濃縮果汁中耐熱霉菌的分析及鑒定

童　迅，高　雯，黃庭軒，周幗萍

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

濃縮果汁中耐熱霉菌的分析及鑒定

童迅，高雯，黃庭軒，周幗萍*

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

目的：檢測15 個(gè)批次濃縮果汁中的耐熱霉菌并對其進(jìn)行鑒定。方法：80 ℃、30 min熱處理后涂布平板菌落計(jì)數(shù)法分離和計(jì)數(shù)濃縮果汁中的耐熱霉菌，分離純化后觀察其顯微形態(tài)和菌落形態(tài)，再采用28S rDNA序列分析鑒定霉菌的種屬。結(jié)果：這15 批次濃縮果汁中有8 個(gè)樣品檢出耐熱霉菌，檢出率達(dá)53.3%；檢出的耐熱霉菌以正青霉（Eupenicillium）和籃狀菌（Talaromyces）為主，還有少量白耙齒菌、栓菌和座囊菌屬。結(jié)論：進(jìn)口或國產(chǎn)濃縮果汁都存在耐熱霉菌污染，其中尤其值得注意的是檢出了既耐熱又能產(chǎn)生真菌毒素的正青霉和籃狀菌。

濃縮果汁；耐熱霉菌；檢測與鑒定；正青霉；籃狀菌

果汁富含多種營養(yǎng)素，是健康食品，廣受人們的青睞［1］。由于果汁的pH值很低，多數(shù)在2.4～4.2之間，屬于高酸性飲料；此外果汁中富含糖分，這種高滲條件對很多微生物有抑制作用，因而能在果汁中生長繁殖的只有一些酵母、霉菌和極少數(shù)的細(xì)菌［2］。

為保持營養(yǎng)，果汁飲料一般是采用巴氏殺菌工藝采用80～90 ℃時(shí)間為15 s到數(shù)分鐘［3-4］，殺菌后發(fā)生渾濁變質(zhì)多數(shù)是由耐熱霉菌造成。所謂的耐熱霉菌一般是指能夠耐受75 ℃、30 min或更高溫度及更長時(shí)間的霉菌。真菌能夠耐受這樣高溫是因?yàn)榫哂刑厥鈽?gòu)造，包括子囊孢子、某些厚垣孢子、厚壁菌絲或菌核。近些年來由這些耐熱真菌引起的食品變質(zhì)事件越來越多，多變擬青霉（Paecilomycesvariotii）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、絲衣霉（Byssochlamysfulva和B. nivea）、籃狀菌（Talaromyces trachyspermus）、新薩托菌（Neosartorya）和布氏正青霉（Eupenicillium brefeldianum）在巴氏殺菌果汁，乳制品和軟飲料中經(jīng)常有檢出［5］。

這些耐熱真菌能產(chǎn)生多種有毒的次生代謝產(chǎn)物，如：絲衣霉毒素A、絲衣霉酸、致癌物、棒曲霉素、震顫素、煙曲霉震顫素A/C、疣孢青霉原及Fischerin［5］。我國目前對耐熱霉菌的檢測等研究偏少［6-10］，但是已經(jīng)有不少關(guān)于耐熱真菌毒素的檢測方法研究［11-17］。

本研究分析了某企業(yè)提供的15 批次濃縮果汁中耐熱霉菌的含菌量，對這些分離株進(jìn)行分析和鑒定，以分析耐熱霉菌在濃縮果汁中的潛在危害，并制定適合企業(yè)的耐熱霉菌檢測方法和技術(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

樣品某飲料廠提供的15 份濃縮果汁樣品，詳見表1。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、麥芽汁肉湯（malt extract broth，MEB）培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

Premix Taq（TaKaRaTaq Version2.0 plus dye） 日本TaKaRa公司；Ezup柱式基因組DNA（真菌）抽提試劑盒生工生物工程（上海）公司。

1.2儀器與設(shè)備

Thermal Cycler T100型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6C型穩(wěn)壓電泳儀 北京市六一儀器廠；Centeifuge 5424R型高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；GeneGenius全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 美國Syngene公司；Eclipse 80i顯微鏡日本Nikon公司。

1.3方法

1.3.1樣品中微生物的檢測與計(jì)數(shù)

