離子液體輔助超聲萃取-高效液相色譜同時測定半邊蓮中6 種黃酮類化合物

鄧永利，周光明，陳軍華，高　意，廖安輝

（西南大學化學化工學院，發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室，重慶 400715）

離子液體輔助超聲萃取-高效液相色譜同時測定半邊蓮中6 種黃酮類化合物

鄧永利，周光明*，陳軍華，高意，廖安輝

（西南大學化學化工學院，發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室，重慶 400715）

目的：通過單因素試驗和正交試驗對離子液體輔助萃取半邊蓮中黃酮類化合物的條件進行優(yōu)化，建立高效液相色譜法同時分離測定半邊蓮中蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素的方法。方法：采用InertSustain C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）進行分離；流動相為甲醇（B）-乙酸溶液（A，pH 3.0），梯度洗脫；流速1.0 mL/min；紫外檢測波長285 nm；柱溫35 ℃。結果：以黃酮類化合物的提取量為指標，最佳提取條件為甲醇體積分數80%、固液比1∶80（g/mL）、萃取時間30 min、離子液體濃度0.6 mol/L。在優(yōu)化的色譜條件下，蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素分離效果良好；定性檢出限（RSN= 3）依次為0.001 2、0.002 3、0.002 6、0.000 2、0.001 0、0.000 6 μg/mL；樣品回收率為91.77%～102.53%。結論：該萃取方法操作簡單快速，為半邊蓮中黃酮類化合物的提取分離及檢測提供了有效的方法。

高效液相色譜；半邊蓮；黃酮類化合物；離子液體；超聲萃取

半邊蓮（Herba Lobelia chinensis），又名半邊花、水仙花草、長蟲草等，系桔梗科半邊蓮的干燥全草；味辛、平，歸心、小腸、肺經。現(xiàn)代藥理學表明半邊蓮具備利尿消腫、清熱解毒等功效，可用于治療臌脹水腫、濕熱黃疸、濕疹濕瘡等疾?。?］。據文獻報道，半邊蓮中含有黃酮類［2-3］、萜類［4］、木脂素類［5-6］、生物堿類［7-9］等多種活性成分。大量國內外的實驗證明半邊蓮具有抗癌［10-13］、抗病毒［14］、抗炎［15-16］和抑制動脈硬化［17］的功能；亦有研究表明半邊蓮能夠大量吸收被污染土壤中的重金屬鎘，并有望用于植物修復［18］。

半邊蓮具有豐富的植物資源和顯著的藥理作用。目前，關于半邊蓮中有效成分分離測定的報道較少，僅見喬春峰等［19］定量測定了半邊蓮中兩種多炔類成分；黃秀香［20］、李穎［21］等分別優(yōu)化了半邊蓮中黃酮苷和異阿魏酸的提取工藝，因此亟待對該植物的化學成分進行進一步深入研究。黃酮類化合物是半邊蓮中非常重要的一類化合物，并且黃酮類化合物被認為是抗癌的主要活性成分［22-23］，半邊蓮中含有的黃酮類化合物主要有蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素等［5,24-25］。近幾年，在綠色化學的框架下發(fā)展起來的一種新型萃取劑——離子液體，具有蒸汽壓低、熱穩(wěn)定性好、溶解性強和可設計等特性［26-29］，使其在化學領域具有廣泛應用，離子液體已經作為輔助溶劑萃取天然產物中的活性成分［30-31］。另外，超聲波法是提取中藥中活性成分的常用方法，它能加速藥材中有效成分溶解、縮短提取時間、提高有效成分的提取率等優(yōu)點［32］。鑒于此，本實驗以離子液體1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（［HMIm］PF6）作為輔助萃取溶劑，結合超聲波法提取半邊蓮中的有效成分，利用高效液相色譜同時分離和定量測定提取液中的蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

半邊蓮 重慶藥房。

蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對照品（純度均≥98.5%） 上海晶純實業(yè)有限公司；1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（純度為99%） 中科院蘭州化學物理研究所；乙酸（分析純）、甲醇（色譜純） 重慶川東化工有限公司化學試劑廠；二次蒸餾水 實驗室自制。

