4種復(fù)合微生物菌劑對全株玉米青貯的影響研究

王麗學(xué)，范寰，霍文娟*，劉景喜，潘振亮，陳龍賓，韓靜，馮婧，孟繁瑞

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300381；2.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津300381）

4種復(fù)合微生物菌劑對全株玉米青貯的影響研究

王麗學(xué)1，2，范寰1，2，霍文娟1，2*，劉景喜1，2，潘振亮1，2，陳龍賓1，2，韓靜1，2，馮婧1，2，孟繁瑞1，2

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300381；2.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津300381）

凝結(jié)芽孢桿菌（B）、植物乳桿菌（L）、糞鏈球菌（S）和乳酸片球菌（P）是四種同型發(fā)酵乳酸菌，為探討其作為青貯添加劑的組合應(yīng)用效果，本研究以任意三種組成的4種復(fù)合菌劑（BLS、BSP、BLP和LSP）為研究對象，進(jìn)行全株玉米青貯，分別設(shè)置50 mL/t和100 mL/t兩個劑量處理，對照組以蒸餾水代替復(fù)合微生物菌劑。結(jié)果表明：（1）復(fù)合微生物菌劑處理全株玉米青貯在感官評價上均優(yōu)于對照組；（2）與對照組相比，復(fù)合微生物菌劑處理組具有較高的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和淀粉含量以及較低的灰分、NDF和ADF含量，在一定程度上減少了全株玉米青貯的營養(yǎng)損失；（3）復(fù)合微生物處理組雖在一定程度上增加了乳酸在總有機(jī)酸中所占比例而減少了乙酸、丙酸和丁酸所占比例，但其差異未達(dá)顯著水平；（4）運(yùn)用隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合比較，復(fù)合微生物菌劑以BLP即凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌和乳酸片球菌組合為最佳，劑量以100 mL/t為佳。

凝結(jié)芽孢桿菌；植物乳桿菌；糞鏈球菌；乳酸片球菌；全株玉米；青貯品質(zhì)

全株玉米青貯營養(yǎng)豐富，適口性好，易消化且保存期長，可提高奶牛產(chǎn)奶量，減少疾病發(fā)生，同時可實(shí)現(xiàn)一年四季均衡供應(yīng)，是目前我國奶牛養(yǎng)殖重要的優(yōu)質(zhì)粗飼料來源（李德鋒等，2013；張曉慶等，2013）。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）和乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）屬于同型乳酸菌，均具有促進(jìn)乳酸發(fā)酵、改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)、抑制雜菌生長、減少養(yǎng)分損失等特點(diǎn)（侯新強(qiáng)等，2009）。研究表明，糞鏈球菌和植物乳桿菌混合作為青貯添加劑，在青貯初期發(fā)酵中糞鏈球菌占優(yōu)勢，但當(dāng)pH降到5.0以下，優(yōu)勢被植物乳桿菌取代（劉晗璐等，2008）。乳酸片球菌是片球菌的一種，片球菌與植物乳桿菌組成青貯添加劑，可在一定程度上提高青貯飼料蛋白質(zhì)含量，降低粗纖維含量（崔棹茗等，2015；麥合木提·依馬木尼亞孜，2013）。凝結(jié)芽孢桿菌是乳酸菌的一種，屬于兼性厭氧菌，能分解糖類生成L型乳酸。Mark等（2011）研究證明，凝結(jié)芽孢桿菌在50℃、pH為5.0的條件下能夠利用戊糖-磷酸鹽途徑有效發(fā)酵分解木質(zhì)素等，但目前主要作為奶牛用微生物飼料添加劑提高奶牛產(chǎn)奶量并改善牛奶質(zhì)量（孫明日等，2013）。本研究以上述4種微生物中的任意三種混合而成的復(fù)合菌劑為研究對象，研究其作為青貯添加劑對全株玉米青貯品質(zhì)的影響，以期為改善全株玉米青貯品質(zhì)提供指導(dǎo)和依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料本試驗(yàn)共計(jì)選擇四個菌種，包括凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans，B）、植物乳桿菌（L. plantarum，L）、糞鏈球菌（S.faecalis，S）和乳酸片球菌（P.acidilactici，P），所有菌種均為市售；試驗(yàn)同時使用了麩皮和食鹽以及MRS培養(yǎng)基，均為市售；全株玉米，收獲于乳熟后期。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌、糞鏈球菌和乳酸片球菌4個菌種設(shè)置4種組合，即：BLS、BSP、BLP和LSP，每個組合以2種劑量添加，即50 mL/t和100 mL/t，對照組（CK）以蒸餾水代替復(fù)合微生物菌劑，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

將凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌、糞鏈球菌和乳酸片球菌分別活化后培養(yǎng)于MRS液體培養(yǎng)基上，10%接種量37℃培養(yǎng)48 h，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的組合以1∶1∶1比例于MRS培養(yǎng)基混合，混合菌劑菌落總數(shù)為9.9×109cfu/mL。

通過聯(lián)合收割機(jī)對乳熟后期玉米收獲并切碎，按麩皮10 kg/t和食鹽9 kg/t添加至全株玉米樣品中，混合均勻。準(zhǔn)備1.5 L發(fā)酵罐，按每罐1.5 kg全株玉米混合樣品制作青貯，處理組分別均勻添加復(fù)合菌劑75 μL和150 μL，對照組以蒸餾水代替復(fù)合菌劑，將添加物與全株玉米混勻后置于發(fā)酵罐中，壓實(shí)密封。

1.3樣品采集和指標(biāo)分析全株玉米青貯制作15 d后打開青貯罐，棄掉表層2 cm樣品，對樣品進(jìn)行感官評定（表1）。取20 g樣品，加入蒸餾水180 mL，攪拌浸提5 min，四層紗布過濾，濾液轉(zhuǎn)移到漏斗上用濾紙過濾，濾液用于pH、氨態(tài)氮和有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）的測定。另取樣品200 g左右于信封袋中，記錄其鮮重后置于鼓風(fēng)干燥箱中105℃殺青2 h、85℃烘至恒重，稱其干重，計(jì)算干物質(zhì)含量。

表1　青貯玉米感官評分標(biāo)準(zhǔn)

烘干至恒重的青貯樣品粉碎后進(jìn)行粗蛋白質(zhì)、淀粉、粗脂肪、粗灰分、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、中性洗滌不溶蛋白（NDIP）和黃曲霉毒素含量的分析。粗蛋白質(zhì)、氨態(tài)氮和中性洗滌不溶氮采用凱氏定氮法分析；淀粉含量采用蒽酮比色法測定（郭冬生和彭小蘭，2007）；粗脂肪采用索氏浸提法進(jìn)行分析；粗灰分采用國標(biāo)GB/T 6438-2007進(jìn)行測定；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量采用Van Soest方法進(jìn)行測定；黃曲霉毒素采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行分析。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析文中數(shù)據(jù)分析和圖表制作分別由IBM SPSS statistics 20.0和Microsoft Excel 2010完成，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。通過方差分析（Two-way ANOVA）對不同處理全株玉米青貯各項(xiàng)指標(biāo)在菌種組合和劑量及二者互作效應(yīng)的差異進(jìn)行分析，并用HSD對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行多重比較分析，并通過模糊隸屬函數(shù)法對各微生物組合和劑量處理進(jìn)行綜合評價。

隸屬函數(shù)計(jì)算公式為：

式中：X為全株玉米青貯某一指標(biāo)測定值；Xmax和Xmin分別表示某一指標(biāo)測定值內(nèi)的最大和最小值。一般而言，全株玉米青貯感官評分、干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、淀粉、粗脂肪和乳酸含量與其發(fā)酵品質(zhì)正相關(guān)，其隸屬函數(shù)運(yùn)用公式X'ij（μ）計(jì)算，而pH值及氨態(tài)氮、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、中性洗滌不溶氮、黃曲霉毒素、乙酸、丙酸、丁酸含量與其品質(zhì)負(fù)相關(guān)，故其隸屬函數(shù)運(yùn)用X'ij（反）計(jì)算，上述所有指標(biāo)的隸屬函數(shù)之和即可作為評價全株玉米青貯品質(zhì)評價的綜合指數(shù)，值越大，說明處理效果越好。

