高效液相色譜法測定止咳化痰顆粒中苦杏仁苷含量

劉彬果，張楠

（中國人民解放軍第二五四醫(yī)院，天津300142）

高效液相色譜法測定止咳化痰顆粒中苦杏仁苷含量

劉彬果，張楠

（中國人民解放軍第二五四醫(yī)院，天津300142）

目的建立測定止咳化痰顆粒中苦杏仁苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱采用ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相為甲醇-0.1%磷酸（30∶70），流速1.0 mL/min，柱溫室溫，檢測波長210 nm。結(jié)果苦杏仁苷進(jìn)樣量在0.4～4.0 g（r=0.999 7）范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為101.38%，RSD為1.90%（n=6）。結(jié)論該法快速、簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，結(jié)果可靠，可用于止咳化痰顆粒中苦杏仁苷的含量測定，可全面控制止咳化痰顆粒的質(zhì)量。

止咳化痰顆粒；苦杏仁苷；高效液相色譜法；含量測定

止咳化痰顆粒為中國人民解放軍第二五四醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，是由瓜蔞、前胡、苦杏仁、白茅根等8味藥材組方的復(fù)方制劑，具有止咳化痰的功效，適用于急、慢性支氣管炎，咳嗽多痰。方中苦杏仁味苦性溫，宣肺下氣，止咳平喘，為方中主藥藥味之一［1-2］?？嘈尤受帐强嘈尤手械挠行С煞?，關(guān)于其含量測定方法已有相關(guān)報道［3-4］，該制劑現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有中藥定性鑒別的方法，而無主要藥味的含量測定方法。為了更好地控制止咳化痰顆粒的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對方中苦杏仁的指標(biāo)成分苦杏仁苷進(jìn)行定量研究和方法學(xué)驗證試驗，以建立控制止咳化痰顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），OpenLAB CDS色譜工作站。

1.2試藥

苦杏仁苷對照品（批號為120821-201212）購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；止咳化痰顆粒由本院制劑室提供。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：ZORBAXSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（30∶70）；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：210 nm，進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計算不低于3 000。

2.2溶液制備

對照品溶液：精密稱取苦杏仁苷對照品10.22 mg（純度為98.0%），置25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得每1 mL含0.400 6 mg的對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液10 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含0.080 1 mg的對照品溶液。

供試品溶液：取止咳化痰顆粒，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方組成的比例，制備不含苦杏仁藥材的陰性樣品。按供試品溶液制備方法，制備不含苦杏仁藥材的陰性對照品溶液。

2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1?？梢?，供試品溶液和對照品溶液色譜具有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照品溶液卻無此色譜峰，表明樣品中的其他成分對苦杏仁苷的測定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別吸取對照品溶液1，2，4，5，6，8，10 μL，依次進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=963.13 X+4.674 8，r=0.999 7（n=7）。結(jié)果表明，苦杏仁苷進(jìn)樣量在0.4～4.0 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。見表1。

表1　苦杏仁苷線性試驗結(jié)果（n=7）

精密度試驗：精密吸取苦杏仁苷的同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積。結(jié)果峰面積值分別為756.0，757.4，755.7，755.1，754.7，754.6，RSD為1.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批供試品（批號為14490137）溶液，分別于0，1，2，3，4，5，9，12，24 h時測定。結(jié)果峰面積的RSD為3.95%（n=9），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

表2　苦杏仁苷穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n=9）

重復(fù)性試驗：取同一批樣品（批號為14490137）6份，按供試品溶液制備方法項下制備溶液，依法測定，記錄色譜圖。結(jié)果苦杏仁苷的平均含量為1.93 mg/g，RSD為0.90%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。見表3。

表3　苦杏仁苷重復(fù)性試驗結(jié)果（n=6）

加樣回收試驗：稱取已知含量的樣品（批號為14260115）約0.3 g，精密稱定6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入苦杏仁苷對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.400 6 g/L）各2.0 mL，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，甲醇超聲提取40 min，（功率250 W，頻率40 kHz）。放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。依擬訂色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果見表4。

