• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    母乳和牛乳中乳脂肪球膜蛋白質(zhì)的差異分析

    2016-11-07 08:35:26景萌娜姜鐵民張咚咚魏京華李菊芳陳歷俊
    食品科學 2016年20期
    關鍵詞:皮爾斯小柱牛乳

    景萌娜,姜鐵民,劉 斌,張咚咚,魏京華,王 品,李菊芳,陳歷俊,

    (1.大連工業(yè)大學生物工程學院,遼寧 大連 116034;2.北京三元食品股份有限公司,國家母嬰乳品健康工程技術研究中心,北京 100163)

    母乳和牛乳中乳脂肪球膜蛋白質(zhì)的差異分析

    景萌娜1,2,姜鐵民2,劉斌2,張咚咚2,魏京華1,2,王品1,2,李菊芳2,陳歷俊1,2,*

    (1.大連工業(yè)大學生物工程學院,遼寧 大連 116034;2.北京三元食品股份有限公司,國家母嬰乳品健康工程技術研究中心,北京 100163)

    為比較乳脂肪球膜(milk fat globule membrane,MFGM)蛋白在母乳和牛乳中的差異,采用有機試劑提取法,從母乳和牛乳中提取分離出MFGM蛋白,經(jīng)皮爾斯TM去垢小柱去除十二烷基硫酸鈉后,通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術檢測分析,檢測結果根據(jù)特異性肽段匹配數(shù)不小于1篩選后,在母乳和牛乳中分別檢測到863 種和454 種蛋白,其中二者共有175 種,分別獨有688 種和279 種。將母乳中差異表達的688 種蛋白質(zhì)按PANTHER數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)的Gene Ontology(GO)功能注釋,這些蛋白主要是細胞部分、細胞器、細胞膜等組分,參與的生物途徑有新陳代謝過程、生物調(diào)節(jié)、刺激性反應、免疫系統(tǒng)過程、再生作用等,具有催化、黏合、轉運、酶調(diào)節(jié)等多種分子功能。另外,母乳中的這些差異蛋白參與氨酰tRNA生物合成、致病性大腸桿菌感染、脂肪酸代謝、丙酸代謝、甾體合成、酸降解等都是牛乳中的乳脂肪球膜蛋白不具有的功能。通過分析得出母乳和牛乳中的MFGM蛋白具有明顯差異,雖然有部分組成和功能的重疊,但在豐度和代謝路徑上,牛乳MFGM蛋白不能替代母乳MFGM蛋白。

    乳脂肪球膜蛋白;母乳;牛乳;功能注釋;代謝途徑

    嬰幼兒處于特殊生長發(fā)育階段,具有特殊的營養(yǎng)需求[1]。1998年,Lucas[2]提出了“營養(yǎng)程序化”的概念,即發(fā)育關鍵或敏感時期的營養(yǎng)狀況將對機體各器官功能產(chǎn)生長期以至終生的影響,且程序化的敏感時期可能從胎兒期和嬰兒期延伸到青少年時期。嬰幼兒的營養(yǎng)狀況越來越受到人們的關注。

    眾所周知,母乳是嬰幼兒最理想的天然食物,母乳中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)為嬰幼兒的生長發(fā)育提供了能量和營養(yǎng)需求。但是當母乳不能滿足需求時,一般選擇嬰幼兒配方奶粉作為營養(yǎng)補充食品,目前大部分的配方奶粉來源于牛乳[1],嬰幼兒配方奶粉的基本原則是調(diào)節(jié)牛乳成分,使其最大程度上與母乳相似[3]。乳中的蛋白質(zhì)是主要的營養(yǎng)物質(zhì)之一,是嬰幼兒建造機體的重要物質(zhì)基礎,機體的每一個細胞及所有的重要活性物質(zhì)都有蛋白質(zhì)的參與。研究[4]發(fā)現(xiàn),牛乳和母乳具有明顯的成分差異,尤其是蛋白含量的差異,乳清蛋白與酪蛋白的比例在母乳中約為70∶30,而牛乳中約為18∶82。除此之外,隨著蛋白質(zhì)組學技術的發(fā)展,以前一直被忽視的乳脂肪球膜(milk fat globule membrane,MFGM)蛋白的研究正成為乳蛋白研究中的一個重要部分[5]。

    MFG以一種微小的球狀存在于乳中,直徑大約為0.2~15 μm[6],外面被一層很薄的膜所包圍,這層膜被稱為MFGM,它的橫截面直徑大約為10~20 nm。起著乳化劑的作用并阻止乳脂肪球的聚合和酶退化[7]。MFGM蛋白中含有25%~60%的蛋白質(zhì),占乳中總蛋白含量的1%~2%[8]。MFGM蛋白雖然在乳中含量甚微,但卻具有重要的生物學意義,如抗癌作用、抗菌性和抗黏著性以及對腦脊髓炎的自身免疫作用[9-10]等,都是不容被忽視的。近年來,國內(nèi)外關于MFGM蛋白的研究越來越多,其中對牛乳、羊乳等動物的MFGM蛋白研究較多,對母乳的MFGM蛋白國內(nèi)外已有了高度的重視,但對MFGM蛋白在母乳和牛乳中的差異分析卻很少[11-12]。本實驗采用納升液相色譜-靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜對母乳和牛乳中的MFGM蛋白進行檢測,并進行相關生物信息分析,為嬰幼兒配方奶粉的研發(fā)提供理論指導。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    新鮮牛乳、成熟期(大于6 個月)的母乳 北京三元食品股份有限公司。

    蔗糖、氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二納、碳酸氫銨、甲醇、三氯甲烷(均為分析純) 北京化工廠;二硫蘇糖醇、尿素、碘代乙酰胺、胰蛋白酶、黃嘌呤氧化酶標品、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS) 德國Sigma公司;甲酸、乙腈、甲醇(均為色譜純) 美國Fisher Scientific公司;蒸餾水廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