2　結(jié)果與分析

2.1不同處理全株玉米青貯的感官評價根據(jù)感官評定結(jié)果，復(fù)合微生物BLS組、LSP150 μL處理組的評分均高于15分，屬于1級優(yōu)良；其他微生物處理組評分均為11～15分，屬于2級尚好；而對照組總評分均為4分，屬于4級腐敗。黃曲霉毒素分析結(jié)果表明，無論是微生物組還是對照組均未超出國家標(biāo)準(zhǔn)（10 μg/kg）。

2.2不同處理全株玉米青貯營養(yǎng)成分和有機(jī)酸含量變化從表2可以看出，不同的菌種組合、劑量以及二者交互作用對全株玉米青貯干物質(zhì)、氨態(tài)氮、粗灰分含量均存在顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）的影響；粗蛋白質(zhì)含量在不同劑量處理之間存在顯著差異（P＜0.05）；粗脂肪和ADF含量在不同菌種組合之間存在顯著差異（P＜0.05）；而pH值和NDF、NDIP、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量在不同菌種組合、不同劑量及二者相互作用下的差異均未達(dá)顯著水平（P＞0.05）。

表2　菌種組合和劑量及二者交互效應(yīng)對全株玉米青貯相關(guān)指標(biāo)影響的方差分析結(jié)果

從表3可以看出：（1）不同處理全株玉米青貯的pH值均低于4.0，但各處理間差異均未達(dá)顯著水平；（2）復(fù)合菌劑組合處理干物質(zhì)含量表現(xiàn)出BLP＞LSP＞BLS＞BSP＞CK，其中BLP顯著高于CK，較CK提高了6.839%，不同劑量表現(xiàn)為150 μL處理組顯著高于75 μL處理組2.175%，在交互作用下，LSP150 μL組最高，而CK75 μL組最低，LSP150 μL組顯著高出CK75 μL組10.038%；（3）復(fù)合菌劑組合處理粗蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為BLP＞BLS＞BSP＞CK＞LSP，其中BLP組較LSP組提高了3.771%，達(dá)顯著水平，不同劑量表現(xiàn)為150 μL處理組顯著高于75 μL處理組2.863%，在組合與劑量交互作用下，BLP150 μL組（最高）顯著高于BSP75 μL組（最低）6.710%；（4）復(fù)合菌劑處理間氨態(tài)氮含量表現(xiàn)為BLS＞BSP＞LSP＞BLP＞CK，其中BLS組顯著高于BSP組，二者又顯著高于后三者，不同劑量表現(xiàn)為75 μL處理組顯著高于150 μL處理組10.609%，在交互作用下，BSP150 μL組顯著低于BLS150 μL組71.823%；（5）NDIP含量在微生物處理組間和劑量間均無顯著差異；（6）淀粉含量在各菌種組合間無顯著差異，但不同劑量處理間有顯著差異，表現(xiàn)為150 μL處理組顯著高于75 μL處理組8.386%，在交互作用下表現(xiàn)為BLP150 μL組顯著高于BSP75 μL組17.571%；（7）復(fù)合菌劑處理后粗脂肪含量變化表現(xiàn)為BLS＞BLP＞BSP＞LSP＞CK，其中BLS組和BLP組分別較CK組提高了22.761%和20.056%，達(dá)到顯著水平，但在劑量處理間無顯著差異，交互作用下，BLP75 μL組顯著高于CK150 μL組44.174%；（8）復(fù)合菌劑處理后粗灰分含量表現(xiàn)為CK＞BSP＞BLS＞BLP＞LSP，其中LSP組較CK組顯著降低了10.289%，劑量處理150μL組較75 μL組顯著降低了6.665%，交互作用下，LSP150 μL組較CK75 μL組顯著降低了21.403%。

表3　不同復(fù)合微生物菌劑和劑量處理后全株玉米青貯相關(guān)指標(biāo)和隸屬函數(shù)多重比較結(jié)果

2.3不同處理全株玉米青貯品質(zhì)的隸屬函數(shù)綜合分析由表2可知，根據(jù)試驗(yàn)中所測相關(guān)指標(biāo)計(jì)算的隸屬函數(shù)在不同復(fù)合菌劑處理和不同劑量處理間均存在極顯著差異（P＜0.01），但二者互作效應(yīng)未對其產(chǎn)生顯著影響。表3結(jié)果顯示，隸屬函數(shù)在復(fù)合菌劑處理間表現(xiàn)為BLP＞BLS＞LSP＞BSP＞CK，其中BLP組顯著高于CK組38.958%，且不同劑量間150 μL組顯著高于75 μL組15.606%，交互作用下，BLP150 μL組（最高）高于CK75 μL組（最低）66.818%。

3　討論與結(jié)論

4種復(fù)合微生物菌劑（BLS、BSP、BLP和LSP）處理全株玉米青貯與對照相比，在感官評價上具有較強(qiáng)的芳香味或酸香味，可以使莖葉結(jié)構(gòu)保持良好，在一定程度上提高了全株玉米青貯的適口性，同時具有較高的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和淀粉含量以及較低的灰分、NDF和ADF含量，在一定程度上減少了全株玉米青貯的營養(yǎng)損失，提高其可消化性。本試驗(yàn)結(jié)果與多數(shù)微生物菌劑可使青貯物料蛋白質(zhì)增加、粗纖維降低、養(yǎng)分損失減少、青貯質(zhì)量提高等研究結(jié)論基本一致（劉金偉等，2014；麥合木提·依馬木尼亞孜，2013）。

與不添加復(fù)合微生物菌劑的對照組相比，復(fù)合微生物菌劑處理的全株玉米青貯各有機(jī)酸含量雖有一定的增加和減少，但差異均未達(dá)顯著水平，這與各處理間pH無顯著差異相吻合，與郭金雙和孔祥浩（1997）報道相一致。這可能主要是由于全株玉米富含碳水化合物，可為其自身附著的乳酸菌或者外源添加的微生物菌劑提供充足的底物，導(dǎo)致無論是處理組還是對照組均可產(chǎn)酸到一個相似的水平。但根據(jù)相關(guān)研究，微生物菌劑處理具有更高含量的產(chǎn)酸菌，故其pH下降的速度應(yīng)該較快（張?jiān)鲂篮蜕蹪?006），這還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。同時結(jié)果還顯示，復(fù)合微生物處理組雖在一定程度上增加了乳酸在總有機(jī)酸中所占比例而減少了乙酸、丙酸和丁酸所占比例，但差異未達(dá)顯著水平。

通過隸屬函數(shù)法對各處理進(jìn)行綜合評價表明，復(fù)合微生物菌劑以BLP即凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌和乳酸片球菌組合為最佳，其劑量以150 μL/1.5 kg即100 mL/t為佳。這與劉晗璐等（2008）報道的“球菌+桿菌”組合對試驗(yàn)?zāi)敛萸噘A品質(zhì)改善效果最優(yōu)的結(jié)果基本一致，只是其中添加了另外一種微生物菌劑——凝結(jié)芽孢桿菌。由于目前鮮有凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于青貯添加劑領(lǐng)域的報道，故其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Four kinds of microbial additives，including Bacillus coagulans（B），Lactobacillus plantarum（L），Streptococcus faecalis（S）and Pediococcusacidilactici（P），are belong to the homofermentative lactic bacteria.In order to explore their combination application effect，4 compound microbial additives（BLS，BSP，BLP and LSP）were used to make wholecrop corn silage as treatments，and each treatment had two doses（50 mL/t and 100 mL/t），while the control was sprayed with equal distilled water.The results showed that：（1）In the sensory evaluation of whole-crop corn silage，compound microbial treatments was superior to the controls.（2）Compared with the control，compound microbial treatments had higher dry matter，crude protein and starch content and lower ash，NDF and ADF content，which indicated that compound microbial treatments reduced the nutrient loss of corn silage.（3）Compound microbial treatments increased the lactic acid proportion in the total organic acids and reduced the proportion of acetic acid，propionic acid and butyric acid，but the difference wasn’t significant.（4）A comprehensive comparison was conducted through the subordinate function analysis，and the results showd that BLP comprised of Bacillus coagulans，Lactobacillus plantarum，and Pediococcusacidilactici was the best combination of the 4 compound microbial additives，and its dose of 100 mL/t was better than 50 mL/t.

Bacillus coagulans；Lactobacillus plantarum；Streptococcus faecalis；Pediococcusacidilacticii；whole-crop corn；silage quality

S816.7

A

1004-3314（2016）12-0022-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161206

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZCZDNC00800）