中藥川芎心肌缺血保護作用的譜效學(xué)研究

劉旭，程艷芹，崔曉博，李明春

（中國人民解放軍第401醫(yī)院藥劑科，山東青島266071）

中藥川芎心肌缺血保護作用的譜效學(xué)研究

劉旭，程艷芹，崔曉博，李明春

（中國人民解放軍第401醫(yī)院藥劑科，山東青島266071）

目的以大鼠心肌缺血模型為對象，研究中藥川芎對大鼠心肌缺血保護作用譜效關(guān)系及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法建立中藥川芎液相指紋圖譜分析方法，以結(jié)扎大鼠冠狀動脈致急性心肌缺血模型，運用多元回歸分析、雙變量相關(guān)分析，將川芎提取物藥效數(shù)據(jù)與指紋圖譜的共有峰的相對峰面積相關(guān)聯(lián)，分析藥物治療心肌缺血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和譜效關(guān)系。結(jié)果藁苯內(nèi)酯、川芎內(nèi)酯、阿魏酸、川芎嗪均與藥效呈顯著正相關(guān)，其中阿魏酸、川芎嗪可顯著降低血清中丙二醛（MDA）等的升高，可顯著升高血清超氧化物歧化酶（SOD）活力，均為中藥川芎治療心肌缺血的主要有效成分。結(jié)論通過譜效關(guān)系研究獲得了藥效活性物質(zhì)，建立了川芎藥材譜效關(guān)系評價的方法，客觀反映了藥物內(nèi)在質(zhì)量，為該類中藥的創(chuàng)新研究提供了借鑒。

川芎；指紋圖譜；譜效關(guān)系；阿魏酸；川芎嗪

川芎為傘形科植物川芎Ligusticum Chuanxiong Hort.的干燥根莖，性溫，味辛，具有祛風(fēng)止痛、活血行氣的功效，對心肌缺血損傷有保護作用，含有生物堿、酚類、內(nèi)酯類、揮發(fā)油、有機酸等多種成分［1］。川芎成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)難以確定，采用能表征中藥信息的指紋圖譜分析，以及藥物活性物質(zhì)與指紋圖譜的譜效模型，可客觀體現(xiàn)中藥川芎的總體質(zhì)量水平［2-3］。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法建立了川芎藥材的指紋圖譜，運用大鼠心肌缺血模型，從血清酶學(xué)范疇研究指紋圖譜，對其藥效物質(zhì)進行評價篩選；通過統(tǒng)計學(xué)方法，將活性成分特征峰的指紋圖譜與藥效結(jié)果相對應(yīng)，通過建立譜效相關(guān)性研究模型，客觀反映了中藥川芎的內(nèi)在質(zhì)量，為該類中藥的質(zhì)量控制和藥效評價提供了依據(jù)［4-5］。

1　儀器、試藥與動物

1.1儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（包括四元泵，1100色譜工作站，Agilent公司）；SC-M5型麻醉呼吸機（上海醫(yī)療儀器廠）；LD5-2A型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。1.2試藥

川芎藥材由山東大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室范培紅副教授鑒定確認。對照品阿魏酸（批號為905-201115，純度為99.0%），川芎嗪（批號為0803-201112，純度為99.0%），藁苯內(nèi)酯（批號為0708-201110，純度為99.0%），川芎內(nèi)酯A（批號為1006-201201，純度為99.0%），均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈（色譜純，Merck KGaA公司，64271 Darmstadt）。復(fù)方丹參滴丸（天津天士力制藥股份有限公司，批號131020）。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為20130825），丙二醛（MDA）試劑盒（批號為20130810），以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3動物

健康SD大鼠（Rattus norvegicus），30只，雌雄兼?zhèn)?，體重310～350 g，購自青島市藥檢所實驗動物中心，實驗動物合格證號碼為2013A030。飼養(yǎng)條件：溫度24℃，相對濕度50%，保持通風(fēng)。

