液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定動(dòng)物組織中克百威及其代謝產(chǎn)物殘留量

楊挺++呂燕++陳國(guó)++吳銀良

摘 要：建立快速測(cè)定動(dòng)物組織中克百威及其代謝產(chǎn)物三羥基克百威殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析方法。動(dòng)物組織樣品中殘留物利用乙腈提取，提取后溶液經(jīng)N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和C18材料凈化，凈化后的提取液經(jīng)氮吹后用0.1%甲酸溶液-乙腈（50∶50，V/V）溶解，進(jìn)行LC-MS/MS分析。采用Acquity BEH C18色譜柱分離，用0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧正離子（ESI+）模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量?？税偻腿u基克百威分別在0.05～25.0 μg/L和0.25～50.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999；在動(dòng)物組織（豬肉和牛肉）中克百威和三羥基克百威的方法檢測(cè)限分別為0.10 μg/kg和0.50 μg/kg，定量限分別為0.25 μg/kg和1.0 μg/kg。添加范圍為0.25～10 μg/kg時(shí)，平均回收率在95.7%～107.0%之間，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在3.2%～5.9%之間，批間RSD在4.5%～6.6%之間。該方法能滿足動(dòng)物肉組織中克百威及其代謝產(chǎn)物殘留量快速分析的要求。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物組織；克百威；三羥基克百威；快速測(cè)定；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；殘留量

Fast Determination of Residues of Carbofuran and Its Metabolite in Animal Tissues by Liquid Chromatography

with Tandem Mass Spectrometry

YANG Ting， L? Yan， CHEN Guo， WU Yinliang*

（The Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China）

Abstract： A method for determining residues of carbofuran and its metabolite 3-hydroxycarbofuran in animal tissues was developed by liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Samples were extracted with acetonitrile. Then the extract was purified by dispersive solid phase extraction method using PSA and C18 as sorbents. After purification， the extract was dried under nitrogen stream and the residue was dissolved in 0.1% formic acid solution/acetonitrile mixture （50/50， V/V）

and filtered through a 0.22 ?m filter and 10 ?L of the filtrate was injected into the LC system for analysis. The analysis was performed on an Acquity BEH C18 column with a mixture of 0.1% formic acid solution and acetonitrile as the mobile phase under gradient elution conditions. The mass spectrometer was operated in multiple reaction monitoring （MRM） mode with positive ion electrospray ionization （ESI）. The analytes were quantified with the isotope internal standard dilution method. Good linearity was obtained for carbofuran and 3-hydroxycarbofuran in the concentration range of 0.05–25.0 and

0.25–50.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.999， respectively. The recoveries in animal tissues （pork and beef） were 95.7%–107.0% at fortified levels of 0.25–10 μg/kg with limits of detection of 0.10 and 0.50 μg/kg and limits of quantitation of 0.25 and 1.0 μg/kg for carbofuran and 3-hydroxycarbofuran， respectively. The relative standard deviations of intra- and inter-batch assays were between 3.2% and 5.9%， and between 4.5% and 6.6%， respectively. The method was demonstrated to be suitable for the fast determination of residues of carbofuran and its metabolite 3-hydroxycarbofuran in animal tissues.

Key words： animal tissues； carbofuran； 3-hydroxycarbofuran； fast determination； liquid chromatography with tandem mass spectrometry； residue

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.09.005

中圖分類號(hào)：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2016）09-0023-06

引文格式：

楊挺， 呂燕， 陳國(guó)， 等. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定動(dòng)物組織中克百威及其代謝產(chǎn)物殘留量[J]. 肉類研究， 2016， 30（9）： 23-28. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.09.005. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

YANG Ting， L? Yan， CHEN Guo， et al. Fast determination of residues of carbofuran and its metabolite in animal tissues by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2016， 30（9）： 23-28. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.09.005. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

克百威，又名呋喃丹，是一種高效、高毒的氨基甲酸酯類殺蟲劑，具有觸殺、胃毒和內(nèi)吸作用，并且兼有殺蟲、殺螨和殺線蟲的生物活性，對(duì)多種害蟲有效，其毒理機(jī)理是抑制膽堿酯酶活性，且與之結(jié)合不可逆，因此對(duì)人、畜具有高毒性。克百威的主要代謝產(chǎn)物為3-羥基克百威。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告附錄4規(guī)定克百威為禁止在動(dòng)物中使用的藥物，同時(shí)在動(dòng)物性食品中不得檢出。因此研究和建立動(dòng)物組織中克百威及其代謝產(chǎn)物的殘留量分析方法對(duì)保障動(dòng)物性食品安全具有重要意義。