1.2儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀（包括SPD-20A紫外檢測器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵） 日本島津公司；KH-3200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SZ-2自動雙重純化水蒸餾器 上海滬西分析儀器；XY型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：InertSustain C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇為流動相B，乙酸（pH 3.0）為流動相A，梯度洗脫（0～5 min，50%～55% B；5～1 5 m i n，5 5%～5 5% B；1 5～2 0 m i n，55%～50% B）；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：285 nm；柱溫：35 ℃?；旌蠈φ掌泛蜆悠返纳V圖見圖1。

圖1　混合對照品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1　Chromatograms of standard mixture （A） and sample （B）

1.3.2溶液的制備

1.3.2.1對照品溶液的制備

精密稱定蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對照品適量于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成對照品儲備液。分別精密吸取各對照品溶液適量于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成混合對照品溶液，置于冰箱（4 ℃）內避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2供試品溶液的制備

將中藥半邊蓮在60 ℃烘箱干至質量恒定后研磨粉碎，粉末過60 目篩。稱取0.1 g半邊蓮粉末于具塞錐形瓶中，準確加入8 mL 0.6 mol/L ［HMIm］PF6溶液，稱定質量，超聲萃取30 min，再稱定質量，用提取溶劑補足減失的質量。提取液5 000 r/min離心5 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

可見，在一個工作日內，A1類機床安排1臺來生產零件B1、安排2臺來生產零件B2,A2類2臺機床只生產零件B1,A3類4臺機床只生產零件B2．零件B1共生產90件，零件B2共生產132件，按2∶3將零件裝配成產品時最大產量仍為44件．將上述最優(yōu)解整理為企業(yè)的最優(yōu)生產方案，如下表3．

2　結果與分析

2.1流動相的選擇

分別考察甲醇、乙腈與不同pH值（乙酸調節(jié)）的溶液作為流動相的分離效果。實驗結果表明，當pH 3.0的乙酸溶液作為流動相時能夠有效抑制蘆丁色譜峰的前延和山柰酚、芹菜素色譜峰的拖尾。對比甲醇和乙腈作為流動相的色譜圖，發(fā)現(xiàn)甲醇作為流動相時槲皮素和柚皮素的分離度明顯大于乙腈作為流動相的分離度，可能是由于乙腈對槲皮素和柚皮素的洗脫能力更強，使得槲皮素和柚皮素的分離效果較差。在分離的6 種成分中可能是因為槲皮素和柚皮素以及山柰酚和芹菜素的極性相近，在等度洗脫的條件下，槲皮素和柚皮素、山柰酚和芹菜素的色譜峰重疊嚴重，難以達到定量分析的要求。其中槲皮素和柚皮素更是難以同時分離，查閱資料顯示有關槲皮素和柚皮素同時分離的報道較少。但是，由圖1可知，通過設置梯度洗脫，使得不易同時分離的山柰酚和芹菜素成功完全分離，較難同時分離的槲皮素和柚皮素亦能達到定量分析的要求。為了改善色譜峰的峰形和避免基質中雜質對分析目標物的干擾，不斷調節(jié)流動相的比例，最終確定了1.3.1節(jié)中的梯度洗脫條件。結果表明，在1.3.1節(jié)的色譜條件下，較難同時分離的槲皮素和柚皮素能夠得到較好地分離，并且能夠達到定量分析的要求。

2.2提取條件的優(yōu)化與確定

2.2.1提取溶劑及離子液體濃度的選擇

圖2　甲醇體積分數對提取量的影響Fig.2　Effect of methanol concentration on the extraction efficiency

圖3　離子液體濃度對提取量的影響Fig.3　Effect of ionic liquid concentrations on the extraction efficiency

比較了20%、40%、60%、80%和100%甲醇體積分數的溶液作為提取溶劑后，由圖2可知，6 種分析物的提取量隨著甲醇體積分數的增大而增大，且80%和100%的甲醇對6 種分析物的提取量相當，為了節(jié)約有機試劑，選擇80%甲醇溶液作為單因素試驗的提取溶劑。同時進一步考察不同濃度離子液體提取溶劑對有效成分提取量的影響，依次以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L離子液體作為提取溶劑的提取效果。圖3表明，當離子液體的濃度為0.6 mol/L時，各成分的提取量達到最大，其中柚皮素和蘆丁的提取量明顯增加，離子液體的濃度大于0.6 mol/L提取量并無明顯增加。