2　方法與結(jié)果

2.1指紋圖譜的建立

2.1.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-1%冰乙酸水溶液（B），梯度洗脫，10 min（10∶90）→20 min（20∶80）→30 min（30∶70）→60 min（30∶70）；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：322 nm；靈敏度：0.1 AUFS。擬訂色譜條件下，川芎中阿魏酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、川芎內(nèi)酯A均達到基線分離，與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，拖尾因子均在0.90～1.10。理論板數(shù)按川芎嗪、阿魏酸峰計算不低于4 500，峰對稱因子符合《中國藥典（一部）》要求。色譜圖見圖1。

2.1.2溶液制備

供試品溶液：精密稱取川芎藥材粗粉（過40目篩）約100 mg，精密稱定，置10 mL棕色量瓶中，精密加入0.1 mL冰醋酸后，加入90%甲醇稀釋至刻度，經(jīng)預(yù)實驗篩選實驗條件，超聲處理18 min，微孔濾膜（0.45 μm）過濾，濾取澄清液，得供試品溶液。

圖1　高效液相色譜圖

對照品溶液：精密稱取各對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加入90%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3指紋圖譜測定

精密稱取供試品溶液20 μL，注入HPLC儀，記錄60 min色譜圖。川芎嗪是該藥物中含量較多且最穩(wěn)定的峰，故選擇川芎嗪為參照峰（S），以其保留時間和色譜峰峰面積積分值為1，計算其他峰的保留時間和峰面積積分值與基準(zhǔn)峰的保留時間和峰面積積分值之比。

2.1.4方法學(xué)考察

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，2 h內(nèi)重復(fù)進樣5次，測定HPLC色譜圖。結(jié)果各共有峰相對峰面積的RSD均小于1.00%（n=5），相對保留時間的RSD均小于0.80%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取川芎供試品溶液，分別放置0，2，4，6，8 h時測定。結(jié)果峰面積的RSD均小于1.50%（n=5），相對保留時間的RSD均小于0.90%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：平行取同一供試品5份，1 d內(nèi)測定HPLC色譜圖。結(jié)果各共有峰相對峰面積的RSD均小于1.00%，相對保留時間的RSD均小于0.85%（n=5），表明方法重復(fù)性好。

2.1.5指紋圖譜

依法測得10批藥物的指紋圖譜，在相同的保留時間有峰出現(xiàn)，川芎內(nèi)酯A的保留時間為8.45 min，藁本內(nèi)酯為15.01 min，川芎嗪為19.56 min，阿魏酸為25.79 min。在擬訂色譜條件下檢測，指紋圖譜見圖2。選擇指紋圖譜中包括上述4個色譜峰在內(nèi)的6個峰作為考察指標(biāo)，其相對保留時間的RSD為0.60%～0.90%，相對峰面積積分值比值的RSD為1.00%～2.65%。

圖2　川芎提取物指紋圖譜

2.2對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護作用

2.2.1建模

將SD大鼠隨機分為6組，每組8只，即模型組、假手術(shù)組、川芎提取物組（50 mg/kg，A1組）、川芎提取物組（100 mg/kg，A2組）、川芎提取物組（200 mg/kg，A3組）、陽性對照組（復(fù)方丹參滴丸50 mg/kg）。各組均灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，其中假手術(shù)組和模型組給予等劑量的生理鹽水，在7 d灌胃后45 min進行冠狀動脈結(jié)扎手術(shù)。手術(shù)方法：20%烏拉坦（1 g/kg）麻醉，仰位固定，氣管插管并接好人工呼吸機，呼吸頻率大約為55次/分；以ECGⅡ?qū)?lián)S-T段明顯抬高或T波高聳作為結(jié)扎成功標(biāo)志［6-7］；缺血30 min后恢復(fù)冠脈血流120 min，腹主動脈取血，取心臟。