目前，對(duì)包括克百威在內(nèi)的氨基甲酸酯類殺蟲劑殘留的分析方法較多，主要有酶聯(lián)免疫吸附法[1-3]、液相色譜法[4-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12-14]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[15-20]等；然而其中動(dòng)物性食品中的氨基甲酸酯類殺蟲劑分析分方法相對(duì)較少，且較多方法并未同時(shí)測(cè)定克百威的代謝產(chǎn)物3-羥基克百威[11-15]，導(dǎo)致這些方法在實(shí)際使用中受到限制；同時(shí)較多方法采用較為繁瑣的固相萃取方法凈化，難以滿足克百威及其代謝產(chǎn)物快速分析的需要。本實(shí)驗(yàn)考慮到克百威及代謝產(chǎn)物的化學(xué)特性，建立了快速提取和凈化的前處理步驟，該方法的建立能充分滿足動(dòng)物性食品安全實(shí)際監(jiān)管中測(cè)定克百威殘留量的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空白豬肉和牛肉樣品 寧波市江東區(qū)歐尚超市；克百威（100 mg/L）、3-羥基克百威（100 mg/L） 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；克百威-D3（100 mg/L） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色譜純） 美國(guó)默克公司；

甲酸（色譜純） 美國(guó)天地有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18 美國(guó)Agilent公司；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Waters公司；SIGMA3K15離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液

用流動(dòng)相稀釋100 mg/L克百威、3-羥基克百威和克百威-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，克百威和3-羥基克百威混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為0.25、0.50、2.5、10、25 μg/L，同時(shí)配制克百威和3-羥基克百威質(zhì)量濃度分別為0.05 μg/L和50 μg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)工作液，所有上述標(biāo)準(zhǔn)工作液中內(nèi)標(biāo)（克百威-D3）質(zhì)量濃度均為10 μg/L。

1.3.1.2 添加用標(biāo)準(zhǔn)工作液

用乙腈稀釋100 mg/L克百威、3-羥基克百威和克百威-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，得質(zhì)量濃度分別為10、40、400 μg/L的克百威標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度分別為40、100、400 μg/L的3-羥基克百威標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度為400 μg/L的克百威-D3標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g動(dòng)物組織樣品于帶蓋的50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入5 mL乙腈，高速均質(zhì)1 min后5 000 r/min離心2 min，吸取上層溶液于另一50 mL聚四氟乙烯離心管中，再加入5 mL乙腈重復(fù)提取1 次，合并提取液，混勻后吸取2 mL提取液于已加有50 mg PSA和50 mg C18材料的10 mL聚四氟乙烯離心管中，旋渦混合30 s，5 000 r/min

離心2 min，取上清液1.0 mL于40 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑?.25 mL 0.10 %甲酸水-乙腈（50∶50，V/V）溶解，過0.22 ?m濾膜后供LC-MS/MS分析。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×

2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A相：0.1%甲酸溶液，B相：乙腈；梯度洗脫條件：B相在0.5 min內(nèi)保持50%，然后在2.5 min內(nèi)線性增加到90%，保持0.5 min，然后在0.1 min內(nèi)降至10%，保持0.9 min；流速0.30 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

ESI源正離子模式電離；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細(xì)管電壓：2.0 kV；萃取錐孔電壓：20 V；RF透鏡電壓：0.5 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：1 000 L/h；倍增器電壓：650 V；二級(jí)碰撞氣：氬氣；其他條件詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的建立

由于克百威和3-羥基克百威化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酰氨基，容易得到H+而形成較為穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子，因此目前所建立的LC-MS/MS分析方法均采用ESI+模式對(duì)克百威和3-羥基克百威進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本研究采用“T”三通方式，利用IntelliStart軟件獲得克百威、克百威-D3及

3-羥基克百威的離子對(duì)以及錐孔電壓等質(zhì)譜分析參數(shù)，并經(jīng)優(yōu)化后得到1.3.3節(jié)中的質(zhì)譜參數(shù)。

利用LC分析克百威及3-羥基克百威時(shí)，當(dāng)分別采用0.1%甲酸溶液-乙腈和0.1%甲酸溶液-甲醇進(jìn)行梯度洗脫分析兩者時(shí)，2 種溶液作為流動(dòng)相對(duì)兩者的響應(yīng)差異較小，靈敏度差異也較小，而本研究考慮到0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)同樣梯度條件下出峰時(shí)間更快，采用0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相對(duì)克百威及3-羥基克百威進(jìn)行分析。利用上述色譜和質(zhì)譜條件獲得的圖譜詳見圖1。

a1～6. 標(biāo)準(zhǔn)溶液；b1～6. 牛肉空白樣品；c1～6. 牛肉添加樣品。

圖 1 0.50 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度10 μg/L）、牛肉空白樣品和牛肉添加樣品（1.0 μg/kg）色譜圖

