復(fù)合PCR熒光檢測方法檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系

張明哲，張曉峰，徐莉莉，陳笑梅，周　圓，尹文秀，陳吳健，李孝軍

（1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016；2.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316000）

復(fù)合PCR熒光檢測方法檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系

張明哲1，張曉峰1，徐莉莉1，陳笑梅1，周圓2，尹文秀1，陳吳健1，李孝軍2

（1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016；2.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316000）

建立一種高通量的轉(zhuǎn)基因復(fù)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）熒光檢測方法，該方法通過對轉(zhuǎn)基因檢測內(nèi)源、外源及品系基因檢測引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，經(jīng)復(fù)合PCR擴(kuò)增和毛 細(xì)管電泳熒光檢測，實(shí)現(xiàn)特異性強(qiáng)、高通量檢測。結(jié)果表明，復(fù)合PCR熒光檢測方法檢測4 種轉(zhuǎn)基因水稻品系特異性好，并且靈敏度達(dá)到0.1%，可以在進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。

復(fù)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；毛細(xì)管電泳；轉(zhuǎn)基因水稻；品系鑒定

近年來，全球轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化迅猛發(fā)展，種植面積由1996年的170萬 hm2增加至2014年的1.8億hm2，19 a中增加了近100 倍［1］。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國糧食生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位，轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)進(jìn)展也較為迅速，已經(jīng)有多個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻優(yōu)良品系進(jìn)入環(huán)境釋放階段，申請商業(yè)化種植［2］。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)對環(huán)境和食品安全的潛在風(fēng)險(xiǎn)已引起全球的廣泛關(guān)注［3-4］，國際貿(mào)易糾紛時(shí)有發(fā)生。2012年初，歐盟委員會(huì)發(fā)布了《對中國出口大米制品中含有轉(zhuǎn)基因成分采取緊急措施的決定》，歐盟將對中國25 種米制品采取強(qiáng)制性轉(zhuǎn)基因成分檢測，并依據(jù)檢測結(jié)果采取退貨和銷毀處理措施，中國官方必須在向歐盟出口前提交米制品非轉(zhuǎn)基因證明的檢驗(yàn)報(bào)告，表明是否含有轉(zhuǎn)基因成分。2006年以來，已有法國、德國、意大利和奧地利等7 個(gè)國家因?yàn)檗D(zhuǎn)基因大米污染對我國出口米制品采取了拒絕入境或撤架、召回等措施［5］。在此情況下，加強(qiáng)進(jìn)出口領(lǐng)域轉(zhuǎn)基因水稻品系檢測成為必然趨勢。

目前聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中得到了廣泛的應(yīng)用［6-8］，如實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)［9-10］、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［11-13］、重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［14-17］等，但是常用的PCR檢測無法滿足轉(zhuǎn)基因高通量檢測的需求［18-19］。因此，迫切地需要建立一種有效、快速的檢測方法，而復(fù)合PCR熒光檢測技術(shù)是解決這一問題的亮點(diǎn)。本研究建立了一種高通量的轉(zhuǎn)基因復(fù)合PCR熒光檢測方法，并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻品系檢測。該方法通過對轉(zhuǎn)基因檢測內(nèi)源、外源及品系基因檢測引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，經(jīng)復(fù)合PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳熒光檢測，實(shí)現(xiàn)高度特異性、高通量檢測。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

非轉(zhuǎn)基因水稻、大豆和油菜籽 市購；轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt汕優(yōu)63（Bt63）、科豐6號（KF6）、克螟稻（KMD） 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；轉(zhuǎn)基因水稻品系LLRICE62，轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、Bt176、MIR604、Mon88017、Bt11，轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2、Mon89788、CV127，轉(zhuǎn)基因油菜籽品系Ms8、Rf3、Rt73歐洲標(biāo)準(zhǔn)局。

Dneasy Plant Mini Kit試劑盒 德國Qiagen公司；引物和探針合成、普通PCR反應(yīng)的試劑 寶生物工程（大連）有限公司；其他分析純試劑購于美國Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

PHILIPS cucina blender HR2860 荷蘭Philips公司；Sorvall micro21R臺式冷凍離心機(jī)、MAXQ6000搖床、Nano Drop 3300核酸測定儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；S-1000PCR儀 美國Bio-Rad公司；Imager HP核酸電泳及凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；XS104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Pixsys5500點(diǎn)樣儀 美國Cartesian Technologies公司；LS300 Scanner掃描儀 瑞士Tecan Group Ltd.公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)德國Merck公司；真空泵 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；遺傳分析儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3方法

1.3.1材料制備

將水稻、大豆、油菜籽、玉米等材料研磨至粉末狀（0.2 mm左右），在轉(zhuǎn)基因樣本中按比例加入非轉(zhuǎn)基因樣本，分別獲得1%、0.1%、0.01%含量的轉(zhuǎn)基因樣品。

1.3.2DNA提取

DNA提取都使用QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit試劑盒進(jìn)行，DNA濃度由核酸測定儀檢測得到。

1.3.3引物

實(shí)驗(yàn)所用引物設(shè)計(jì)時(shí)通過GeneBank中的BLAST功能考慮引物擴(kuò)增特異性，由于采用的是復(fù)合PCR擴(kuò)增體系，每組PCR的引物之間在混合體系中將存在一定的干擾，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮復(fù)合PCR的多組引物之間的干擾和平衡，調(diào)整引物。其中選擇兩條引物中的一條引物的5'端采用6-FAM、HEX、TAMRA中一種進(jìn)行標(biāo)記，且各組之間的標(biāo)記色均不相同。以水稻品系Bt63為例，引物如表1所示。

表1　水稻品系Bt63引物序列Table1　Primer sequences for transgenetic rice event Bt6

1.3.4復(fù)合PCR擴(kuò)增

以轉(zhuǎn)基因樣品提取的DNA為模板，同時(shí)加入多對引物進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，對復(fù)合PCR各引物添加量、TaqDNA聚合酶用量進(jìn)行優(yōu)化，建立優(yōu)化的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系為：Reaction Mix 10 μL；熱啟動(dòng)C-Taq 1 μL；Primers 5 μL；模板DNA 1 μL（質(zhì)量濃度30 ng/μL左右）；補(bǔ)ddH2O至25 μL。引物擴(kuò)增終濃度見表2。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表2　引物擴(kuò)增終濃度Table2　Final concentrations of primers

1.3.5熒光檢測

由去離子甲酰胺與系統(tǒng)中分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)AGCU Maker SIZ-500組成上樣混合物［（0.5 μL AGCU Maker SIZ-500（制備方法參照專利CN101307226：用于寡核苷酸和蛋白標(biāo)記的熒光染料及其制備方法和用途）×進(jìn)樣數(shù)+（12 μL去離子甲酰胺）×進(jìn)樣數(shù)］。將12.5 μL上樣混合物與1 μL擴(kuò)增產(chǎn)物混合，渦旋混勻后，2 000 r/min離心2 min，避免產(chǎn)生氣泡。95 ℃變性3 min，冰浴3 min，并盡快采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果用遺傳分析儀進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測基因選擇與排布

轉(zhuǎn)基因檢測位點(diǎn)主要分為3 類，分別為內(nèi)源、外源及品系基因。本研究中共檢測27 個(gè)基因，包括大豆、玉米、油菜、水稻4 個(gè)內(nèi)源基因、8 個(gè)外源基因以及15 個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，其中FAM色檢測8 個(gè)外源基因，分別為NOS、Bar、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-epsps、Cry1Ab、NPTII；HEX色檢測玉米內(nèi)源基因Zein及5 個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、MIR604、Mon88017、Bt176、Bt11；TAMRA色檢測大豆內(nèi)源基因Lectin、油菜內(nèi)源基因Pe3-pepcase、水稻內(nèi)源基因Sps，4 個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt63、KF6、KMD、LLRICE62，3 個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品系Ms8、Rf3、Rt73以及3 個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2、Mon89788、CV127。具體排布位置見圖1。

圖1　轉(zhuǎn)基因檢測基因排布Fig.1　Gene loci configuration for GMO detection

2.2特異性分析

在本實(shí)驗(yàn)中，利用復(fù)合PCR熒光檢測法對4 種轉(zhuǎn)基因水稻品系進(jìn)行檢測，其中Bt63品系檢測結(jié)果如圖2A所示。出峰位點(diǎn)分別為終止子基因NOS、轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲外源基因Cry1Ab、水稻轉(zhuǎn)基因品系Bt63、基因水稻內(nèi)源基因Sps，而其他基因位點(diǎn)未出峰。因此確定檢測出轉(zhuǎn)基因水稻Bt63品系，說明復(fù)合PCR熒光檢測法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測具有高度的特異性。

圖2　轉(zhuǎn)基因水稻Bt63擴(kuò)增圖譜Fig.2　Polymorphic fingerprints of genetically modified rice Bt63

2.3混合品系檢測分析

在本實(shí)驗(yàn)中，利用復(fù)合PCR熒光檢測法對轉(zhuǎn)基因水稻Bt63、KF6、KMD的混合品系進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示，出峰位點(diǎn)分別為終止子基因NOS、啟動(dòng)子CaMV35S、轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲外源基因Cry1Ab、水稻轉(zhuǎn)基因品系KMD、水稻轉(zhuǎn)基因品系KF6、水稻轉(zhuǎn)基因品系Bt63及水稻內(nèi)源基因Sps，而其他基因位點(diǎn)未出峰。因此我們確定檢測出轉(zhuǎn)基因水稻KMD、KF6、Bt63的混合品系。

圖3　轉(zhuǎn)基因水稻混合品系擴(kuò)增圖譜Fig.3　Polymorphic fingerprints of mixed genetically modified rice events

2.4靈敏度分析

在本實(shí)驗(yàn)中，利用復(fù)合PCR熒光檢測法對不同含量的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行檢測靈敏度分析，檢測結(jié)果顯示，Sps基因擴(kuò)增的信號值基本穩(wěn)定，能有效滿足芯片靈敏度檢測的需要。外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab及品系Bt63檢測發(fā)現(xiàn)，1%、0.1%含量的轉(zhuǎn)基因檢測都有陽性信號出現(xiàn)（圖4、5），而0.01%含量的轉(zhuǎn)基因檢測無陽性信號出現(xiàn)（圖6）。3 次重復(fù)檢測顯示，0.1%含量的檢測結(jié)果基本穩(wěn)定，因此認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中復(fù)合PCR熒光檢測法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測的靈敏度為0.1%。

圖4　轉(zhuǎn)基因樣本Bt63與非轉(zhuǎn)基因水稻混合所占比例為1%時(shí)擴(kuò)增圖譜Fig.4　Polymorphic fingerprints of genetically modified rice Bt63 added with 1% non-genetically modified rice

圖5　轉(zhuǎn)基因樣本Bt63與非轉(zhuǎn)基因水稻混合所占比例為0.1%時(shí)擴(kuò)增圖譜Fig.5　Polymorphic fingerprints of genetically modified rice Bt63 added with 0.1% non-genetically modified rice

圖6　轉(zhuǎn)基因樣本Bt63與非轉(zhuǎn)基因水稻混合所占比例為0.01%時(shí)擴(kuò)增圖譜Fig.6　Polymorphic fingerprints of genetically modified rice Bt63 added with 0.01% non-genetically modified rice

3　討 論

目前基于DNA的轉(zhuǎn)基因檢測通常使用對目標(biāo)序列擴(kuò)增的方法來進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測目標(biāo)序列的不同可分為篩選檢測（如35S啟動(dòng)子、NOS終止子等）、基因特異性檢測（外源基因）、構(gòu)建特異性檢測和品系特異性檢測（轉(zhuǎn)化事件）。其中品系特異性檢測［20］是通過分析外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實(shí)現(xiàn)的，每一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單拷貝的，所以品系特異性檢測方法具有非常高的特異性和準(zhǔn)確性。品系特異性檢測是目前轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測的最準(zhǔn)確和最特異的核酸檢測方法，并將為國際檢測標(biāo)準(zhǔn)和國際各檢測實(shí)驗(yàn)室所采用。

目前，已建立了以PCR技術(shù)為代表的一系列水稻品系檢測方法，如Bt63［21］、LLRICE62［22］、科豐6號［23］等。但是這些方法都是以單品系檢測為基礎(chǔ)的，隨著轉(zhuǎn)基因品系的不斷增多，迫切需求高通量、高靈敏度和高特異性的檢測方法。綜上所述，本研究建立的轉(zhuǎn)基因復(fù)合PCR熒光檢測方法具有高特異性、高靈敏度以及高通量等特點(diǎn)，可以在進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域進(jìn)行廣泛應(yīng)用。

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Establishment of a High-Throughput Fluorescence Multiplex PCR Method for Detection of Genetically Modified Rice Events

ZHANG Mingzhe1, ZHANG Xiaofeng1, XU Lili1, CHEN Xiaomei1, ZHOU Yuan2, YIN Wenxiu1, CHEN Wujian1, LI Xiaojun2
（1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Hangzhou 310016, China；2. Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316000, China）

In this research, a high-throughput and specific method for the detection of genetically modified （GM） rice events was developed using fluorescence multiplex PCR and capillary electrophoresis based on fluorescence-labeled primers for endogenous, exogenous and event-specific genes. The fluorescence multiplex PCR method could specifically detect four GM rice events with a sensitivity of 0.1%. This method has the potential to be applied in the inspection and quarantine of import and export genetically modified commodities and in food safety detection.

multiplex PCR； capillary electrophoresis； genetic modified rice； identification of genetically modified events

10.7506/spkx1002-6630-201620032

Q789

A

1002-6630（2016）20-0187-04

張明哲, 張曉峰, 徐莉莉, 等. 復(fù)合PCR熒光檢測方法檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 187-190.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620032. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Mingzhe, ZHANG Xiaofeng, XU Lili, et al. Establishment of a high-throughput fluorescence multiplex PCR method for detection of genetically modified rice events［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 187-190. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620032. http：//www.spkx.net.cn

2016-02-01

浙江省重大科技專項(xiàng)（2011C12023）；國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011IK249）；浙江省公益技術(shù)項(xiàng)目（2011C22065；2014C32004）

張明哲（1982—），男，高級農(nóng)藝師，博士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)和植物檢疫。

E-mail：mzzhang429@163.com