2.2.2指標(biāo)檢測

腹主動脈取血后，2 000 r/min離心10 min，取血清。按試劑盒操作說明測定血清SOD活性、MDA含量。

2.2.3對大鼠血清中SOD和MDA含量的影響

模型組MDA含量明顯增加，SOD的活力顯著降低，與假手術(shù)組比較有顯著差異（P＜0.01）。A1，A2，A3組MDA含量均明顯降低，SOD活力提高。結(jié)果見圖3。

2.3譜效學(xué)研究與藥效物質(zhì)篩選

運用雙變量相關(guān)分析法建立譜效相關(guān)性數(shù)理統(tǒng)計模型：采用相關(guān)分析、多元回歸分析、灰色關(guān)聯(lián)度等數(shù)學(xué)方法，對川芎指紋圖譜及藥效學(xué)二者的相關(guān)性進行了考察，對指紋圖譜與藥效結(jié)果的內(nèi)在聯(lián)系進行研究［8］。

回歸分析是研究1個或多個自變量與1個因變量之間是否存在某種線性或非線性關(guān)系的一種統(tǒng)計學(xué)方法［9］。雙變量相關(guān)分析是研究變量之間密切程度的一種統(tǒng)計方法，將藥物HPLC指紋圖譜各峰的峰面積與其治療心肌缺血的各項指標(biāo)進行回歸分析和相關(guān)性分析，利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件線性回歸分析、及雙變量相關(guān)分析法處理。結(jié)果見表1和表2。

圖3　川芎提取物對缺血-再灌注大鼠血清中SOD和MDA含量的影響（n=8）

表1　川芎各指紋峰的峰效雙變量相關(guān)分析

表2　逐步回歸法引入各色譜峰號

綜合回歸分析和雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，1，2，3，4號峰均與治療心肌缺血作用呈正相關(guān)，通過研究單個指紋峰面積與血清中各項指標(biāo)的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)均能不同程度地降低血清MDA含量的升高程度，提高SOD活力。對藥效為增強作用，藥效成分主要來自1，2，3，4號峰，對照指紋圖譜中各對照品的保留時間提示其治療有效成分別為川芎內(nèi)酯A、藁苯內(nèi)酯、川芎嗪和阿魏酸。

3　討論

3.1色譜條件優(yōu)選

在流動相的選擇上，本試驗先后應(yīng)用乙腈-水和甲醇-水為流動相進行分離，試驗后發(fā)現(xiàn)，用甲醇-水較乙腈-水體系時，有機相用量少，柱壓低，色譜峰尖銳，分離效果好。因川芎藥材化學(xué)成分較多，極性范圍跨度較大，后經(jīng)預(yù)試驗篩選了不同比例不同梯度甲醇對各藥效物質(zhì)的分離效果，根據(jù)篩選，綜合考慮各有效成分的分離情況、保留時間和基線漂移程度等因素，選定了適宜的甲醇、水梯度洗脫程序，加入適量冰醋酸調(diào)節(jié)pH，有效改善了色譜峰的拖尾現(xiàn)象。

采用二極管陣列檢測器對檢測波長在200～400 nm范圍內(nèi)進行了考察比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測波長小于280 nm時基線有明顯漂移，而波長大于325 nm時色譜峰數(shù)目開始減少，于322 nm波長處各色譜峰均有較強紫外吸收，分離度高，色譜信息多，故選322 nm檢測波長。

3.2藥效機制探討

近年來，對心肌缺血損傷機制的深入研究發(fā)現(xiàn)，自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)增強與心肌缺血損傷的病理改變關(guān)系十分密切。心肌缺血時，自由基的生成增加，而自由基清除酶的活性降低，導(dǎo)致體內(nèi)大量自由基堆積，進而使生物膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而加劇缺血心肌的組織損傷及功能障礙［10-11］。本試驗結(jié)果顯示，中藥川芎的抗心肌再灌注損傷作用與其清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

