貴長獼猴桃多糖提取工藝及體外抗氧化功能

王金華，杜　超，梁　晨，馬立志，曾　加

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州 貴陽 550005）

貴長獼猴桃多糖提取工藝及體外抗氧化功能

王金華1,2，杜超1,2，梁晨1,2，馬立志1,2，曾加1

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州 貴陽 550005）

研究貴長獼猴桃果肉多糖、果皮多糖的提取工藝及體外抗氧化能力。采用正交試驗優(yōu)化貴長獼猴桃果肉、果皮多糖提取工藝參數(shù)，蒽酮-硫酸法測定多糖含量；用鄰苯三酚自氧化及Fenton反應法測定貴長獼猴桃多糖抗氧化活性。結果表明：果肉多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取溫度80 ℃、提取時間2 h、料液比1∶35（g/mL），重復提取3 次，多糖提取率可達1.74%；果皮多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取溫度70 ℃、提取時間2 h、料液比1∶25（g/mL），重復提取3 次，多糖提取率可達1.16%。貴長獼猴桃果肉粗多糖、果皮粗多糖對O2-·和·OH均具有很好的清除作用，果肉多糖清除O2-·和·OH的IC50分別是12.4、41.3 μg/mL，果皮多糖清除2 種自由基的IC50分別是84.1、50.8 μg/mL。

貴長獼猴桃；果肉；果皮；多糖；提取工藝；抗氧化能力

貴長獼猴桃呈長圓柱形，果皮金黃，硬毛，屬“美味”獼猴桃類型，是貴州省果樹研究所從貴州野生獼猴桃中精選培育出的品種。1990年開始在黔北地區(qū)引進，現(xiàn)已成為貴州獼猴桃栽培大縣修文縣的主栽品種，并于2011年9月成為國家地理標志保護產(chǎn)品［1］。該品種果肉翠綠色，富含VC、胡蘿卜素以及鐵、鋅等微量元素，清香爽口，酸甜適度，深受消費者喜愛。多糖又稱多聚糖，由單糖聚合成聚合度大于10的極性大分子，與生命的多種生理功能密切相關［2］。多糖具有多種臨床作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖血脂等作用，并對防治腫瘤、糖尿病、冠心病等有一定作用，具有清除自由基的作用，能提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的活性，起到保護生物膜和延緩衰老的作用［3-6］?，F(xiàn)針對貴長獼猴桃開展的研究主要集中在種植技術、保鮮、深加工產(chǎn)品研發(fā)［7-9］等方面。鮮見針對貴長獼猴桃多糖的研究。有研究表明，從中華獼猴桃根［10］、軟棗獼猴桃莖［11］中提取的多糖具有顯著的生物活性。軟棗獼猴桃粗多糖也具有較強的抗氧化活性［12］。本實驗擬對貴長獼猴桃果肉及果皮中多糖的提取工藝及體外抗氧化活性進行初步實驗。從而為貴長獼猴桃的深入研究與開發(fā)提供參考，促進當?shù)亟?jīng)濟的進一步發(fā)展。

1　材料與方法

1.1材料

貴長獼猴桃采自貴州省貴陽市修文益眾農(nóng)場；蒽酮試劑、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、水楊酸、乙醇、過氧化氫；其余化學試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

AUW-120D電子天平、UV-2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；AL104型精密分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；TGL-16A臺式高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司 。

1.3方法

1.3.1樣品處理

獼猴桃清洗后，經(jīng)果肉與果皮分離，分別磨漿、干燥至質(zhì)量恒質(zhì)量，打粉備用。

1.3.2貴長獼猴桃多糖提取工藝流程［13］

獼猴桃粉→浸提法提取多糖（粗多糖）→乙醇沉淀→除蛋白→冷凍干燥→體外抗氧化功效研究

1.3.3貴長獼猴桃多糖提取單因素試驗

在其他條件相同的條件下，以粗多糖提取率為指標，分別研究提取溫度（60、70、80、90 ℃）、提取時間（1、2、3、4、5 h）、料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL））3 個單因素對獼猴桃多糖提取效果的影響。

1.3.4貴長獼猴桃多糖提取正交試驗［14-15］

在單因素試驗基礎上，以粗多糖提取率為考察指標，用正交試驗L9（33）優(yōu)選獼猴桃多糖提取工藝，設置因素水平如表1所示。

表1　正交試驗因素與水平Table1　Factors and levels used for orthogonal array design

1.3.5多糖含量測定

參照《中國藥典》，采用蒽酮-硫酸法測定 。

1.3.5.1標準曲線的繪制

精密稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖10 mg，用蒸餾水定容至100 mL，即為葡萄糖標準溶液。分別精密吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加80%的硫酸溶液100 mL使溶解，搖勻）6 mL，搖勻，置水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應的試劑為空白，依據(jù)紫外-可見分光光度法（附錄VA），在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.5.2樣品粗多糖含量測定