Fig. 1 Chromatograms of carbofuran and its metabolite in standard solution （0.50 μg/L； 10.0 μg/L internal standard solution）， blank beef and fortified beef sample （1.0 μg/kg）

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

在已建立的LC及LC-MS/MS分析氨基甲酸酯類殺蟲劑分析中，通常采用乙腈進(jìn)行提取，然后凈化采用固相萃取[15]、凝膠滲透[19]或QuEChERS方法[20]進(jìn)行，其中QuEChERS方法具有快速、方便和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，本研究針對(duì)克百威及其代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)，嘗試建立利用乙腈提取和QuEChERS凈化的前處理方法。然而在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)用5 mL乙腈對(duì)2 g樣品中殘留物僅提取一次時(shí)克百威及其代謝物的提取回收率小于40%，該情況下經(jīng)后續(xù)凈化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3-羥基克百威的定量限無法達(dá)到1.0 μg/kg；因此為提高提取回收率，方法采用10 mL乙腈均分2 次對(duì)樣品中的殘留物進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者的提取回收率均高于85%，且3-羥基克百威的定量限能達(dá)到1.0 μg/kg。在空白樣品提取液中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后，未經(jīng)QuEChERS方法凈化直接進(jìn)行吹干復(fù)溶進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)克百威及其代謝物均有一定的基質(zhì)抑制，但分別經(jīng)25 mg PSA/50 mg C18、50 mg PSA/50 mg C18、100 mg PSA/50 mg C18和200 mg PSA/50 mg C18凈化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PSA用量達(dá)到50 mg及以上時(shí)，2 個(gè)化合物的基質(zhì)抑制效應(yīng)均得到了明顯改善，因此本研究中采用50mg PSA和50 mg C18進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；同時(shí)從圖1b和圖1c中可見，本實(shí)驗(yàn)建立的前處理方法對(duì)2 種化合物無雜峰干擾，且峰形較好。

2.3 線性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.1.1節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對(duì)克百威在0.05～25 μg/L和3-羥基克百威在0.25～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)以待測(cè)物定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)離子對(duì)峰面積比值對(duì)質(zhì)量濃度作圖，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=0.096 7x+0.004 3（克百威）和y=0.014 6x+0.001 2（3-羥基克百威），相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.999 8（克百威）和0.999 5（3-羥基克百威），說明本方法適用于克百威及其代謝物殘留量的定量分析。

2.4 回收率、精密度和檢出限

取空白牛肉和豬肉樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成含有克百威0.25、1.0、10 μg/kg及3-羥基克百威1.0、2.5、10 μg/kg的加標(biāo)樣品，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行操作，每個(gè)添加水平重復(fù)3 次，每次每個(gè)添加量5 個(gè)加標(biāo)樣品進(jìn)行定量分析，結(jié)果詳見表1。

由表1可知，各添加量點(diǎn)平均添加回收率在95.7%～107.0%之間。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.2%～5.9%，批間RSD為4.5%～6.6%，可見該方法能滿足現(xiàn)行藥物殘留分析的要求。本實(shí)驗(yàn)選擇添加實(shí)驗(yàn)中響應(yīng)最低樣品的信噪比（RS/N），并按RS/N=3計(jì)算克百威和3-羥基克百威的檢出限，結(jié)果分別為0.10 μg/kg和0.50 μg/kg；按RS/N=10計(jì)算定量限，克百威和3-羥基克百威分別為0.25 μg/kg和1.0 μg/kg。

2.5 方法應(yīng)用

利用該方法在2015年底對(duì)寧波市江東區(qū)大型超市所售的20 個(gè)豬肉和牛肉樣品進(jìn)行了克百威及其代謝產(chǎn)物殘留量測(cè)定，所有樣品均未檢出。

3 結(jié) 論

本研究建立了快速測(cè)定動(dòng)物組織中克百威及其代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS方法，樣品從稱樣到分析完成整個(gè)過程約需要25 min。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明，方法具有較好的靈敏度，克百威和3-羥基克百威在動(dòng)物肉組織中的方法檢測(cè)限分別能達(dá)到0.10 μg/kg和0.50 μg/kg，定量限分別能達(dá)到0.25 μg/kg和1.0 μg/kg；同時(shí)方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，添加回收率能達(dá)到90%～110%，批內(nèi)RSD和批間RSD均小于10%?？傊摲椒ň哂锌焖?、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可滿足實(shí)際監(jiān)控中測(cè)定克百威殘留含量的需要。

參考文獻(xiàn)：

[1] KATSOUDAS E， ABDELMESSEH H H. Enzyme inhibition and enzyme-linked immunosorbent assay methods for carbamate pesticide residue analysis in fresh produce[J]. Journal of Food Protection， 2000， 63（12）： 1758-1760.