2.2.2超聲時間的選擇

比較超聲提取10、20、30、40 min和50 min 6 種成分的提取量，在10～30 min內，各成分的提取量隨超聲時間的延長而明顯增大，超過30 min后，提取量并無明顯增加，實驗結果見圖4。

圖4　超聲時間對提取量的影響Fig.4　Effect of ultrasonication time on the extraction efficiency

考察固液比為1∶30、1∶50、1∶60、1∶80和1∶100（g/mL）6 種成分的提取效果，實驗結果見圖5，1∶80和1∶100的固液比都可以得到滿意的提取效果。根據6 種有效成分對紫外光的吸收強度，選擇285 nm作為檢測波長。

圖5　固液比對提取量的影響Fig.5　Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency

2.2.4正交試驗結果

為全面考察離子液體輔助超聲提取各因素的影響，在單因素試驗的基礎上設計正交試驗。采用L9（34）正交試驗進一步優(yōu)化實驗條件，以甲醇體積分數、固液比、離子液體濃度和超聲時間為考察因素，綜合單因素試驗的結果各選取3 個水平進行正交試驗，試驗中以6 種成分的提取量為考察指標，正交試驗設計的結果及直觀分析見表1。由極差R可知，各因素對6 種活性成分提取量的影響程度依次為B＞A＞C＞D，即固液比對提取量的影響最大，其次分別為甲醇體積分數、離子液體濃度、超聲時間。由表1可知，在正交試驗范圍內得到的最佳試驗條件為A2B2C1D1，即甲醇體積分數80%、固液比1∶80、離子液體濃度0.6 mol/L、超聲時間30 min。在此條件下進行驗證實驗，測半邊蓮中各成分提取量為蘆丁12.3 μg/0.1 g、槲皮素5.1 μg/0.1 g、柚皮素14.5 μg/0.1 g、橙皮素8.1 μg/0.1 g、山柰酚4.9 μg/0.1 g和芹菜素5.2 μg/0.1 g。

表1　正交試驗設計及結果Table1　Orthogonal array design with experimental results for the extraction of total flavonoids

2.3方法學考察

2.3.1線性關系考察

精密量取1.3.2.1節(jié)的混合對照品溶液，以甲醇逐步稀釋為7 個不同質量濃度的混合對照品溶液并在1.3.1節(jié)的條件下按質量濃度由低到高的順序依次進樣3 次進行分析。以對照品平均峰面積為縱坐標Y，質量濃度（μg/mL）為橫坐標X作圖繪制標準曲線，根據RSN=3計算方法的檢出限。6種化合物線性回歸方程、線性范圍、相關系數和檢出限見表2。

表2　6種化合物的線性關系考察結果Table2　Calibration curves with linear ranges and limits of detection for 6 flavonoid compounds

2.3.2穩(wěn)定性實驗結果

用同一供試品溶液48 h內每間隔6 h進樣分析，結果蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素峰面積的相對標準偏差分別為1.81%、0.93%、2.55%、1.71%、2.10%、2.32%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.3精密度實驗結果

混合對照品溶液在1.3.1節(jié)的條件下重復進樣6 次，測定各個對照品的峰面積，結果蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對照品的峰面積相對標準偏差分別為0.90%、1.61%、2.34%、1.63%、1.20%、2.56%，表明儀器精密度良好。

2.3.4樣品的含量測定及回收率實驗結果

按1.3.2.2節(jié)的步驟制備供試品溶液3 份，每份供試品溶液進樣分析3 次，根據線性方程測定樣品含量，結果見表3。精密稱取已知含量的同一批半邊蓮樣品9 份，每份0.1 g，分為3 組，每組按低、中、高分別加入一定量的對照品溶液，然后按照供試品溶液的制備方法進行處理，每份進樣3 次，計算平均回收率，結果見表3。樣品回收率為91.77%～102.53%，相對標準偏差小于3%。

表3　樣品含量測定及加標回收率實驗結果（n=3）Table3　Results for the determination of six flavonoids in real samples and spiked recoveries （ n= 3）