將樣品溶液糖質(zhì)量濃度調(diào)整到測定范圍，精確吸取2 mL置于干燥潔凈試管中，在每支試管中立即加入蒽酮試劑6 mL，振蕩混勻，各管加完后一起置于沸水浴中加熱15 min。取出，迅速浸于冰水浴中冷卻15 min，每個質(zhì)量濃度做2～3 個重復。在625 nm波長處迅速測定各管吸光度。根據(jù)葡萄糖含量的標準曲線，由樣品溶液吸光度計算各樣品溶液中糖的質(zhì)量濃度，按式（1）并計算多糖含量。

式中：c為測得的樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為供試液體積/mL；m為供試品的質(zhì)量/mg。

1.3.5.3多糖提取率計算

式中：m為醇沉后得到的粗多糖質(zhì)量/g；m1為稱取的獼猴桃樣品的質(zhì)量/g。

1.3.6貴長獼猴桃多糖體外抗氧化實驗［16-22］

在最優(yōu)提取工藝條件下對貴長獼猴桃的果肉、果皮中多糖分別進行提取得粗多糖，冷凍干燥后用于抗氧化能力實驗。

1.3.6.1清除O2-·能力

自氧化速率測定：4.5 mL 50 nmol/L、pH 8.2 Tris-HCl緩沖液與4.2 mL蒸餾水混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，加入在25 ℃預熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL（以10 mmol/L HCl溶液配制），混勻，在325 nm波長處每隔0.5 min比色一次，以上述Tris-HCl緩沖液為空白，計算鄰苯三酚的自氧化率V0。

以不同質(zhì)量濃度的貴長獼猴桃多糖溶液代替蒸餾水，按上述方法操作，計算鄰苯三酚的自氧化率V1。按公式（3）計算O2-·清除率：

1.3.6.2清除·OH能力

在反應體系中加入8 mmol/L FeSO4溶液2 mL、8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，不同質(zhì)量濃度多糖溶液1 mL，最后加1 mL體積分數(shù)0.03% H2O2啟動反應，在37 ℃反應30 min。在510 nm波長處測定吸光度Ai，以相同質(zhì)量濃度的多糖溶液不加0.03% H2O2為本底吸光度Aj。并以蒸餾水為參比液測定吸光度A0。清除率計算見公式（4）：

2　結果與分析

2.1標準曲線的繪制

以葡萄糖為標準，所得標準曲線回歸曲線方程為y= 0.010 9x+0.009 7，相關系數(shù)R2=0.999 1，可信度較高。

2.2單因素試驗結果

2.2.1提取時間對貴長獼猴桃多糖提取率的影響

圖1　提取時間對多糖提取率的影響Fig.1　Effect of extraction time on polysaccharide yield

在80 ℃和料液比1∶20情況下，考察提取時間對貴長獼猴桃多糖提取效果的影響，如圖1所示，隨著提取時間的延長，多糖提取率逐漸增大。4 h時果肉多糖提取率達到0.975%，果皮多糖提取率達到0.672%，提取率均為最高，且與其他時間提取率差異顯著。此后果皮和果肉中多糖的提取率均下降?？赡茉蚴窃陂L時間受熱情況下多糖分解的所致。故選用提取時間為4 h進行后續(xù)實驗。

2.2.2提取溫度對貴長獼猴桃多糖提取率的影響

圖2　提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on polysaccharide yield

在料液比1∶20和提取時間4 h情況下，考察提取溫度對貴長獼猴桃多糖提取效果的影響，如圖2所示。果肉多糖和果皮多糖提取率變化趨勢一致，開始時，多糖的提取率隨著水浴溫度的升高呈不斷增加的趨勢，當溫度達80 ℃時，提取率達最高，且與其他處理溫度差異顯著。當溫度超過80 ℃后多糖提取率呈下降趨勢，可能是溫度過高導致多糖降解所致。故采用80 ℃為宜。

2.2.3料液比對貴長獼猴桃多糖提取率的影響

圖3　料液比對粗多糖提取率的影響Fig.3　Effect of solid-to-solvent ratio on polysaccharide yield

在80 ℃和提取時間4 h情況下，考察料液比對貴長獼猴桃多糖提取效果的影響，隨著溶劑用量的降低，多糖提取率逐漸升高，溶劑用量過高或過低都不能對多糖進行充分提取，結果如圖3所示。果肉多糖和果皮多糖提取率變化趨勢基本一致，當料液比為1∶30時，果皮多糖和果肉多糖提取率分別達1.88%和1.12%，其與1∶20、1∶25處理結果差異顯著，與1∶35處理差異不顯著。即當料液比1∶30時多糖提取率最大，此后即使繼續(xù)增大溶劑用量，多糖提取率增加不明顯，考慮到后續(xù)的醇沉等工藝，從節(jié)約成本角度考慮，選擇1∶30比例進行后續(xù)實驗研究。