3.3譜效相關(guān)性分析

中藥化學(xué)成分較復(fù)雜，研究和表征其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)難度大。本研究雙變量相關(guān)分析、回歸分析與藥效試驗結(jié)果基本一致，藁苯內(nèi)酯、川芎內(nèi)酯、阿魏酸和川芎嗪峰均與藥理活性顯著相關(guān)，其所代表的化合物能顯著抑制冠狀動脈結(jié)扎引起的心肌缺血，與部分文獻［12］所述該類物質(zhì)的藥理作用一致，其中川芎嗪、阿魏酸可顯著降低血清中丙二醛等指標(biāo)的升高，是中藥川芎治療心肌缺血的主要有效成分；川芎提取物治療心肌缺血是多種成分共同作用的結(jié)果。多元回歸分析、雙變量分析是研究多變量相關(guān)性的有效手段，通過色譜峰代表的化學(xué)成分信息與藥效信息相關(guān)聯(lián)，可有效發(fā)現(xiàn)成份復(fù)雜的中藥的藥效物質(zhì)［13］。

中藥指紋圖譜分析是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的來源，運用現(xiàn)代分析手段建立的藥效物質(zhì)數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，為本研究奠定了研究基礎(chǔ)。本研究中將指紋圖譜技術(shù)運用于中藥復(fù)雜成分的化學(xué)信息的采集，通過分析指紋圖譜信息與藥效活性的相關(guān)性，從中選取代表性成分作為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可系統(tǒng)表征該類中藥復(fù)方整體成分-藥效的相關(guān)性，為中藥追蹤分離藥理活性成分，研發(fā)新藥提供了借鑒。

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Spectrum-Effect Study on the Protective Efficacy of Ligusticum Chuanxiong Hort.on Myocardial Ischemia

Liu Xu，Cheng Yanqin，Cui Xiaobo，Li Mingchun
（Department of Pharmacy，PLA No.401 Hospital，Qingdao，Shandong，China266071）

ObjectiveTo investigate the protective efficacy of Ligusticum Chuanxiong Hort.on myocardial ischemia injury in rats and to study the spectrum activity relationship ofLigusticum Chuanxiong Hort.MethodsTheLigusticum Chuanxiong Hort.HPLC fingerprint analytical method was established，and the rat model of acute myocardial ischemia was established by applying left anterior descending coronary ligation.Bivariate correlation analysis and multivariate regression analysis were used to correlate the spectrum-activity relationship between fingerprints and anti-myocardial ischemia activity，and determine the spectrum activity relationship and efficacy material foundation of Ligusticum Chuanxiong Hort.ResultsLigustilide，Chuanxiong lactone，ferulic acid，both TMP was a significant positive correlation with efficacy，ferulic acid，TMP can significantly reduce elevated serum MDA，etc.，ferulic acid，and ligustrazine showed a significant positive correlation with efficacy，in which the ferulic acid，and ligustrazine could significantly reduce elevated serum MDA，and significantly increase the activity of SOD，and were the main active ingredients in Ligusticum Chuanxiong Hort.on myocardial ischemia injury.ConclusionBy Activity Relationship spectrum，the pharmacodynamic active substance is obtained，and the method of Chuanxiong spectrum activity relationship evaluation is established to objectively reflect the intrinsic quality of the drug，and provide references for the innovation study of such Chinese medicine.

Ligusticum Chuanxiong Hort.；fingerprint；spectrum-activity relationship；ferulic acid；ligustrazine

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2016）15-0009-04

國家自然科學(xué)基金面上項目，項目編號：30472178。

劉旭（1976-），女，碩士研究生，副主任藥師，研究方向為藥品質(zhì)控，（電子信箱）xliu76@ 126.com；李明春（1965-），男，碩士研究生，主任藥師，研究方向為藥理學(xué)，本文通訊作者，（電子信箱）348036890@qq.com。

（2016-05-01）