[2] ABAD A， MORENO M J， MONTOYA A. Hapten synthesis and production of monoclonal antibodies to the N-methylcarbamate pesticide methiocarb[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1998， 46（6）： 2417-2426.

[3] 朱國(guó)念， 楊挺， 吳銀良， 等. 抗克百威多克隆抗體的研制[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2002， 35（8）： 1025-1029. DOI：10.3321/j.issn：0578-1752.2002.08.025.

[4] JIN T， LI F， CHENG J， et al. Polymer monolithic column containing embedded graphene oxide sheets for sensitive determination of carbamate insecticides by HPLC[J]. Mikrochimica Acta， 2016， 183（2）： 543-551.

[5] FERNANDEZ-RAMOS C， SATINSKY D， SOLICH P. New method for the determination of carbamate and pyrethroid insecticides in water samples using on-line SPE fused core column chromatography[J]. Talanta， 2014， 129： 579-585.

[6] ZHOU S， CHEN H， WU B. Sensitive determination of carbamates in fruit and vegetables by a combination of solid-phase extraction and dispersive liquid-liquid microextraction prior to HPLC[J]. Mikrochimica Acta， 2012， 176（3/4）： 419-427.

[7] SUN M， MA X， WANG J， et al. Graphene grafted silica-coated Fe3O4 nanocomposite as absorbent for enrichment of carbamates from cucumbers and pears prior to HPLC[J]. Journal of Separation Science， 2013， 36（8）： 1478-1485.

[8] WU C C， CHU C， WANG Y S， et al. Multiresidue method for high-performance liquid chromatography determination of carbamate pesticides residues in tea samples[J]. Journal of Environmental Science and Health， Part B， 2009， 44（1）： 58-68.

[9] WANG S T， MU H， BAI Y H， et al. Multiresidue determination of fluoroquinolones， organophosphorus and N-methyl carbamates simultaneously in porcine tissue using MSPD and HPLC-DAD[J]. Journal of Chromatography B， 2009， 877（27）： 2961-2966.

[10] 王艷， 葉一， 方曉燕， 等. 高效液相色譜柱后衍生化法檢測(cè)蔬菜中涕滅威和克百威殘留的方法研究[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理， 2009， 30（9）： 37-40. DOI：10.3969/j.issn.1002-5480.2009.09.014.

[11] 洪波， 萬譯文， 劉伶俐， 等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中氨基甲酸酯類的殘留[J]. 食品與機(jī)械， 2012， 28（6）： 93-95. DOI：10.3969/j.issn.1003-5788.2012.06.022.

[12] 王建， 林秋萍， 雷鄭莉， 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中有機(jī)磷殺蟲劑和克百威的殘留量[J]. 分析試驗(yàn)室， 2002， 21（2）： 27-30. DOI：10.3969/j.issn.1000-0720.2002.02.009.

[13] 蘇明明， 張旭東， 那晗， 等. 凝膠滲透色譜-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速測(cè)定大豆中克百威、乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、氟樂靈的殘留量[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)， 2012， 33（1）： 37-41.

[14] 羅俊凱， 龔道新， 丁春霞， 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定煙葉和土壤中丁硫克百威及其代謝產(chǎn)物的殘留[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 16（1）： 66-71. DOI：10.3969/j.issn.1008-7303.2014.01.11.

[15] 田宏哲， 趙瑛博， 周艷明， 等. 高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中6 種氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留[J]. 食品科學(xué)， 2011， 32（2）： 187-190.

[16] MORENO-GONZALEZ D， HUERTAS-PEREZ J F， GARCIA-CAMPAA A M， et al. Determination of carbamates in edible vegetable oils by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a new clean-up based on zirconia for QuEChERS methodology[J]. The International Journal of Pure and Applied Analytical Chemistry， 2014， 128： 299-304.

[17] 陳笑梅， 胡貝貞， 劉海山， 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定糧谷中9 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留[J]. 分析化學(xué)， 2007， 35（1）： 106-110. DOI：10.3321/j.issn：0253-3820.2007.01.022.

[18] 趙穎， 蔣施， 金雁， 等. 食用菌中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定研究[J]. 化學(xué)通報(bào)， 2012， 75（2）： 150-154.

[19] 蔣施， 潘偉， 趙穎， 等. 蔬菜和食用菌中多種氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的UPLC-MS/MS的確證方法[J]. 分析測(cè)試技術(shù)與儀器， 2010， 16（3）： 185-190. DOI：10.3969/j.issn.1006-3757.2010.03.011.

[20] ZHANG J M， WU Y L， L? Y B. Simultaneous determination of carbamate insecticides and mycotoxins in cereals by reversed phase liquid chromatography tandem mass spectrometry using a quick， easy， cheap， effective， rugged and safe extraction procedure[J]. Journal of Chromatography B， 2013， 915： 13-20.