì)混合引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其次是驗(yàn)證引物對(duì)非目標(biāo)菌DNA沒(méi)有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。

1.2.6m-PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)

首先，將3 種菌的DNA質(zhì)量濃度調(diào)整為102ng/μL，再梯度稀釋為101、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL，采用優(yōu)化后的方法進(jìn)行m-PCR擴(kuò)增，測(cè)定能檢測(cè)到PCR擴(kuò)增條帶的最低模板質(zhì)量濃度。

1.2.7人工模擬污染肉制品檢測(cè)靈敏度

污染肉湯樣品的方法參照Kumar等［16］的方法稍作改進(jìn)。取100 g冰鮮鴨肉加入100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，徹底漂洗后在無(wú)菌均質(zhì)袋中均質(zhì)1 min，分成10 等分，3 000 r/min離心5 min，懸浮液取出后用0.45 μm濾膜過(guò)濾，過(guò)濾好的肉湯冷藏于-20 ℃條件下待用。

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的3 種菌梯度稀釋，并對(duì)10-6、10-7、10-8、10-94個(gè)稀釋度分別進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。同時(shí)接入3 種菌的梯度稀釋液，使得每20 mL肉湯中3 種菌的最終濃度分別為100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL，對(duì)照組接入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液。接種好菌液的肉湯在200 r/min條件下振蕩10 min，使菌體充分懸浮，再往每份肉湯中加入80 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，使得樣品體積∶總體積≈1∶10，將肉湯與培養(yǎng)基混合均勻后在35 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，各濃度梯度取1 mL菌液用Omega biotek公司bacteria DNA kit（D3350）提取DNA作為PCR模板，從而確定m-PCR方法檢測(cè)3 種菌在肉制品中過(guò)夜富集后的靈敏度。

2　結(jié)果與分析

2.1單重PCR特異性實(shí)驗(yàn)

圖1　單重PCR產(chǎn)物的凝膠電泳Fig.1　Agarose gel electrophoresis of simplex PCR products

3 種目標(biāo)菌進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物與模板之間的特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。泳道1的擴(kuò)增條帶位于500～700 bp之間，與L. monocytogenes的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符；泳道2的擴(kuò)增條帶位于400～500 bp之間，與Salmonella的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符；泳道3的擴(kuò)增條帶位于200～300 bp之間，與P. fluorescens的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符。將PCR擴(kuò)增后的3 個(gè)目的片段測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果顯示，測(cè)序結(jié)果與NCBI中L. monocytogenes相應(yīng)基因序列的同源性為100%，與Salmonella相應(yīng)基因序列的同源性為99%，與P. fl uorescens相應(yīng)基因序列的同源性為99%。

2.2m-PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件的優(yōu)化

分別對(duì)3 種目標(biāo)菌的3 對(duì)引物濃度配比、退火溫度、退火時(shí)間、DNA聚合酶量進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果（圖2）如下：10×PCR緩沖液5 μL，各2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，2.5 U/μL的DNA聚合酶1 μL，3 種菌的上、下游引物各1 μL，模板各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)過(guò)程如下：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，61.7 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)3 條清晰的條帶，大小分別約為592、482、271 bp。

圖2　m-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.2　Optimization of multiplex PCR reaction conditions

2.3m-PCR反應(yīng)特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)所用引物的特異性，上述3 對(duì)引物先與P. fl uorescens、Salmonella、L. monocytogenes 3 種目標(biāo)菌的DNA進(jìn)行錯(cuò)配，按照上述優(yōu)化后的m-PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。其中，泳道1為三模板，2～4為雙模板，5～7為單一模板，均加入3 對(duì)混合引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明每對(duì)引物只與對(duì)應(yīng)模板結(jié)合，擴(kuò)增出了相應(yīng)大小的目的片段。

同時(shí)，驗(yàn)證3 對(duì)引物與其他非致病菌如浙江省疾病預(yù)防控制中心提供的Pseudomonas putida、Pseudomonas stutzeri、Listeria sake、Listeria sheep、Shigella、Vibrio harveyi、Vibrio vulnifi cus、Escherichia coli ATCC25922、Staphylococcus aureus ATCC6538進(jìn)行PCR反應(yīng)。以所有實(shí)驗(yàn)菌株提取的單一DNA為模板，同時(shí)加入3 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

圖3　m-PCR特異性實(shí)驗(yàn)Fig.3　Specificity of the m-PCR assay

2.4m-PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

首先將從3 種菌提取的DNA質(zhì)量濃度調(diào)整為102ng/μL，再按照101、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL分別進(jìn)行質(zhì)量濃度梯度稀釋，采用建立的m-PCR方法擴(kuò)增后，結(jié)果顯示模板質(zhì)量濃度為10-3ng/μL時(shí)能出現(xiàn)微弱的條帶，當(dāng)模板質(zhì)量濃度低于10-3ng/μL時(shí)條帶消失，因此能同時(shí)檢測(cè)到3 種菌的最低模板質(zhì)量濃度為10-3ng/μL（圖4）。