2.3正交試驗結果

2.3.1貴長獼猴桃果肉中多糖提取正交試驗結果

貴長獼猴桃果肉多糖提取正交試驗結果見表2、3，由直觀分析及方差分析結果可以看出：RB＞RC＞RA，即提取溫度對貴長獼猴桃果肉多糖提取率影響最大，其次是料液比和提取時間。方差分析結果顯示A、B、C三因素對試驗結果影響均不顯著，所以由直觀分析得出最優(yōu)提取條件為B3C3A1，即提取溫度80 ℃、提取時間2 h、料液比1∶35。

表2　貴長獼猴桃果肉多糖提取L9（333）正交試驗結果Table2　Orthogonal array design L9（333） with experimental results ofpolysaccharide yield from kiwifruit pulpp

表3　貴長獼猴桃果肉多糖提取正交試驗方差分析Table3　Analysis of variance of orthogonal array experimental results for polysaccharide yield from kiwifruit pulp

2.3.2貴長獼猴桃果肉中多糖提取驗證實驗結果

在提取溫度8 0 ℃、提取時間2 h、料液比1∶35（g/mL）條件下，進行3 次平行實驗，貴長獼猴桃果肉多糖提取率分別為1.72%、1.76%和1.73%，平均提取率為1.74%。因此確定B3C3A1為最佳提取方案。在最優(yōu)條件下重復提取3 次，多糖提取率可達1.74%。

2.3.3貴長獼猴桃果皮中多糖提取正交試驗結果

表4　貴長獼猴桃果皮多糖提取L9（33）正交試驗結果Table4　Orthogonal array design L9 （33） with experimental results of polysaccharide yield from kiwifruit pericarpp

表5　貴長獼猴桃果皮多糖提取正交試驗方差分析Table5　Analysis of variance of orthogonal array experimental results for polysaccharide yield from kiwifruit pericarp

貴長獼猴桃果皮多糖提取正交試驗結果見表4、5。由直觀分析與方差分析結果可以看出：RC＞RA＞RB，即料液比對貴長獼猴桃果皮多糖提取率影響最大，其次是提取時間和提取溫度。方差分析A、B、C三因素對實驗結果的影響均不顯著，所以由直觀分析得出最優(yōu)提取條件為C1A1B2，即提取溫度70 ℃、提取時間2 h、料液比1∶25。

2.3.4貴長獼猴桃果皮中多糖提取驗證實驗結果

在提取溫度7 0 ℃、提取時間2 h、料液比1∶25（g/mL）條件下，進行3 次平行實驗，貴長獼猴桃果皮多糖提取率分別為1.14%、1.14%和1.18%，平均提取率為1.16%。因此確定C1A1B2為最佳提取方案。在最優(yōu)條件下重復提取3 次，多糖提取率可達1.16%。

2.4貴長獼猴桃粗多糖抗氧化性能

圖4　貴長獼猴桃粗多糖對·的清除能力Fig.4　Scavenging effects of kiwifruit polysaccharides against superoxide anion radical

由圖4可見，貴長獼猴桃果肉粗多糖、果皮粗多糖在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對·具有較好的清除作用，且果肉粗多糖的清除效果優(yōu)于果皮多糖。用回歸分析貴長獼猴桃果肉粗多糖和果皮粗多糖清除·的IC50分別是12.4 μg/mL和84.1 μg/mL。據(jù)文獻［12］報道，軟棗獼猴桃粗多糖對·的清除率低于50%，淫羊藿多糖清除·的IC50是2.5 μg/mL［23］，由數(shù)據(jù)分析可見，貴長獼猴桃粗多糖清除·的能力優(yōu)于軟棗獼猴桃粗多糖，低于藥用植物淫羊藿多糖。

2.4.2清除·OH能力

采用Fenton反應檢測貴長獼猴桃多糖清除·OH能力。利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510 nm處有最大吸收。貴長獼猴桃果肉、果皮多糖清除·OH能力如圖5所示。

圖5　貴長獼猴桃多糖對·OH的清除作用Fig.5　Scavenging effects of kiwifruit polysaccharides against hydroxyl radical