    1.2儀器與設備

    Bradford蛋白定量試劑盒 碧云天生物技術公司;UltiMate 3000納升液相色譜儀、Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀、皮爾斯?去垢小柱、D-37520微量高速離心機、Nanodrop2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher公司;氮吹儀 美國Organomation公司;3K-15型冷凍離心機 德國Sigma公司;TRID2.5真空冷凍干燥機 美國Labconco公司;KQ-500DE超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Advantage超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;Oasis HLB固相萃取柱 美國Waters公司。

    1.3方法

    1.3.1MFGM蛋白的提取

    [13-16]的方法,在此基礎上略有改動。分別取新鮮牛乳和母乳各8 mL,按5 g/100 mL添加蔗糖,混合均勻后,于4 ℃、4 000×g條件下離心20 min,取脂肪層,脂肪層采用PBS洗2~3 遍,得乳脂肪。向得到的乳脂肪中加入適量的超純水,混勻后5 000×g離心20 min,取脂肪層,按體積比1∶1添加三氯甲烷和甲醇,混勻后11 000×g離心20 min,取中間蛋白層,重復2 次后氮吹,得到MFGM蛋白。

    1.3.2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

    采用不連續(xù)電泳體系,配制體積分數(shù)15%分離膠和體積分數(shù)4%的濃縮膠,各取20 μL樣品加入5 μL的5 倍上樣緩沖液,沸水浴10 min后,11 000×g離心10 min,上樣體積為5 μL。以80 V恒壓預電泳30 min左右,再以120 V恒壓至電泳結束,振蕩染色1 h。脫色至背景透明,進行凝膠成像分析,分析軟件為Alphaimager HP。

    1.3.3MFGM蛋白液相色譜-質(zhì)譜分析的前處理

    將得到的MFGM蛋白加入適量的SDS裂解液(0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl+4% SDS+0.1 mol/L二硫蘇糖醇),100 W超聲溶解30 min。取100 μL蛋白質(zhì)裂解液,加100 μL水混勻。采用皮爾斯TM去垢小柱去除SDS:將皮爾斯TM去垢小柱置于2 mL離心管中,于4 ℃、1 500×g離心1 min,除去儲存溶液;向皮爾斯?去垢小柱內(nèi)加入400 μL PBS溶液,于4 ℃、1 500×g離心1 min,棄流出液,重復1 次;將稀釋后的裂解液轉入皮爾斯?去垢小柱內(nèi),置于室溫2 min后,于4 ℃、1 500×g離心1 min,收集流出液,采用0.05 mol/L NH4HCO3溶液將流出液稀釋至500 μL,Bradford法測定蛋白含量后,按質(zhì)量比1∶50加入1 mg/mL的胰蛋白酶,37 ℃酶解過夜。酶解液經(jīng)HLB萃取柱脫鹽后,真空冷凍干燥。干燥后加入50 μL體積分數(shù)0.1%甲酸溶液復溶,11 000×g離心10 min,取上清液進行質(zhì)譜分析[17-18]。

    1.3.4儀器測定條件

    色譜條件:色譜分析柱為C18Acclaim Pep Map RSLC柱(15 cm×50 μm,2 μm,100 ?);富集柱為C18Acclaim Pep Map 100柱(2 cm×75 μm,5 μm,100 ?);柱溫為35 ℃;流動相:A為0.1%甲酸溶液,B為0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序:體積分數(shù)4% B保持5 min,在70 min內(nèi)B的體積分數(shù)從4%升到50%,保持3 min,在2 min之內(nèi)B的體積分數(shù)降低到4%并保持10 min。流速為0.25 μL/min,進樣量1 μL[19-21]。

    質(zhì)譜條件:離子源為Nanospray Flex納升電噴霧離子源;電噴霧電壓3.2 kV;離子傳輸管溫度320 ℃;射頻透鏡為50%;掃描模式為數(shù)據(jù)依賴模式;一級質(zhì)譜采用Orbitrap采集,質(zhì)量掃描范圍為m/z 300~1 600,分辨率為70 000;對豐度最高的15 個離子峰進行二次碎片采集,碎裂模式為高能碎裂,碰撞能量為28%[22]。

    1.3.5Q Exactive質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

    所獲得樣品的RAW數(shù)據(jù)文件使用Thermo Proterme Discoverer 1.4軟件進行數(shù)據(jù)庫比對。比對數(shù)據(jù)庫檢索軟件使用SEQUEST HT,數(shù)據(jù)庫源自Uniprot(物種為人,Homo sapiens;物種為牛,Bos taurus)。具體參數(shù)設置:酶為胰蛋白酶(full),最大漏切位點設置為2,母離子質(zhì)量偏差為10 mg/mL,子離子質(zhì)量偏差為0.02 D。動態(tài)修飾設置:氧化(Oxidation/M+15.995 D),脫氨基化(Deamidated/N,Q+0.984 D),固定修飾設置為脲甲基化(Carbamidomethyl/C+57.021 D)。比對結果使用Percolator計算q值進行卡值[22]。采用R(3.2.0)進行蛋白組數(shù)據(jù)分析,使用R的“l(fā)imma”包進行韋恩圖繪制,使用“gplots”包進行熱圖的繪制。差異蛋白的Gene Ontology(GO)功能注釋采用PANTHER在線分析平臺(http://www.pantherdb.org/)。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)代謝通路分析采用DAVID在線分析平臺(https://david. ncifcrf.gov/tools.jsp)。

    2 結果與分析

    2.1SDS-PAGE結果分析

    參考馬鶯等[15]的方法提取,在提取過程中用PBS溶液洗數(shù)次,以除去附著于MFGM上的酪蛋白、乳清蛋白或其他蛋白,降低所提取的MFGM蛋白中雜質(zhì)蛋白的含量。在提取離心過程中母乳和牛乳的沉淀量有所差異:第1次離心后,母乳有少量沉淀,而牛乳的沉淀卻很多;用PBS溶液洗2 次,在這個過程中,牛乳有少量幾乎看不見的沉淀,而母乳卻有明顯的沉淀。

    圖1 MFGM蛋白離心提取過程中沉淀蛋白的SDS-PAGGEE圖Fig.1 SDS-PAGE patterns of MFGM proteins in centrifugal extraction process

    為了說明在提取過程中母乳和牛乳中沉淀的蛋白是否需要除去,保證除去雜蛋白,而又能保留目標蛋白,取其提取過程中前3 次離心后沉淀蛋白進行SDS-PAGE分析,由圖1可以看出,N1含有大量酪蛋白,有必要去除;N2含有少量酪蛋白,必要的時候可以去除;M1含有少量酪蛋白,為了不影響后續(xù)實驗需要將其去除;M2從條帶上看已經(jīng)幾乎沒有酪蛋白及其他雜蛋白的存在,所以第1次洗后的沉淀蛋白可以不去除;M3、M4從條帶上看是沒有酪蛋白及其他雜蛋白影響的,所以可以不去除。值得注意的是,對實驗中每次PBS溶液洗后棄去的上清液電泳分析后,會有少量的MFGM蛋白,所以實驗中用PBS溶液洗的次數(shù)過多后會有MFGM蛋白損失。由SDSPAGE結果除了可以看出牛乳和母乳在提取過程中的差異,還可以得出在提取過程中需要用PBS溶液洗合適的次數(shù),排除雜蛋白的干擾外,不至于損失過多MFGM蛋白,得到純度較高的MFGM蛋白。

    2.2皮爾斯TM去垢小柱法樣品前處理結果

    在處理MFGM蛋白樣品時,為了使MFGM上附著的蛋白充分解離,并促使蛋白質(zhì)結構充分展開,實驗中需要使用去垢劑將其裂解,本實驗所使用的是SDS裂解液,但殘留的SDS會降低酶解效率、干擾肽段的色譜分離并對目標物離子化過程產(chǎn)生強烈的離子抑制作用[23],對質(zhì)譜檢測產(chǎn)生不利影響,必須將其除去。目前脫除SDS的方法中,使用較多的是Wisniewski等[24]的方法,即利用超濾管輔助樣品前處理(Filter aided proteome preparation,F(xiàn)ASP)法來脫除SDS。實驗過程中發(fā)現(xiàn),超濾管對SDS耐受度低,并且該法存在步驟繁瑣、損失過多等問題。采用皮爾斯?去垢小柱通過簡單操作,可以很好的去除SDS。曹曉琳等[17]將該新型親和小柱用于水稻蛋白質(zhì)樣品的凈化中,并對比了傳統(tǒng)的FASP法、丙酮沉淀法和皮爾斯TM去垢小柱法對SDS的去除效果,參考文獻結果,以5 mL的牛乳為樣品做驗證實驗,提取MFGM蛋白后,運用FASP法和皮爾斯TM去垢小柱法2 種前處理方法,經(jīng)NanoLC-Orbitrap質(zhì)譜對提取蛋白分析,F(xiàn)ASP法識別出的354 種蛋白質(zhì);皮爾斯TM去垢小柱法識別出568 種蛋白質(zhì),是FASP法的1.6 倍。由此可知,皮爾斯去垢小柱法不但操作簡單,而且具有更高的提取率。

    本實驗運用操作簡單且結果較好的皮爾斯?去垢小柱法對8 mL的牛乳和母乳成熟乳進行實驗,每個樣品2 個技術重復。

    2.3Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀檢測結果

    將提取的母乳和牛乳蛋白樣品經(jīng)過皮爾斯TM去垢小柱法前處理后,采用納升液相色譜-串聯(lián)Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀檢測,將得到的RAW源文件進行SEQUEST HT比對。在牛乳的2 個平行樣品中分別檢測到了579 種和525 種蛋白質(zhì),母乳的2 個平行樣品中分別檢測到了1 254 種和1 215 種蛋白質(zhì),母乳中所檢測到的蛋白種類約是牛乳中的2.2 倍。其中,選取穩(wěn)定檢測到的蛋白進行下一步的分析。

    對于母乳和牛乳來說,首先選取樣品中unique peptide大于1的蛋白進行進一步分析;其次,為了方便不同物種間蛋白的比較,以蛋白uniprot標準名稱為索引,選擇母乳樣品和牛乳樣品中共有的蛋白進行后續(xù)的分析。

    2.3.1母乳和牛乳質(zhì)譜檢測結果的對比分析

    為了從整體上對母乳和牛乳蛋白樣品的比對結果進行分析,對母乳和牛乳樣品結果進行盒形圖分析,如圖2A所示。盒形圖顯示在母乳H1、H2和牛乳B1、B22 個平行樣品中,蛋白豐度(log2轉換)的分布情況??梢钥吹剑紫?,牛乳和母乳2 個平行樣品的重復性較好,說明前處理過程和儀器分析的誤差小,結果較為可靠,可用于后續(xù)分析。其次,整體來說,母乳中蛋白豐度的中位數(shù)要高于牛乳蛋白豐度的中位數(shù),可以說明母乳中的MFGM蛋白含量明顯比牛乳中的高。

    進一步比較母乳和牛乳中的MFGM蛋白的差異,如圖2B所示(經(jīng)過unique peptide不小于1篩選),母乳和牛乳中分別檢測到863 種和454 種蛋白,其中二者共有175 種,分別獨有688 種和279 種,母乳中差異蛋白數(shù)量約為牛乳的2 倍。

    圖2 2組MFGM蛋白的盒形圖(A)和韋恩圖(B)Fig.2 Venn diagrams of two groups of MFGM proteins

    進一步對母乳和牛乳中共有的175 種蛋白的豐度情況進行層次聚類分析和熱圖展示,以對這些蛋白在母乳和牛乳中的豐度進行整體性的概覽,如圖3所示。絕大部分蛋白在母乳中含量均高于牛乳,如Clusterin等,而其余少數(shù)蛋白則是在牛乳中的豐度高于母乳,如protein S100-A8、Musin-15等。個別蛋白在2 種乳品中沒有明顯差異,如Butyrophilin subfamily 1 member A1等。

    圖3 2組MFGM蛋白的聚類熱圖Fig.3 Clustering and heat maps of two groups of MFGM proteins

    雖然母乳和牛乳中MFGM有差異,但是2 種樣品中均含有豐度相對較高且有顯著生理功能的幾種蛋白:黃嘌呤脫氫酶/氧化酶、嗜乳脂蛋白、組織糖蛋白高碘酸稀爾6/7、脂肪酸結合蛋白、血小板糖蛋白4、黏蛋白-1和脂滴包被蛋白等[14,25]。為此,將母乳和牛乳的這幾種蛋白的面積值進行對比分析,從表1可以看出,7 種主要蛋白的面積均值均不相同,除脂肪酸結合蛋白在牛乳中較大外,其他蛋白均在母乳中較大,有的蛋白的面積值甚至大出了幾倍。從這些較高豐度蛋白在一定程度上可以反映出與母乳相比,牛乳的MFGM蛋白還是有一定差距的。

    表1 乳中7種MFGM蛋白Table1 Seven milk fat globule membrane proteins in breast milk andbovine milk

    2.3.2差異蛋白的GO注釋分析

    對蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的研究有助于提高對乳中蛋白的認識和利用[5]。為了進一步認識母乳和牛乳中MFGM蛋白的差異,以牛乳為本體,將母乳中差異表達的688 種MFGM蛋白按PANTHER數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)的GO注釋,分別對其細胞成分、生物途徑以及分子功能3 個方面的信息進行歸類[21]。如圖4所示,在母乳中MFGM的差異表達蛋白中,41.6%的是細胞部分、24.3%的是細胞器、16.0%的是高分子復合物、10.3%的是膜以及少量的胞外區(qū)以及細胞外基質(zhì);差異表達蛋白參與了很多生物途徑,其中有32.2%的蛋白參與代謝過程,19.8%的蛋白參與細胞過程,10.7%的蛋白參與定位過程,其余蛋白分別參與了生物調(diào)節(jié)、發(fā)展歷程、刺激性反應、免疫系統(tǒng)過程、凋亡過程、再生作用等,母乳中這些差異蛋白的分子功能主要是催化活性和黏性,分別占蛋白的38.4%和30.6%,還有結構分子活性、轉運活性、受體活性、抗氧化劑活性等多個分子功能。同樣,將牛乳中的MFGM蛋白依據(jù)PANTHER數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)的GO注釋,分析其細胞成分、生物途徑和分子功能3 個方面的信息,都與母乳中的這些差異蛋白有很多重疊,但是3 個部分所占比例不同,所以,牛乳中MFGM蛋白某些功能和母乳是一樣的,但是由于生物體的差異,其含量是不同的。

    2.3.3差異蛋白的KEGG代謝路徑分析

    為了更進一步的了解母乳和牛乳MFGM蛋白中差異蛋白的代謝路徑,以牛乳為本體,采用DAVID在線分析平臺對母乳中具有差異表達的688 種MFGM蛋白進行KEGG代謝路徑分析,結果有461 種蛋白被識別,其中有44.7%的蛋白(即206 種)有代謝路徑信息,其中每個路徑中蛋白數(shù)大于2的有31.2%即144 種,共有19 個代謝路徑,除去與牛乳中代謝路徑重疊的核糖體、糖酵解途徑、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、丙酮酸代謝等路徑外,其余差異蛋白參與的路徑如圖5所示,包括:氨酰tRNA生物合成、致病性大腸桿菌感染、脂肪酸代謝、丙酸代謝、甾體合成、酸降解等。結果表明,母乳中MFGM蛋白參與的代謝路徑較牛乳中MFGM蛋白多。牛乳中MFGM蛋白在某些代謝途徑上還是無法達到母乳中MFGM蛋白的功能特性。

    3 結 論

    本實驗分別以8 mL的母乳成熟乳和牛乳為原料經(jīng)有機試劑提取后,采用皮爾斯?去垢小柱法前處理,采用NanoLC-Orbitrap質(zhì)譜對牛乳中的MFGM蛋白質(zhì)進行檢測分析,并進行相關生物信息分析。

    通過SDS-PAGE分析提取母乳和牛乳的MFGM蛋白過程中的差異,結果表明母乳和牛乳的MFGM蛋白提取過程具有很大差別,所以要根據(jù)不同的乳源進行不同的提取,以便達到實驗所要求的純度而又達到較高的產(chǎn)率;采用皮爾斯?去垢小柱法進行樣品前處理,運用簡單的操作可以很好地去除SDS,避免了運用FASP法中樣品的損失;通過高分辨質(zhì)譜儀檢測,發(fā)現(xiàn)母乳所檢測到的MFGM蛋白種類約是牛乳種類的2.2 倍;利用盒形圖、熱圖聚類、韋恩圖,從種類和豐度上直觀的對比了母乳和牛乳的差異,顯示出與牛乳MFGM蛋白相比,母乳中的MFGM蛋白不但種類多而且豐度高;以牛乳為本體,對母乳中特有的MFGM差異蛋白做GO注釋,與牛乳中MFGM蛋白功能相比,細胞成分、生物途徑以及分子功能3 個方面的信息有很多重疊,從GO注釋的結果對比來看,與母乳相比牛乳中的MFGM蛋白在功能方面可以起到一定的作用;通過KEGG代謝通路比較,母乳中具有差異表達的MFGM蛋白參與的代謝途徑雖然和牛乳中只有少部分重疊,氨酰tRNA生物合成、致病性大腸桿菌感染、脂肪酸代謝、丙酸代謝、甾體合成、酸降解等這些途徑是母乳中MFGM蛋白所參與的,所以牛乳MFGM蛋白還是與母乳MFGM蛋白有一定差距。

    通過以上結果可以看出,MFGM蛋白在母乳和牛乳中具有明顯差異,其中雖然有部分組成和功能重疊,但是在豐度和代謝路徑上,牛乳MFGM蛋白并不能替代母乳MFGM蛋白。目前嬰幼兒配方粉的研究主要關注在幾種主要蛋白含量的差異、乳脂肪的差異、微量元素的添加和其他一些營養(yǎng)物質(zhì)的添加[1],而隨著蛋白質(zhì)組學的應用,MFGM蛋白在母乳和牛乳中的差異也得以進行深入研究,這對開發(fā)含MFGM蛋白的嬰幼兒配方奶粉具有重要意義。

    參考文獻:

    [1] 龐彩霞. 嬰兒配方乳研究現(xiàn)狀[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工(學刊), 2008(11): 66-68. DOI:10.3969/j.issn.1671-9646-B.2007.11.020.

    [2] LUCAS A. Programming by early nutrition: an experimental approach[J]. Journal of Nutrition, 1998, 128(Suppl 2): 401S-406S.

    [3] 田建軍, 張開屏, 李國君, 等. 嬰幼兒配方奶粉的研究方法[J]. 中國供銷商情(乳業(yè)導刊), 2005(8): 31-34.

    [4] 柏丹丹. 母乳營養(yǎng)成分含量的測定[D]. 蘇州: 蘇州大學, 2013.

    [5] 蘆晶, 劉鷺, 張書文, 等. 蛋白質(zhì)組學技術在乳品研究中的應用[J]. 生物技術進展, 2013, 3(6): 385-388. DOI:10.3969/ j.issn.2095-2341.2013.06.01.

    [6] MARIE-CAROLINE M, MICHEL O, VALéRIE B, et al. Native fat globules of different sizes selected from raw milk: thermal and structural behavior[J]. Chemistry and Physics of Lipids, 2004, 132(2):247-261. DOI:10.1016/j.chemphyslip.2004.08.007.

    [7] DEWETTINCK K, ROMBAUT R, THIENPONT N, et al. Nutritional and technological aspects of milk fat globule me mbrane material[J]. International Dairy Journal, 2008, 18(5): 436-457. DOI:10.1016/ j.idairyj.2007.10.014.

    [8] MATHER I H. A review and proposed nomenclature for major proteins of the milk-fat globule membrane1, 2[J]. Journal of Dairy Science, 2000, 83(2): 203-247. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(00)74870-3.

    [9] SPITSBERG V L, GOREWIT R C. Isolation, purification and characterization of fatty-acid-binding protein from milk fat globule membrane: effect of bovine growth hormone treatment[J]. Pakistan Journal of Nutrition, 2002. DOI:10.3923/pjn.2002.43.48.

    [10] NEWBURG D S. Human-milk lactadherin in protection against rotavirus[J]. Lancet, 1998, 351: 1815-1816. DOI:10.1016/S0140-6736(05)78783-3.

    [11] CEBO C, CAILLAT H, BOUV IER F, et al. Major proteins of the goat milk fat globule membrane[J]. Journal of Dairy Science, 2010, 93(3):868- 876. DOI:10.3168/jds.2009-2638.

    [12] PISANU S, GHISAURA S, PAGNOZZI D, et al. The sheep milk fat globule membrane proteome[J]. Journal of Proteomics, 2011, 74(3):350-358. DOI:10.1016/j.jprot.2010.11.011.

    [13] 何勝華, 馬鶯, 崔艷華, 等. 牦 牛乳脂肪球膜組成分析及蛋白熱穩(wěn)定性[J]. 哈爾濱工業(yè)大學學報, 2012, 44(10): 104-108.

    [14] 隋順超. 對轉基因克隆牛乳脂肪球膜蛋白質(zhì)及四種牛奶蛋白質(zhì)組學研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學, 2014.

    [15] 馬鶯, 姬曉曦, 李琳. 一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法: 中國, CN 102863526 A[P]. 2013-01-09.

    [16] AFFOLTER M, GRASS L, VANROBAEYS F, et al. Qualitative and quantitative profiling of the bovine milk fat globule membrane proteome[J]. Journal of Proteomics, 2010, 73(6): 1079-1088. DOI:10.1016/j.jprot.2009.11.008.

    [17] 曹曉林, 鞏佳第, 陳銘學, 等. 新型親和去垢小柱凈化-液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法分析水稻葉片蛋白質(zhì)組[J]. 色譜, 2014, 32(11): 1181-1186. DOI:10.3724/SP.J.1123.2014.06035.

    [18] ANTHARAVALLY B S, MALLIA K A, ROSENBLATT M M, et al. Effi cient removal of detergents from proteins and peptides in a spin column format[J]. Analytical Biochemistry, 2011, 416(1): 39-44. DOI:10.1016/j.ab.2011.05.013.

    [19] 陳達煒, 高潔, 呂冰, 等. 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法快速篩查土豆中的多種農(nóng)藥殘留[J]. 分析化學, 2014, 42(4): 579-584. DOI:10.3724/SP.J.1096.2014. 30989.

    [20] 安卓玲, 史忱, 趙瑞, 等. 基于超高效液相色譜-質(zhì)譜的藥物性肝損傷患者血清代謝組學研究[J]. 分析化學, 2015, 43(9): 1408-1414. DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.150261.

    [21] 黃宇, 馮晶, 饒力群, 等. 質(zhì)譜非標記定量分析小麥抗條銹病近等基因系蛋白質(zhì)變化[J]. 生物技術通報, 2014, 15(6): 88-95.

    [22] ZHANG W, GU P, JIANG Z, et al. The o ne hour proteome: Q-OT-qIT mass spectrometry based rapid proteome identifi cation[J]. Scientia Sinica Vitae, 2014, 44(5): 528-536. DOI:10.1360/05201 4-16.

    [23] ALESSANDRO T, GRAZIA B, DANIELA P, et al. Comparison of detergent-based sample preparation workflows for LTQ-Orbitrap analysis of the Escherichia coli proteome[J]. Proteomics, 2013, 13(17):2597-2607. DOI:10.1002/pmic.201200478.

    [24] WISNIEWSKI J R, ZOUGMAN A, NAGARAJ N, et al. Universal sample preparation method for proteome analysis[J]. Nature Methods, 2009, 6(5): 359-362. DOI:10.1038/nmeth.1322.

    [25] 何勝華, 李海梅, 馬鶯. 乳脂肪球膜(MFGM)的組成及生理特性[J].中國乳品工業(yè) , 2009, 37(4): 38-41.

    Analysis of Differences in Milk Fat Globule Membrane Proteins between Breast Milk and Bovine Milk

    JING Mengna1,2, JIANG Tiemin2, LIU Bin2, ZHANG Dongdong2, WEI Jinghua1,2, WANG Pin1,2, LI Jufang2, CHEN Lijun1,2,*
    (1. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China;2. National Maternal and Infant Health Dairy Researching Center, Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd., Beijing 100163, China)

    In order to compare the difference in milk fat globule membrane (MFGM) proteins between breast milk and bovine milk, MFGM were extracted from milk by organic solvent extraction and lysed in SDS-containing lysis buffer for analysis by liquid chromatography and mass spectrometry (LC-MS) after the removal of SDS using PierceTMdetergent removal spin column. The results were filtered according to the number of unique peptide ≥ 1. A total of 863 and 454 proteins were identifi ed separately in breast milk and bovine milk, including 175 proteins in common, and 688 and 279 proteins unique for breast milk and bovine milk, respectively. Gene Ontology (GO) analysis of 688 specifi c MFGM proteins in human milk showed that they were mainly distributed in cell part, cell organelle, and cell membrane, and involved in biological pathways such as metabolic processes, biological regulation, response to stimulus, immune system process, reproduction, and so on. These proteins also participated in many molecular functions, such as catalytic activity, binding, transport activity and enzyme regulation activity. In addition, these breast milk MFGM proteins were involved in some metabolic pathways, such as aminoacyl-tRNA biosynthesis, pathogenic Escherichia coli infection, fatty acid metabolism, propanoate metabolism, steroid biosynthesis, lysine degradation, which were not shown in bovine milk. The MFGM proteins in breast milk and bovine milk had obvious differences. Although some compositions and functions were overlapped, in terms of abundance and metabolic pathways, the MFGM proteins in bovine milk could not be replaced by those in breast milk.

    milk fat globule membrane proteins; breast milk; bovine milk; functional annotation; metabolic pathway

    10.7506/spkx1002-6630-201620012

    TS252.1

    A

    1002-6630(2016)20-0069-06

    景萌娜, 姜鐵民, 劉斌, 等. 母乳和牛乳中乳脂肪球膜蛋白質(zhì)的差異分析[J]. 食品科學, 2016, 37(20): 69-74.

    DOI:10.7506/spkx1002-6630-201620012. http://www.spkx.net.cn

    JING Mengna, JIANG Tiemin, LIU Bin, et al. Analysis of differences in milk fat globule membrane proteins between breast milk and bovine milk[J]. Food Science, 2016, 37(20): 69-74. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201620012. http://www.spkx.net.cn

    2016-01-13

    北京市科技計劃項目(D141100004814001)

    景萌娜(1990—),女,碩士研究生,研究方向為發(fā)酵乳制品。E-mail:479560904@qq.com

    陳歷?。?967—),男,教授級高級工程師,博士,研究方向為乳品科學。E-mail:chenlijun@sanyuan.com.cn

    猜你喜歡
    皮爾斯小柱牛乳
    志向
    少年文藝(2022年8期)2022-07-08 10:02:47
    牛乳中脂肪摻假檢測技術的研究進展
    原始的風景——大衛(wèi)·皮爾斯作品欣賞
    少兒美術(2020年8期)2020-11-06 05:21:42
    消毒鮮牛乳還要煮嗎
    自我保健(2020年8期)2020-01-01 21:12:03
    蘇珊·皮爾斯有關博物館藏品研究的梳理與思考
    中國博物館(2018年3期)2019-01-08 03:29:30
    真理重生
    扣籃(2018年11期)2018-11-21 19:42:58
    新鄉(xiāng):小城失敗者
    體積之爭
    馬克思主義元信仰與皮爾斯的科學符號觀
    湖湘論壇(2016年6期)2016-02-27 15:23:41
    耳后游離皮片在修復鼻小柱與上唇粘連外翻畸形中的臨床應用
    日韩欧美精品v在线| 久久99热这里只有精品18| 亚洲中文字幕日韩| 日本在线视频免费播放| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲午夜理论影院| 熟女人妻精品中文字幕| 精品国产美女av久久久久小说| 日韩欧美 国产精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 99久久99久久久精品蜜桃| 网址你懂的国产日韩在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产伦在线观看视频一区| 99热精品在线国产| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美一区二区亚洲| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成人一区二区视频在线观看| 国产成人欧美在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 天美传媒精品一区二区| 亚洲 国产 在线| 一区二区三区高清视频在线| 成年版毛片免费区| 特大巨黑吊av在线直播| 一区二区三区免费毛片| 岛国视频午夜一区免费看| 久久精品人妻少妇| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩欧美在线乱码| 无人区码免费观看不卡| 亚洲专区中文字幕在线| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产真实乱freesex| 18禁在线播放成人免费| 国产精品av视频在线免费观看| 日本黄大片高清| 在线观看舔阴道视频| 色av中文字幕| 国产成人av教育| 欧美日韩乱码在线| 黄片小视频在线播放| 亚洲激情在线av| 一a级毛片在线观看| 一区福利在线观看| 久久香蕉精品热| 国产伦在线观看视频一区| 两个人看的免费小视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 18+在线观看网站| 中文字幕av在线有码专区| 国产高清videossex| 国产高清videossex| 国产高清三级在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 可以在线观看毛片的网站| 国产伦在线观看视频一区| 一级毛片高清免费大全| 亚洲国产色片| 嫩草影院精品99| 综合色av麻豆| 两个人视频免费观看高清| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品一及| 丰满乱子伦码专区| 深爱激情五月婷婷| 美女免费视频网站| 成年女人毛片免费观看观看9| 最近在线观看免费完整版| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久久久久久午夜电影| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99国产综合亚洲精品| 亚洲黑人精品在线| 国产成人aa在线观看| 久久草成人影院| 国产精品亚洲av一区麻豆| 成年女人毛片免费观看观看9| 成人18禁在线播放| 国产色婷婷99| 欧美国产日韩亚洲一区| 性欧美人与动物交配| 午夜激情欧美在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 级片在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 99热这里只有精品一区| 真实男女啪啪啪动态图| 国产伦一二天堂av在线观看| 天天一区二区日本电影三级| netflix在线观看网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 在线观看av片永久免费下载| 女同久久另类99精品国产91| 欧美+日韩+精品| 真实男女啪啪啪动态图| 91在线观看av| 中文字幕久久专区| 免费观看精品视频网站| 亚洲国产精品久久男人天堂| 三级毛片av免费| 性色avwww在线观看| 欧美一区二区亚洲| 久久精品影院6| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产三级中文精品| 在线观看av片永久免费下载| 欧美日韩黄片免| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国语自产精品视频在线第100页| 国产激情偷乱视频一区二区| 国内精品久久久久精免费| 久久久精品大字幕| 欧美乱色亚洲激情| 日韩精品中文字幕看吧| 白带黄色成豆腐渣| 悠悠久久av| 久久亚洲精品不卡| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲精品色激情综合| 国产91精品成人一区二区三区| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美黑人巨大hd| 亚洲人成电影免费在线| 午夜福利成人在线免费观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 在线观看免费午夜福利视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 18禁在线播放成人免费| 青草久久国产| 狂野欧美激情性xxxx| 淫妇啪啪啪对白视频| netflix在线观看网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美激情久久久久久爽电影| 内射极品少妇av片p| 91在线观看av| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 啦啦啦免费观看视频1| 深夜精品福利| 国产黄色小视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 99热6这里只有精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产av一区在线观看免费| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美日韩国产亚洲二区| 757午夜福利合集在线观看| 国产乱人伦免费视频| ponron亚洲| 少妇丰满av| 九色成人免费人妻av| 国产av不卡久久| 亚洲,欧美精品.| 国产精品,欧美在线| 欧美一区二区亚洲| 国产成年人精品一区二区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产一区在线观看成人免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲精品成人久久久久久| 久久精品国产自在天天线| 精品国产三级普通话版| 深夜精品福利| 免费搜索国产男女视频| bbb黄色大片| 狂野欧美激情性xxxx| 一级黄片播放器| 在线免费观看不下载黄p国产 | 日日夜夜操网爽| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 午夜久久久久精精品| 99久久成人亚洲精品观看| 内地一区二区视频在线| 可以在线观看毛片的网站| 老司机在亚洲福利影院| 日本五十路高清| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 悠悠久久av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 此物有八面人人有两片| 免费av毛片视频| av在线天堂中文字幕| 禁无遮挡网站| 国产精品久久电影中文字幕| 中文字幕久久专区| 中文资源天堂在线| 亚洲片人在线观看| 亚洲av一区综合| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品一区二区免费欧美| 天天一区二区日本电影三级| 成人国产一区最新在线观看| 久久亚洲精品不卡| 中文字幕熟女人妻在线| 成人av在线播放网站| 亚洲久久久久久中文字幕| 午夜日韩欧美国产| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美zozozo另类| 国产97色在线日韩免费| 午夜精品一区二区三区免费看| av福利片在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲av不卡在线观看| 欧美+日韩+精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 国产成+人综合+亚洲专区| 他把我摸到了高潮在线观看| 色视频www国产| 在线天堂最新版资源| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产成人欧美在线观看| 国内精品美女久久久久久| 观看美女的网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产爱豆传媒在线观看| 欧美在线一区亚洲| 少妇的逼水好多| 12—13女人毛片做爰片一| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品一区二区免费欧美| 草草在线视频免费看| 热99re8久久精品国产| 婷婷精品国产亚洲av| 久久久国产精品麻豆| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 好男人电影高清在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 香蕉久久夜色| 久久久久久久午夜电影| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 国产乱人视频| 亚洲五月婷婷丁香| 国产乱人伦免费视频| a级毛片a级免费在线| 午夜久久久久精精品| 亚洲自拍偷在线| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲最大成人中文| 嫩草影院精品99| 九色国产91popny在线| 美女大奶头视频| 99精品久久久久人妻精品| 精品福利观看| 国产精品女同一区二区软件 | 国产精品久久电影中文字幕| 日韩欧美精品v在线| 一本一本综合久久| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产成人a区在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 天天躁日日操中文字幕| 天天一区二区日本电影三级| 极品教师在线免费播放| 麻豆一二三区av精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99久久精品国产亚洲精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一本综合久久免费| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产综合懂色| www.色视频.com| 欧美丝袜亚洲另类 | 搞女人的毛片| 久久精品综合一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲国产精品999在线| 可以在线观看的亚洲视频| 午夜两性在线视频| 一区二区三区免费毛片| 老司机在亚洲福利影院| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产av麻豆久久久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 中文字幕av成人在线电影| 黄片大片在线免费观看| av天堂中文字幕网| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产伦在线观看视频一区| 成年女人永久免费观看视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产真人三级小视频在线观看| 国产美女午夜福利| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产成人影院久久av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| x7x7x7水蜜桃| 日韩人妻高清精品专区| 一个人免费在线观看电影| 欧美一级毛片孕妇| 日韩成人在线观看一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 99久久成人亚洲精品观看| 国产真人三级小视频在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 男人舔奶头视频| 久9热在线精品视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| netflix在线观看网站| 国产成人福利小说| 免费观看精品视频网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一个人免费在线观看的高清视频| av欧美777| 国产97色在线日韩免费| 久久人人精品亚洲av| 午夜激情欧美在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 午夜a级毛片| 成年女人毛片免费观看观看9| av中文乱码字幕在线| 国产成人aa在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美三级亚洲精品| 俺也久久电影网| h日本视频在线播放| 最近最新中文字幕大全免费视频| 岛国在线观看网站| 欧美在线一区亚洲| h日本视频在线播放| 久久6这里有精品| 特级一级黄色大片| 亚洲七黄色美女视频| 在线观看舔阴道视频| 露出奶头的视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 日本精品一区二区三区蜜桃| 高潮久久久久久久久久久不卡| 香蕉av资源在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美在线黄色| 国产精品久久电影中文字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 特大巨黑吊av在线直播| 午夜福利欧美成人| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 中文字幕久久专区| 国产精品三级大全| 午夜视频国产福利| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 搡老熟女国产l中国老女人| 丰满乱子伦码专区| 欧美日本视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品99久久久久久久久| 两个人视频免费观看高清| 99国产精品一区二区三区| 观看美女的网站| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲av第一区精品v没综合| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲av二区三区四区| 老鸭窝网址在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品久久视频播放| 欧美区成人在线视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 在线观看66精品国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 一区二区三区激情视频| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲专区中文字幕在线| 美女 人体艺术 gogo| 97碰自拍视频| 首页视频小说图片口味搜索| 少妇丰满av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美bdsm另类| 黄色丝袜av网址大全| 欧美午夜高清在线| 国产色婷婷99| 国产一区二区在线av高清观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲国产欧美人成| 韩国av一区二区三区四区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美午夜高清在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 90打野战视频偷拍视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜老司机福利剧场| 欧美三级亚洲精品| 51国产日韩欧美| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 在线播放国产精品三级| 色吧在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久免费精品人妻一区二区| 欧美zozozo另类| 日本成人三级电影网站| 国产淫片久久久久久久久 | av欧美777| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产一区二区在线av高清观看| netflix在线观看网站| 日本a在线网址| 欧美日韩精品网址| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲美女黄片视频| 亚洲第一电影网av| 哪里可以看免费的av片| 欧美乱码精品一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 1000部很黄的大片| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜激情欧美在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲黑人精品在线| 身体一侧抽搐| 久久久久性生活片| 午夜a级毛片| 两个人看的免费小视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲最大成人中文| 日本一二三区视频观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲avbb在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 在线播放无遮挡| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品亚洲一级av第二区| 在线观看日韩欧美| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 级片在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日韩高清综合在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 深夜精品福利| 亚洲一区二区三区不卡视频| 免费看十八禁软件| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 99久国产av精品| 久久久成人免费电影| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 婷婷精品国产亚洲av| 精品一区二区三区视频在线 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 亚洲国产精品合色在线| 午夜精品在线福利| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲熟妇熟女久久| 少妇熟女aⅴ在线视频| 黄片大片在线免费观看| 日本五十路高清| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美黑人巨大hd| 日本黄色视频三级网站网址| av片东京热男人的天堂| 91麻豆精品激情在线观看国产| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 不卡一级毛片| 首页视频小说图片口味搜索| 美女黄网站色视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产av不卡久久| 日本熟妇午夜| 国产欧美日韩一区二区精品| 美女免费视频网站| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲av一区综合| 一区二区三区激情视频| 欧美3d第一页| 日本精品一区二区三区蜜桃| 内射极品少妇av片p| 午夜福利视频1000在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 特级一级黄色大片| 免费观看的影片在线观看| 午夜影院日韩av| 九色国产91popny在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产69精品久久久久777片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 嫩草影院入口| 国产精品影院久久| 99久久成人亚洲精品观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲专区国产一区二区| 很黄的视频免费| 国产免费av片在线观看野外av| 人人妻人人看人人澡| 18美女黄网站色大片免费观看| 嫩草影视91久久| 亚洲不卡免费看| 九九热线精品视视频播放| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产日本99.免费观看| 免费电影在线观看免费观看| 国产精品亚洲美女久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲国产精品999在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日本a在线网址| 国产高潮美女av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成人特级av手机在线观看| 久久国产精品影院| 成年免费大片在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 18+在线观看网站| 俺也久久电影网| 欧美av亚洲av综合av国产av| 免费观看精品视频网站| 夜夜爽天天搞| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久人妻av系列| 超碰av人人做人人爽久久 | 母亲3免费完整高清在线观看| 日韩人妻高清精品专区| av黄色大香蕉| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩欧美 国产精品| 久久伊人香网站| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久香蕉国产精品| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美中文日本在线观看视频| 天堂√8在线中文| 婷婷精品国产亚洲av| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费高清视频大片| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲欧美激情综合另类| 88av欧美| 免费无遮挡裸体视频| 国产日本99.免费观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲av五月六月丁香网| 国产中年淑女户外野战色| 美女黄网站色视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 可以在线观看的亚洲视频| 精品国产美女av久久久久小说| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产欧美日韩一区二区精品| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 99久久99久久久精品蜜桃| 老鸭窝网址在线观看| 日韩欧美 国产精品| 欧美成人免费av一区二区三区| 综合色av麻豆| 三级国产精品欧美在线观看|