圖4　m-PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)Fig.4　Sensitivity of the m-PCR assay

2.5人工模擬污染實(shí)際樣品的靈敏度檢測(cè)結(jié)果

考慮到冷卻肉中原有腐敗菌的數(shù)量和肉品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)菌生長(zhǎng)和檢測(cè)的影響，本實(shí)驗(yàn)利用人工模擬實(shí)際樣品污染，對(duì)m-PCR方法檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)的靈敏度進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)富集培養(yǎng)之后，模擬肉湯中P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes的檢測(cè)限分別為9、5、70 CFU/mL（表3）。

表3　人工模擬肉制品污染的m-PCR靈敏度檢測(cè)Table3　Sensitivity of m-PCR for detection of artificially contaminated meat samples

3　討 論

傳統(tǒng)的檢測(cè)手段和PCR方法不利于帶有多種微生物的復(fù)雜食品樣品的檢測(cè)，因此兼顧檢測(cè)技術(shù)的自身優(yōu)勢(shì)和企業(yè)操作性的m-PCR已成為一種同時(shí)檢測(cè)多種微生物的快速、可靠的手段，隨著m-PCR技術(shù)的不斷建立和發(fā)展，檢測(cè)靈敏度將不斷提高，在一定程度上，m-PCR可能發(fā)展成一種半定量甚至定量的檢測(cè)方法［17］，在各大檢測(cè)技術(shù)中心具有良好的應(yīng)用前景。本研究利用該技術(shù)成功建立了同時(shí)檢測(cè)P. fluorescens、Salmonella、 L. monocytogenes的方法，適用于肉乳制品中這3 種菌的同時(shí)快速檢測(cè)。

m-PCR技術(shù)中，靶基因的選擇直接決定著檢測(cè)方法的可靠性和真實(shí)性。P. fluorescens的PCR檢測(cè)方法還處于起步階段，而其m-PCR檢測(cè)方法的建立有待更多的研究。Scarpellini等［18］針對(duì)16S rRNA基因設(shè)計(jì)了引物16SPSEFLuF/R，建立了區(qū)別P. fluorescens及第一組假單胞菌的方法；Martins等［19］根據(jù)apr基因設(shè)計(jì)出一對(duì)PCR引物檢測(cè)奶粉中的假單胞菌等嗜冷微生物；Irenehanning等［20］利用gyrB基因分析導(dǎo)致冷凍雞肉腐敗的微生物，將P. fl uorescens和莓實(shí)假單胞菌這兩種細(xì)菌和其他假單胞菌分開；楊一林［12］通過(guò)生物信息學(xué)篩選共得到P. fl uorescens的4 個(gè)備選檢測(cè)靶點(diǎn)gyrB、16S～23S rDNA基因區(qū)間序列、AraC、PFLU，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明依據(jù)gyrB基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段一致，且無(wú)非特異性擴(kuò)增。因此本實(shí)驗(yàn)選擇P. fluorescens的gyrB基因作為檢測(cè)的靶基因。目前檢測(cè)Salmonella的靶基因有ssrA、ompC、invA、pefA、sefA、agfA等，研究表明特異性最強(qiáng)的有pefA、sefA和invA，其中報(bào)道的已有2 000多種Salmonella血清型的菌株帶有侵襲蛋白基因invA，很多研究也表明該基因序列為屬間特有［13］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇Salmonella的invA基因作為檢測(cè)的靶基因。對(duì)于L. monocytogenes，很多研究針對(duì)不同的獨(dú)立基因（iap、inlB、16S rRNA等）進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用最多的為編碼溶血素的基因hlyA［14］，相關(guān)研究已證明其種屬特異性［15］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇L. monocytogenes的hlyA基因作為檢測(cè)的靶基因。根據(jù)選定的3 個(gè)靶基因設(shè)計(jì)3 對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符，且上海生工測(cè)序后的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，表明即為目標(biāo)菌株。