由圖5可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，貴長獼猴桃果肉多糖和果皮多糖對·OH的清除率均隨著其質(zhì)量濃度的增加而增大。在低質(zhì)量濃度情況下果肉多糖清除·OH能力大于果皮多糖，但當質(zhì)量濃度增加至60 μg/mL后果皮多糖清除·OH能力接近于果肉多糖并逐漸優(yōu)于果肉多糖?；貧w分析分別計算出貴長獼猴桃果肉多糖和果皮多糖對·OH的IC50值分別為41.3、50.8 μg/mL。優(yōu)于文獻［12］報道的軟棗獼猴桃粗多糖對·OH的IC50值66.8 μg/mL。由此可見，不同品種獼猴桃的多糖抗氧化能力存在著差異，具體原因需進一步深入研究。

3　結 論

本實驗研究了貴長獼猴桃果肉多糖、果皮多糖的提取工藝，通過正交試驗得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)，果肉多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取溫度80 ℃、提取時間2 h、料液比1∶35（g/mL），在最佳提取條件下，果肉多糖提取率為1.74%；果皮多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)為即提取溫度70 ℃、提取時間2 h、料液比1∶25（g/mL），在最佳提取條件下，多糖提取率為1.16%。通過對貴長獼猴桃果肉粗多糖、果皮粗多糖體外抗氧化能力研究表明，二者對O2-·和·OH均具有很好的清除作用，果肉粗多糖清除O2-·和·OH的IC50分別是12.4、41.3 μg/mL，果皮粗多糖清除兩種自由基的IC50分別是84.1、50.8 μg/mL，明顯優(yōu)于文獻報道的刺梨多糖［24］、軟棗獼猴桃多糖［12］、枸杞多糖［25］的抗氧化能力，可能因為供試的多糖樣品是粗多糖，混有VC、多酚等其他強抗氧化物質(zhì)，具體原因有待進一步深入研究。

尤其值得注意的是，獼猴桃果皮粗多糖表現(xiàn)的優(yōu)異抗氧化性，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，果皮粗多糖對·OH的清除能力甚至優(yōu)于果肉粗多糖。在生產(chǎn)過程中，果皮多作為下腳料而丟棄，其中的粗多糖提取工藝簡單、可重復性強，因而具有很高的開發(fā)利用前景。

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Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Guichang Kiwifruit

WANG Jinhua1,2, DU Chao1,2, LIANG Chen1,2, MA Lizhi1,2, ZENG Jia1
（1. College of Food and Pharmaceutical Engineering, Guiyang University, Guiyang 550005, China；2. Guizhou Engineering Research Center For Fruit Processing, Guiyang 550005, China）

The extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Guichang kiwifruit pulp or pericarp were investigated in this work. The optimization of the extraction parameters was investigated by using orthogonal array design. Polysaccharide content was determined by the anthranone-sulfuric acid method. The antioxidant activities of Guichang kiwifruit polysaccharides were tested by pyrogallol autoxidation and Fenton's oxidation reaction. The results showed that the optimum extraction conditions for kiwifruit pulp polysaccharides were found to be 2 h extraction at 80 ℃ with a solid-to-solvent ratio of 1：35 （g/mL） performed three times, and those for kiwifruit pericarp polysaccharides were determined as follows： three extraction cycles at 70 ℃ each for 2 h at a solid-to-solvent ratio of 1：25 （g/mL） . Under the optimized conditions, the yield of polysaccharide extracted from kiwifruit pulp and pericarp reached 1.74% and 1.16%, respectively. The polysaccharides from kiwifruit pulp and pericarp both had strong scavenging effects on superoxide anion and hydroxyl radicals with half inhibitory concentration （IC50） of 12.4 and 41.3 μg/mL for pulp polysaccharides and 84.1 and 50.8 μg/mL for pericarp polysaccharides, respectively.

Guichang kiwifruit； pulp； pericarp； polysaccharide； extraction process； antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201620004

TS255.1

A

1002-6630（2016）20-0019-05

王金華, 杜超, 梁晨, 等. 貴長獼猴桃多糖提取工藝及體外抗氧化功能［J］. 食品科學, 2016, 37（20）： 19-23. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201620004. http：//www.spkx.net.cn

WANG Jinhua, DU Chao, LIANG Chen, et al. Extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Guichang kiwifruit［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 19-23. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620004. http：//www.spkx.net.cn

2016-01-21

貴州省科學技術基金項目（黔科合LH字［2014］7174號）；貴州省教育廳自然科學研究項目（黔教合KY字［2013］199號；黔教合KY字［2014］309號）；貴州省普通高等學校創(chuàng)新人才團隊建設項目（黔教合人才團隊字［2014］44號）；食品科學與工程重點學科項目（黔學位合字ZDXK［2014］13號）；貴州省果品加工、貯藏與安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心項目（黔教合協(xié)同中心字［201306］）

王金華（1980—），女，高級實驗師，碩士，研究方向為果蔬深加工。E-mail：292723451@qq.com