2.4樣品含量測定

取樣品（批號為14260115，14490137，15160115）按供試品溶液制備方法項下制備，依法測定，記錄色譜圖。結(jié)果見表5。

3　討論

3.1指標(biāo)成分選擇

止咳化痰顆粒為臨床應(yīng)用多年，療效確切，其方中藥材品種較多，化學(xué)成分復(fù)雜?？嘈尤市詼?，宣肺下氣，止咳平喘［1，10］，為方中主藥之一?？嘈尤受帐强嘈尤实闹饕钚猿煞郑枯^高，性質(zhì)穩(wěn)定，但口服在酶的作用下，分解會生成苯甲醛和氫氰酸，而氫氰酸大量攝入會出現(xiàn)中毒［5-6］。為了有效控制制劑質(zhì)量，確保臨床用藥的安全有效，本試驗中采用HPLC法，選取苦杏仁苷為指標(biāo)成分，測定止咳化痰顆粒的含量。

表4　苦杏仁苷加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

表5　3批樣品中苦杏仁苷含量測定結(jié)果（mg/g）

3.2測定波長選擇

參考藥典［10］和文獻(xiàn)［7-8］，對止咳化痰顆粒中苦杏仁苷的含量測定色譜條件進(jìn)行了考察。經(jīng)過對苦杏仁苷對照品溶液的紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)其在210 nm波長處有較好的吸收，故選擇210 nm為檢測波長。

3.3提取條件選擇

采用甲醇超聲提取和加熱回流提取的方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，兩種提取方法含量相近。由于超聲提取方法簡單，便于操作，因而采用超聲提取的方法。同時，對提取時間30 min，40 min進(jìn)行比較，隨著超聲時間時間延長，含量會加大。經(jīng)試驗超聲提取40 min，可達(dá)到提取完全的目的，故選用超聲提取40 min。

3.4流動相選擇

參考藥典［10］及文獻(xiàn)［7-9］，曾考察不同流動相，分別為乙腈-0.1%磷酸溶液（9∶91）、甲醇-0.1%磷酸溶液（30∶70）和甲醇-水（20∶80）。結(jié)果顯示，流動相為甲醇-0.1%磷酸（30∶70）、流速為1 mL/min、檢測波長為210 nm時，苦杏仁苷峰達(dá)到很好分離，峰形較好。

綜上所述，本方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，空白無干擾，可作為止咳化痰顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定的方法。

［1］游潔.杏仁的研究概況［J］.中國醫(yī)藥指南，2014，12（33）：57-58.

［2］許寧俠.苦杏仁苷的研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2012，31（9）：66-67.

［3］茍小軍，黃強(qiáng).HPLC法測定哮喘顆粒中苦杏仁苷的含量［J］.實(shí)用藥物與臨床，2014，17（12）：1 594-1 595.

［4］蔣玉芳，陳宗良，吳立成.HPLC法測定前列安通膠囊中苦杏仁苷的含量［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（1）：215-216.

［5］常軍.HPLC法檢測苦杏仁苷及其酶解產(chǎn)物［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，12（25）：1 085-1 088.

［6］周政政，郭永輝.苦杏仁苷純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制和純度標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度分析方法研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，32（4）：504-510.

［7］王倩.HPLC法測定小兒肺熱咳喘口服液中苦杏仁苷的含量［J］.臨床合理用藥，2015，8（8）：37-39.

［8］王鼎峰，胡冰.HPLC法測定宮瘤清片中苦杏仁苷、黃芩苷的含量［J］.海峽藥學(xué)，2014，26（5）：40-43.

［9］李月亭，陳凌云，魏丹霞，等.HPLC法測定清熱潤燥口服液中苦杏仁苷的含量［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2015，12（5）：69-71.

［10］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：201-202.

Content Determination of Amygdalin in Zhike Huatan Granules by HPLC

Liu Binguo，Zhang Nan
（PLA No.254 Hospital，Tianjin，China300142）

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of the amygdalin content in Zhike Huatan Granules.Methods Amygdalin was determined by HPLC with ZORBAX SB-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobile phrase was composed of methanol-1%phosphoric acid water（30∶70），the flow rate was 1 mL/min and detection wave length was 210 nm and the column temperature was room temperature.ResultsThe linear range of amygdalin was 0.4-4.0 μg（r=0.999 7）.The average recovery was 101.38%，RSD 1.90%（n=6）.ConclusionThis method is fast，simple，accurate，well reproducible，and reliable，which is suitable for the content determination of amygdalin in Zhike Huatan Granules and its quality control.

Zhike Huatan Granules；amygdalin；HPLC；content determination

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2016）15-0068-03

中國人民解放軍總后勤部專項課題，項目編號：14ZJZ01。

劉彬果，博士研究生，主管藥師，研究方向為藥物分析學(xué)，（電子信箱）lbg991227@163.com。

（2016-02-20；

2016-04-08）