采用稀釋涂布平板法進(jìn)行樣品中真菌的檢測與計(jì)數(shù)。在超凈工作臺(tái)中取樣品果汁25 mL于已滅菌的藍(lán)蓋瓶中，振蕩后80 ℃水浴30 min，取1 mL涂布于PDA平板（直徑120 mm）上，每個(gè)樣做兩個(gè)平行，再采用parafi lm封口的方法封口，于28 ℃培養(yǎng)14～21 d，每7 d觀察計(jì)數(shù)1 次，同時(shí)，根據(jù)菌落的形狀、大小和顏色等外觀特征，挑取單菌落進(jìn)行分離和純化。計(jì)數(shù)（CFU）取2 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.3.2菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察［18］

在28 ℃恒溫培養(yǎng)期間每7 d觀察并記錄1 次培養(yǎng)皿中霉菌生長情況及菌落形態(tài)，同時(shí)挑取單菌落，對單菌落進(jìn)行小培養(yǎng)，在Eclipse 80i尼康顯微鏡系統(tǒng)下進(jìn)行顯微觀察并拍照記錄。

1.3.328S rDNA序列分析［6,19-20］

引物：采用約600 bp的28S rDNA基因片段的擴(kuò)增引物NL-1 GCATCGATGAAGAACGCAGC和NL-4 GGTCCGT GTTTCAAGACGG。

DNA模板的制備：從PDA平板上挑取菌種到MEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24～72 h獲取足量菌絲球，采用液氮研磨法獲取粗DNA樣品，再用Ezup柱式基因組DNA（真菌）抽提試劑盒純化DNA模板。

PCR體系和條件：50 μL PCR體系：Taq酶0.5 μL；10×PCR Buffer 8 μL；2.5 mmol/L的d NTP 4 μL；2 個(gè)10 mmol/L引物各2 μL；DNA模板10 μL；無菌MiliQ水23.5 μL。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火60 s（NL1-NL4），72 ℃延伸2 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，GoldView（GV）染色，凝膠成像分析儀觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

PCR產(chǎn)物測序及序列比對：PCR產(chǎn)物，送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。在http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/上通過BLASTN比對。

2　結(jié)果與分析

2.1污染菌菌落及顯微形態(tài)分析

圖1　M-6正青霉的形態(tài)Fig.1　Morphology of E. crustaceum M-6

由圖1A可見，M-6正青霉菌落在PDA上28 ℃培養(yǎng)10 d，直徑40～50 mm，中心稍凹陷，有少量皺紋；質(zhì)地絮狀兼絨狀，近于灰綠色，滲出液黃色。由圖1B可見，呈掃帚狀，帚狀枝不規(guī)則；分生孢子梗發(fā)生于表面菌絲，孢子梗較短，具有三輪分生孢子梗；孢子鏈長且排列緊密，分生孢子呈橢球形。

圖2　M-15籃狀菌的形態(tài)Fig.2　Morphology of T. funiculosus M-15

由圖2A可見，M-15籃狀菌菌落在PDA上28 ℃培養(yǎng)10 d，直徑35～45 mm，中心凹陷，質(zhì)地絮狀，灰白色，滲出液缺乏。由圖2B可見，具有典型的帚狀枝，分生孢子梗發(fā)生于氣生菌絲，孢梗莖較長，壁光滑；具有兩輪分生孢子梗，分生孢子卵圓形，孢子鏈短且疏松。

2.2分離株DNA的28S rDNA序列分析

圖3　分離株的28S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3　Electropherogram of PCR amplification products of 28S rDNA from some isolates

提取分離所得到的菌株的DNA模板，進(jìn)行rDNA片段的PCR擴(kuò)增，得到單一條帶，如圖3所示。再對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測以及測序。將測序所得結(jié)果通過BLAST進(jìn)行比對。根據(jù)序列相似性加以鑒定。鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表1所示。

從表1可見，15 份樣品中共有8 個(gè)樣品檢出了耐熱霉菌，檢出率為53.3%，含菌量最高者達(dá)到3 CFU/mL。在耐熱霉菌中最為常見的是籃狀菌屬T. funiculosus在6種不同樣品中均有檢出，包括脫色脫酸蘋果汁、芒果汁、梨汁、進(jìn)口和國產(chǎn)橙汁，檢出率為40.0%；其次為正青霉E. crustaceum在3 種不同樣品中均有檢出，包括梨汁和進(jìn)口橙汁，檢出率為20.0%；有擔(dān)子菌綱-白耙齒菌Irpex lacteus在國產(chǎn)梨汁和橙汁2 個(gè)樣品中有檢出，檢出率為13.3%；另外有少量擔(dān)子菌綱-拴菌屬Trametes sp.和子囊菌門Dothideomycetes的枝孢菌屬Cladosporium分別在脫色脫酸蘋果汁和進(jìn)口橙汁中有檢出。

如表1和圖4所示，經(jīng)BLASTN和MEGA 6.0軟件進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)最初分離的15 個(gè)菌株實(shí)際只有5 個(gè)不同的屬，分屬T. funiculosus、E. crustaceum、Irpex lacteus、Trametes sp.。這15 個(gè)菌株與其對應(yīng)的相似度最高的菌株相似度均達(dá)到98%以上，可以確定它們與相似度最高的菌株為同一種類。本實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果中出現(xiàn)的主要的耐熱真菌為正青霉屬（Eupenicillium）和籃狀菌屬（Talaromyces）都是青霉的有性型屬，屬于子囊菌亞門（Ascomycotina），不整子囊綱（Plectomyces），散囊菌目（Eurotiales），發(fā)菌科（Trichocomaceae）［21］。同時(shí)，將測序結(jié)果提交至Genbank獲得了對應(yīng)的基因登錄號。

表1　濃縮果汁樣品和分離株序列分析Table1　Summary of concentrated juice samples and 28S rDNA sequences analysis of the isolates from them

圖4　耐熱霉菌28S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Phylogenetic tree based on 28S rDNA sequences of the isolated heat-resistant molds

3　討 論

濃縮果汁的高酸高滲環(huán)境使微生物不能繁殖，多數(shù)以孢子等各種形式休眠，但是一旦還原為10%～100%等果汁產(chǎn)品，存活下來的耐熱霉菌孢子就可以萌發(fā)、繁殖和產(chǎn)毒，所以即使少量耐熱霉菌的污染也能帶來后續(xù)加工的食品安全隱患。果汁中耐熱真菌的檢測方法目前還有很多爭議，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。在如何選擇恰當(dāng)培養(yǎng)基種類，合適的培養(yǎng)時(shí)間和采樣量（體積）等各方面都存在諸多問題［5,22］。濃縮果汁則更復(fù)雜，因?yàn)? 倍高度濃縮后近乎漿狀半固體，不易做均質(zhì)和澆混等操作，但是一旦稀釋后又減少了采樣量提高了檢測閾值。一些研究者建議采用澆混法計(jì)數(shù)，但是過于濃稠的濃縮果汁采用澆混法很難保證樣品在皿中均勻分布，而且分布在培養(yǎng)基內(nèi)部和底部的真菌由于缺氧等因素生長遲緩，也很難觀察和取樣進(jìn)行后續(xù)分析。所以選用的是涂布法，采用12 cm的大皿，涂布1 mL樣品，正置培養(yǎng)。檢測時(shí)由于部分真菌生長慢，所以檢測時(shí)間需要至少10～14 d，甚至更長，這就難免產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)霉菌污染和培養(yǎng)基干燥等問題。特別是污染問題令人頭痛，很多研究者建議采用采樣袋密封等方法［5,22］，也不能完全避免污染。本實(shí)驗(yàn)采用了parafilm封口的方法，但是14 d左右長時(shí)間的保溫封口膜也會(huì)發(fā)生干裂，出現(xiàn)裂隙。所以對凡是菌落中心出現(xiàn)在培養(yǎng)皿邊緣的霉菌還是要考慮是否為污染菌的可能；另外凡是序列比對鑒定的結(jié)果中只有無性型真菌，也很可能是培養(yǎng)中的后污染。本實(shí)驗(yàn)中耐熱真菌計(jì)數(shù)和鑒定結(jié)果中均排除了這兩種情況下檢出的霉菌。

青霉是常見真菌，廣泛分布于土壤、空氣、植物和室內(nèi)等環(huán)境中。青霉的無性型也常常污染實(shí)驗(yàn)室，但是青霉的有性型籃狀菌屬和正青霉屬的有性孢子并不常見，一般僅現(xiàn)于土壤中。所以果汁行業(yè)中這些耐熱真菌的污染通常不是因空氣帶入，而是水果掉落或接近地面時(shí)帶入，在后續(xù)果汁加工中這些有性孢子比無性孢子更為耐熱，抗性強(qiáng)，不容易清除，能在成品中生長產(chǎn)毒，導(dǎo)致安全隱患，這已經(jīng)引起了果汁行業(yè)的重視［23-24］。但是如何區(qū)分半知菌綱的青霉無性型和有性型有困難，青霉只在特定環(huán)境下才產(chǎn)生有性孢子，實(shí)驗(yàn)室一般情況下只能觀察到其無性孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，只能按無性型來鑒定。在這種情況下，分子生物學(xué)技術(shù)就體現(xiàn)出優(yōu)勢，直接跳過培養(yǎng)觀察等步驟，準(zhǔn)確地鑒定到屬種還能鑒別到有性型［6］。

籃狀菌屬中多個(gè)種都被報(bào)道能產(chǎn)生耐熱孢子，從而導(dǎo)致巴氏殺菌果汁和其他水果制品腐敗變質(zhì)，并能在食品中產(chǎn)生真菌毒素，所以在食品工業(yè)中有特殊地位。比如T. purpurogenus能產(chǎn)生一種肝毒素-紅色青霉毒素Rubratoxin，曾有青少年因飲用含大量紅色青霉毒素的大黃酒而急需肝移植的案例。T. islandicus則是大米儲(chǔ)存中最有破壞性和有害的真菌之一，能產(chǎn)生大量肝毒性和致癌性的真菌毒素諸如環(huán)氯素、島青霉毒素、紅天精和黃天精［25］。

本實(shí)驗(yàn)檢出的主要污染菌是籃狀菌和正青霉，它們確實(shí)是果汁行業(yè)中經(jīng)常檢出而且危害很大的耐熱真菌，但是也出現(xiàn)了以往很少報(bào)道的擔(dān)子菌綱-白耙齒菌和拴菌，以及子囊菌門的枝孢菌屬，它們也都有有性孢子，有文獻(xiàn)報(bào)道某些枝孢菌能耐熱，而且是果蔬腐敗菌［26］，鮮見關(guān)于果汁中檢出耐熱的白耙齒菌和拴菌的報(bào)道。雖然以絲衣霉、薩托氏菌、籃狀菌和正青霉在果汁行業(yè)的危害已經(jīng)廣為人知，但是隨著技術(shù)的發(fā)展一些相對罕見的耐熱腐敗真菌也不斷被發(fā)現(xiàn)，如：鉤囊菌Hamigera和嗜熱子囊菌Thermoascus［4］。

目前國內(nèi)外并未對果汁中耐熱霉菌提出明確的限量要求，耐熱霉菌檢測周期長14～28 d，容易污染，操作不便可能是主要原因之一。耐熱霉菌污染源頭來自落果接觸土壤帶入，除了大型果汁生產(chǎn)企業(yè)能從水果采收等源頭環(huán)節(jié)控制，一般企業(yè)只能在后續(xù)加工過程中注意控制儲(chǔ)存加工條件抑制耐熱霉菌的增殖和產(chǎn)毒。因此美國食品藥品監(jiān)督管理局是直接對真菌毒素提出限量要求，如蘋果汁中棒曲霉毒素不得超過50 mg/kg［27］。但是果汁行業(yè)污染的真菌種類不少，每一種真菌又能產(chǎn)生多種毒素，要一一檢測控制難度也不小。了解大宗果汁原料中耐熱霉菌的數(shù)量和種類不僅對企業(yè)采購有幫助，對后續(xù)工藝參數(shù)的設(shè)定，特別是消殺參數(shù)設(shè)定有所助益。

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Determination of Heat Resistant Mould in Concentrated Fruit Juice

TONG Xun, GAO Wen, HUANG Tingxuan, ZHOU Guoping*
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China）

Objective： To detect and identify the heat resistant molds in 15 batches of concentrated fruit juice. Methods：After heat treatment at 80 ℃ for 30 min to kill the heat-sensitive fungi and activate the heat-resistant spores, we spread the concentrated juices on medium plates and counted the fungal colonies after 14-21 d culture. Secondly, the fungi were purifi ed, observed and identifi ed by 28S rDNA sequence analysis. Results： Heat resistant fungi were detected in eight out of 15 batches （53.3%） of concentrated fruit juice, consisting mainly of Eupenicillium and Talaromyces, together with a small number of Irpex lacteus, Trametes sp. and Capnodiales sp.. Conclusions： Heat resistant fungi were detected both in imported and domestic concentrated fruit juice, especially those Eupenicillium and Talaromyces can produce toxin as well.

concentrated juice； heat resistant mold； detection and identifi cation； Eupenicillium crustaceum； Talaromyces funiculosus

10.7506/spkx1002-6630-201620034

Q939.97

A

1002-6630（2016）20-0198-05

童迅, 高雯, 黃庭軒, 等. 濃縮果汁中耐熱霉菌的分析及鑒定［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 198-202. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201620034. http：//www.spkx.net.cn

TONG Xun, GAO Wen, HUANG Tingxuan, et al. Determination of heat resistant mould in concentrated fruit juice［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 198-202. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620034. http：//www.spkx.net.cn

2016-01-19

2015—2016武漢輕工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（CXXL20151004）

童迅（1993—），男，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：594562513@qq.com

周幗萍（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇踩-mail：wjczgp@163.com