3　結 論

利用高效液相色譜結合紫外檢測器分離和測定了半邊蓮中蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素6 種黃酮類化合物。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化，確定超聲波同時提取半邊蓮中6 種黃酮類化合物的最佳提取條件為甲醇體積分數80%、固液比1∶80、超聲時間30 min、離子液體濃度0.6 mol/L，在此條件下測得半邊蓮樣品中含蘆丁12.3 μg/0.1 g、槲皮素5.1 μg/0.1 g、柚皮素14.5 μg/0.1 g、橙皮素8.1 μg/0.1 g、山柰酚4.9 μg/0.1 g和芹菜素5.2 μg/0.1 g。利用離子液體1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（［HMIm］PF6）作為輔助萃取溶劑，明顯提高了所測成分的提取率，當離子液體濃度為0.6 mol/L時，各成分的提取量達到最大。通過結合超聲波法加快了半邊蓮藥材中所測成分的溶解，與傳統(tǒng)的浸漬法、滲漉法、煎煮法、索氏提取法相比，大大縮短了超聲時間，明顯提高了提取效率。樣品各成分的加標回收率為91.77%～102.53%（相對標準偏差小于3%），取得了令人滿意的回收率。該方法操作簡便、快速，為半邊蓮的質量控制及其中黃酮類化合物的進一步研究提供了實驗依據。

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Simultaneous Determination of 6 Flavonoid Compounds in Herba Lobelia chinensis by High Performance Liquid Chromatography after Ionic Liquid Assisted Ultrasonic Extraction

DENG Yongli, ZHOU Guangming*, CHEN Junhua, GAO Yi, LIAO Anhui
（Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis, Ministry of Education, School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China）

Objectives： To optimize the conditions for ionic liquid-assisted extraction of fl avonoids compounds from Herba Lobelia chinensis using single factor and orthogonal array designs and consequently to establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of rutin, quercetin, naringgenin, hesperetin, kaempferol and apigenin in Herba Lobelia chinensis. Methods： The 6 compounds were separated on an InertSustain C18（150 mm × 4.6 mm, 5 μm）using a mobile phase consisting of methanol and acetic acid （pH 3.0） with gradient elution at a fl ow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 285 nm. The column temperature was maintained at 35 ℃. Results： The optimum extraction conditions for total fl avonoids were determined as follows： 80% （V/V） aqueous methanol as extraction solvent；solid-to-liquid ra tio, 1：80 （g/mL）； extraction time, 30 min； and ionic liquid concentration, 0.6 mol//L. Under these conditions, rutin, quercetin, naringgenin, hesperetin, kaempferol and apigenin were separated satisfactorily. The limits of detection （LODs）for these fl avonoid compounds were 0.001 2, 0.002 3, 0.002 6, 0.000 2, 0.001 0 and 0.000 6 μg/mL, respectively. The recoveries of spiked samples ranged from 91.77% to 102.53%. Conclusion： The proposed method is simple and rapid, and it can provide an effi cient means for the extraction, separation and determination of fl avonoid compounds in Herba Lobelia chinensis.

high performance liquid chromatography； Herba Lobelia chinensis Lour.； flavonoid compounds； ionic liquid；ultrasonic extraction

10.7506/spkx1002-6630-201620007

O657.72

A

1002-6630（2016）20-0037-05

鄧永利, 周光明, 陳軍華, 等. 離子液體輔助超聲萃取-高效液相色譜同時測定半邊蓮中6 種黃酮類化合物［J］. 食品科學, 2016, 37（20）： 37-41. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620007. http：//www.spkx.net.cn

DENG Yongli, ZHOU Guangming, CHEN Junhua, et al. Simultaneous determination of 6 flavonoid compounds in Herba Lobelia chinensis by high performance liquid chromatography after ionic liquid assisted ultrasonic extraction［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 37-41. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620007. http：//www.spkx.net.cn

2016-01-04

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項（100030-2120130993）

鄧永利（1980—），女，碩士研究生，研究方向為離子色譜。E-mail：hxdengyl@swu.edu.cn

周光明（1964—），男，教授，博士后，研究方向為色譜及其聯(lián)用技術。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn