響應(yīng)面法優(yōu)化陶香型窖池中異常威克漢姆酵母發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件

侯建光，郭富祥，樊建輝，韓素娜，張俊峰，陳蒙恩

（河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后研發(fā)基地，河南澠池472400）

響應(yīng)面法優(yōu)化陶香型窖池中異常威克漢姆酵母發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件

侯建光，郭富祥，樊建輝，韓素娜，張俊峰，陳蒙恩

（河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后研發(fā)基地，河南澠池472400）

采用中心組合法對陶香型窖池中異常威克漢姆酵母YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件進(jìn)行優(yōu)化。在前期單因素的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵后樣品中乙酸乙酯含量為響應(yīng)值，發(fā)酵溫度、稻殼添加量、發(fā)酵時間為自變量，利用Box-Behnken中心組合法對發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在發(fā)酵溫度為28.5℃，稻殼添加量為20%，時間為166 h的最優(yōu)條件下，乙酸乙酯的產(chǎn)量可達(dá)到13.03 g/kg，接近于模型預(yù)測值（12.36 g/kg），相較于優(yōu)化前產(chǎn)量增長了近2倍，是正?；浦械?～5倍，表明通過中心組合法優(yōu)化的回歸方程具有一定的可行性。

響應(yīng)面優(yōu)化；異常威克漢姆酵母；陶香型窖池；乙酸乙酯

乙酸乙酯是產(chǎn)香酵母發(fā)酵產(chǎn)生的一種具有水果香味的揮發(fā)性酯類，也是白酒香氣濃郁的重要貢獻(xiàn)者，適量增加白酒中乙酸乙酯的含量，可以提高白酒的品質(zhì)［1-3］。但在實際生產(chǎn)中，由于生產(chǎn)工藝條件的限制，使得每批次白酒中乙酸乙酯的含量不盡相同，有些甚至低于標(biāo)準(zhǔn)要求。固態(tài)法白酒中的酯香主要由微生物發(fā)酵作用產(chǎn)生，而液態(tài)法和固液法白酒中則允許添加適量食用香料［4］。近年來，食品安全警鐘長鳴，對于在白酒中使用合成香料的安全問題爭議不斷。因此，采用微生物發(fā)酵方式來增加基礎(chǔ)酒中香味物質(zhì)的生成和積累，提高基礎(chǔ)白酒質(zhì)量，已成為當(dāng)前研究的熱點［5］。本研究以陶香型窖池中分離篩選的1株高產(chǎn)乙酸乙酯的異常威克漢姆酵母為研究對象，糯高粱為底物，發(fā)酵原料配方及發(fā)酵條件為影響因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面［6-8］法進(jìn)一步優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的條件，以期為提高白酒生產(chǎn)中基礎(chǔ)酒的質(zhì)量提供一定的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種

異常威克漢姆酵母YS/Y/22，從河南仰韶酒業(yè)有限公司陶香型窖池酒醅中篩選獲得。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑

酵母活化培養(yǎng)基：葡萄糖含量5%，豆芽汁200 g/L。

糯高粱：稱取一定質(zhì)量的糯高粱（圓糧），用40～60℃熱水浸泡1～2 h，充分?jǐn)嚢?，放水，再?0～90℃的熱水泡15～18 h后控干；對控干后糧食初蒸，時間為15～30 min；之后，加入40～50℃的溫水進(jìn)行悶水，時間為10～30 min；悶水結(jié)束后，取出糯高粱，冷卻至25℃，備用。

稻殼：大汽清蒸1.5 h，中汽清蒸1 h，取出稻殼，備用。糯高粱和稻殼均由河南仰韶酒業(yè)有限公司提供。

糖化酶：稱取1 g糖化酶，用30℃的10 mL純水活化0.5 h，備用。糖化酶酶活為50000 U/g，博立牌，購自江蘇博立生物制品有限公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蒸熟糯高粱200 g，水分含量50%，糖化酶1 g。

1.1.3儀器與設(shè)備

SF-CT-1A型超凈工作臺，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；HYG-B型搖床，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；20 mL帶硅橡膠墊的樣品瓶，美國Supelco公司；Thermo Scientific Trace1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾而科技公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1產(chǎn)香實驗

菌株YS/Y/22接種于活化培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，獲得適宜濃度的種子液。后以10%的接種量（種子液體積占糯高粱干重的百分比）接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃下靜置發(fā)酵168 h，之后對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行聞香評定、揮發(fā)性成分定性分析和半定量分析。

1.2.2聞香評定

由10名經(jīng)過聞香訓(xùn)練的人員組成評定小組，對各實驗組發(fā)酵后的樣品進(jìn)行外觀、氣味評定。

1.2.3乙酸乙酯含量檢測［9-10］

頂空固相微萃取條件（HS-SPME）：精確稱取4.0 g粉碎后的發(fā)酵樣品于20 mL進(jìn)樣瓶中，稱取1.3 g NaCl飽和溶液，加入5 μL內(nèi)標(biāo)（乙酸正戊酯），旋緊瓶蓋，60℃孵化萃取45 min，萃取完畢后將萃取頭取出，插入GC進(jìn)樣口熱解吸5 min，熱解吸溫度250℃。

氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱為DB-FFAP（60 m× 0.25 μm，0.25 μm），進(jìn)樣口和檢測口溫度均為250℃，載氣為He，流速為2 mL/min。程序升溫：初始溫度為50℃，保持2 min后，以4℃/min的速率升至230℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件：EI電離源，掃描范圍20～550 u，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度230℃。

1.2.4定性與半定量分析［11］

定性分析：將檢出的揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫（NIST05a.L）進(jìn)行比對，匹配度＞800的鑒定結(jié)果予以確認(rèn)。

半定量分析：以乙酸正戊酯為內(nèi)標(biāo)，將樣品揮發(fā)性物質(zhì)的濃度與正丁醇質(zhì)量濃度作比進(jìn)行計算。

式中：C為樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的濃度（mg/100 g樣品）；Cis為內(nèi)標(biāo)物終濃度（mg/100 g樣品）；Ac為揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積；Ais為內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.2.5單因素實驗

采用單一變量法，依次改變溫度（20℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、40℃）、稻殼添加量（0、5%、10%、15%、20%、25%、30%）及時間（24 h、72 h、120 h、168 h、216 h、264 h）對菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響，并對較優(yōu)發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行選取。

1.2.6響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實驗時，采用單一變量法，依次改變發(fā)酵溫度、稻殼添加量和發(fā)酵時間，以乙酸乙酯的生成量為評價指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，并確定最佳優(yōu)化參數(shù)，進(jìn)行17組5個中心點的Box-Behnken響應(yīng)面分析［12-13］，實驗均設(shè)3個平行，其各因素水平及編碼見表1。

表1　Box-Behnken實驗因素及水平

1.3數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析處理。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1溫度對菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響

固定裝料量為200 g/500 mL，水分含量為50%，稻殼添加量為10%（稻殼干重占糯高粱干重的百分比，下同）。設(shè)置不同的變溫梯度，靜置發(fā)酵168 h，研究其對菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可知，菌株YS/Y/22在不同溫度下的乙酸乙酯產(chǎn)量差異較大，在28℃時，發(fā)酵生成的乙酸乙酯量最大，其產(chǎn)量接近4 g/kg。乙酸乙酯是由酵母的特殊代謝過程產(chǎn)生的，其含量高低與相關(guān)酶活性及酵母的生長代謝有關(guān)，當(dāng)溫度過低時，不利于蛋白酶的催化作用及酵母菌的生長繁殖，隨著溫度的升高，酶活性增強(qiáng)，且酵母菌開始大量生長繁殖，乙酸乙酯生成量隨之增多；當(dāng)溫度過高時，酵母菌生長受到抑制，同時酶的活性及穩(wěn)定性也會下降，故而乙酸乙酯生成量減少。因此，選取24℃、28℃、32℃作為菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的響應(yīng)面實驗參數(shù)，以確定最佳發(fā)酵溫度。

圖1　溫度對乙酸乙酯生成量的影響

2.1.2稻殼添加量對菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響

固定裝料量為200 g/500 mL，水分含量為50%，培養(yǎng)溫度為28℃。設(shè)置不同的稻殼添加量，靜置發(fā)酵168 h，研究其對菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可知，稻殼添加量對菌株YS/Y/22發(fā)酵生成乙酸乙酯量的影響較大，在稻殼添加量為20%時，其產(chǎn)量接近7 g/kg。這可能是由于增加稻殼后，糯高粱之間的透氣性增大，黏性減小，更有利于酵母菌繁殖及利用原料進(jìn)行發(fā)酵所致。因此，選取稻殼添加量為15%、20%、25%作為菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的響應(yīng)面實驗參數(shù)，以確定發(fā)酵時的最佳稻殼添加量。

圖2　稻殼添加量對乙酸乙酯生成量的影響

2.1.3時間對菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響

固定裝料量為200 g/500 mL，水分含量為50%，培養(yǎng)溫度為28℃，設(shè)置不同的發(fā)酵時間，研究其對菌株YS/ Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可知，菌株YS/Y/22隨著發(fā)酵時間的延長，其乙酸乙酯生成量逐漸增加，且在168 h時達(dá)到最大，乙酸乙酯生成量超過7 g/kg，之后隨發(fā)酵時間的延長開始急劇下降，之后呈緩慢下降趨勢?？赡苁请S著發(fā)酵時間的進(jìn)行，起初營養(yǎng)充足，酵母菌繁殖代謝旺盛，乙酸乙酯含量迅速增加，而后由于養(yǎng)分逐漸耗盡，部分酵母可能開始利用已生成的乙酸乙酯產(chǎn)生其他物質(zhì)，導(dǎo)致其含量下降。綜合考慮，選取發(fā)酵時間為120 h、168 h、216 h作為菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的響應(yīng)面實驗參數(shù)，以確定乙酸乙酯生成的最佳發(fā)酵時間。

圖3　時間對乙酸乙酯生成量的影響

2.2響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)香條件

2.2.1響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

對菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件進(jìn)行響應(yīng)面分析，具體實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行二次回歸擬合后，得到以下回歸方程：Y=10.958+0.1425×A+0.01875×B-0.07625×C-0.3375× AB-0.1225×AC-0.265×BC-1.1365×A2-1.339×B2-1.109× C2，回歸模型方差分析見表3。由表3可知，Pr值小于0.01，F(xiàn)值為17.99612，說明本模型極為顯著。由方差分析可知，模型失擬項（lack of fit）中Pr＞0.05，說明該模型選擇比較合理。AB、BC、A2、B2、C2的Pr值小于0.05，表明這些因素對模型顯著，該方程對實驗擬合情況較好。模型系數(shù)R2為95.86%，表明該模型與實際情況擬合良好，可以用于菌株YS/Y/22最佳發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件的分析和預(yù)測。

表2　Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2各因素之間的交互作用

利用響應(yīng)面回歸分析、回歸方程和Design-Expert8.0.6.1軟件繪制三維響應(yīng)曲面圖，探究兩兩因素間交互作用對菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件的影響，結(jié)果見圖4—圖6。由圖4—圖6中的響應(yīng)曲面可以看出，當(dāng)各因素大小從四周逐漸趨向中心點時，曲面圖呈凸起趨勢，說明相關(guān)因素交互作用越強(qiáng)，即菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯能力趨向最大化，說明存在最大響應(yīng)值。運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，當(dāng)預(yù)測的響應(yīng)值最大時，3個因素的最佳值為：溫度為28.26℃，稻殼添加量為20.1%，時間為166.176 h，菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯最大值為12.36 g/kg。考慮到實際情況，采用溫度為28.5℃，稻殼添加量為20%，時間為166 h進(jìn)行驗證實驗，重復(fù)3次，結(jié)果顯示，3次平行實驗中菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的平均值經(jīng)色譜定量分析后，其值為13.03 g/kg（圖7），與預(yù)測值12.36 g/kg相接近，證明擬合模型能較好總結(jié)出菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的最佳條件。

表3　Box-Behnken Design回歸模型方差分析

3　結(jié)論

圖4　溫度和稻殼添加量對乙酸乙酯生成量影響的曲面圖

圖5　溫度和時間對乙酸乙酯生成量影響的曲面圖

圖6　稻殼添加量和時間對乙酸乙酯生成量影響的曲面圖

采用響應(yīng)面法對陶香型窖池糟醅中分離篩選的異常威克漢姆酵母YS/Y/22的發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件進(jìn)行優(yōu)化，取得了明顯效果：酵母YS/Y/22在溫度為28.5℃，稻殼添加量為20%，時間為166 h的最優(yōu)條件下進(jìn)行固體糯高粱產(chǎn)乙酸乙酯發(fā)酵，其乙酸乙酯含量可以達(dá)到13.03 g/kg，與預(yù)測值（12.36 g/kg）較為接近，相較于優(yōu)化前產(chǎn)量增長了近2倍，是正?；浦幸宜嵋阴ズ康?～5倍。將產(chǎn)香微生物直接運(yùn)用于白酒釀造或利用現(xiàn)代分離技術(shù)對乙酸乙酯等香味成分進(jìn)行提取和應(yīng)用，可以改善白酒風(fēng)味，提升曲酒質(zhì)量，解決了化學(xué)合成香料用于食品行業(yè)所存在爭議的安全問題，具有廣泛的開發(fā)前景。后續(xù)將對異常威克漢姆酵母YS/Y/22運(yùn)用于實際生產(chǎn)所面臨的問題進(jìn)行研究，為其運(yùn)用于白酒釀造等行業(yè)提供技術(shù)參考。

圖7　菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS總離子流色譜圖

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Optimization of Ethyl Acetate-Producing Conditions of Wickerhamomyces anomalus in Taoxiang Pits by Response Method

HOU Jianguang，GUO Fuxiang，F(xiàn)AN Jianhui，HAN Suna，ZHANG Junfeng and CHEN Mengen
（Postdoctoral Development&Research Base，Yangshao Distillery Co.Ltd.，Mianchi，He'nan 472400，China）

The ethyl acetate-producing conditions of Wickerhamomyces anomalus in Taoxiang pits were optimized by using response method. On the basis of single factor test，ethyl acetate content in samples after the fermentation used as the response value，fermentation temperature，bran husk adding level，and fermentation time used as the variables，Box-Behnken central composite method was adopted to optimize the ethyl acetate-producing conditions.The optimum conditions were summed up as follows:fermentation temperature at 28.5℃，the adding level of bran husk was 20%，and fermentation time was 166 h.Under above conditions，the yield of ethyl acetate was 13.03 g/kg，3 to 5 times of the ethyl acetate content in normal base liquor and close to the predicted value of the model of 12.36 g/kg，and increased almost 2 times than that before the optimization.The study proved that such optimized regression equation was feasible in practice.（Trans.by YUE Yang）

optimization by response method；Wickerhamomyces anomalus；Taoxiang pits；ethyl acetate

Q93-3；TS261.1；TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2016）10-0077-05

10.13746/j.njkj.2016226

2016-07-15

侯建光（1968-），男，在職研究生，高級工程師，E-mail：610365356@qq.com。

樊建輝（1976-），男，大專，工程師，E-mail：fanjianhui2006@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-09-14；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160914.1443.003.html。