對(duì)于一個(gè)有效的m-PCR方法，退火溫度、時(shí)間、引物濃度配比、Mg2+濃度與模板量的平衡等因素是非常重要的［21］。該方法優(yōu)化得到實(shí)驗(yàn)條件為引物濃度0.2 μmol/L、退火溫度61.7 ℃、退火時(shí)間20 s、DNA聚合酶量2.5 U，這些條件的優(yōu)化有利于m-PCR檢測(cè)純目標(biāo)菌株及人工模擬肉制品同時(shí)污染3 種目標(biāo)菌株時(shí)得到更明確、清晰的條帶，從而得到更為準(zhǔn)確的檢測(cè)限。m-PCR方法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，劉貝貝［22］根據(jù)無(wú)乳鏈球菌的sip基因、海豚鏈球菌的LctO基因以及P. fluorescens基因組的16SPSEFLuF/16SPSER基因序列設(shè)計(jì)引物，建立m-PCR方法，結(jié)果顯示能同時(shí)檢測(cè)到3 種菌的最低核酸濃度為6.557×10-2ng/μL。Zheng Pingguan等［23］用m-PCR特異性擴(kuò)增L. monocytogenes的hlyA基因，Salmonella的invA基因，大腸桿菌O157：H7的rfbE基因，金黃色葡萄球菌的nuc基因以及小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的ail基因，優(yōu)化后的m-PCR方法在豬肉制品中的檢測(cè)水平分別為9、142、670、51、33 CFU/mL。本研究建立的m-PCR方法同時(shí)檢測(cè)3 種純菌的DNA時(shí)，檢測(cè)限可達(dá)1 pg/μL；人工模擬3 種菌同時(shí)污染肉制品，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes的檢測(cè)限分別可達(dá)到9、5、70 CFU/mL。有報(bào)道表明大多數(shù)致病菌導(dǎo)致人體感染往往是其攝入量已超過(guò)103CFU/mL［24］，因此建立m-PCR方法的靈敏度對(duì)于威脅公共衛(wèi)生安全的P. fluorescens、Salmonella和L. monocytogenes的檢測(cè)是有效的。

4　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的m-PCR擴(kuò)增條件為引物濃度0.2 μmol/L、退火溫度61.7 ℃、退火時(shí)間20 s、DNA聚合酶量2.5 U，這些條件的優(yōu)化提高了反應(yīng)體系的特異性和靈敏度。建立的m-PCR方法同時(shí)檢測(cè)到P. fluorescens、Salmonella、L. monocytogenes的DNA質(zhì)量濃度為1 pg/μL；人工模擬3 種菌同時(shí)污染肉制品經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，3 種菌的檢測(cè)限分別可達(dá)到9、5、70 CFU/mL。

本研究建立的檢測(cè)肉制品中常見的3 種有害微生物的m-PCR方法具有很高的特異性和靈敏度，該方法的建立相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)方法可節(jié)約大量的勞力、試劑、時(shí)間等，對(duì)于某些企業(yè)或分析檢驗(yàn)中心大批量樣品的監(jiān)測(cè)具有指導(dǎo)意義。

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A Multiplex PCR Method for Simultaneous Detection of Pseudomonas fluorescens, Salmonella and Listeria monocytogenes

HU Bingxue1, SHU Yanyan1, PAN Daodong1,2,*, ZENG Xiaoqun1, WU Zhen1
（1. Key Laboratory of Animal Protein Food Deep Processing Techhology of Zhejiang Province, Ningbo University, Ningbo 315211, China；2. Baranch of National Dairy Processing Technology Developing Center, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China）

Pseudomonas fluorescens （P. fluorescens）, Salmonella and Listeria monocytogenes （L. monocytogenes） are 3 species of bacteria that contaminate meat products. The aim of this work was to establish a feasible multiplex polymerase chain reaction （m-PCR） protocol for simultaneous and rapid detection of these 3 species of bacteria. The specifi c primers for the gyrB gene of P. fl uorescens, the invA gene of Salmonella and the hlyA gene of L. monocytogenes were designed and their specifi cities were determined. In addition, the sensitivities for detecting 3 standard strains and these strains enriched on meat overnight were tested as well. The results indicated that the m-PCR method had high specifi city and sensitivity. For simultaneous detection of these target microorganisms, the limit of detection （LOD） for pure DNA was 1 pg/μL, and the LOD for P. fl uorescens， Salmonella and L. monocytogenes were 9, 5, and 70 CFU/mL, respectively, by inoculating these 3 strains onto duck meat and overnight culturing at 35 ℃.

multiplex PCR； detection method； Pseudomonas fl uorescens； Salmonella； Listeria monocytogenes

10.7506/spkx1002-6630-201620036

R155.31

A

1002-6630（2016）20-0209-06

胡冰雪, 舒沿沿, 潘道東, 等. 熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌多重PCR檢測(cè)方法的建立［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 209-214. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620036. http：//www.spkx.net.cn

HU Bingxue, SHU Yanyan, PAN Daodong, et al. A multiplex PCR method for simultaneous detection of Pseudomonas fluorescens, Salmonella and Listeria monocytogenes［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 209-214. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620036. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-09

浙江省科技廳公益性項(xiàng)目（2014C32051）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD17B02-3）

胡冰雪（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：1411085832@nbu.edu.cn

潘道東（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾笕楫a(chǎn)品加工與安全。E-mail：daodongpan@163.com