陰離子交換固相萃取-HPLC快速測定中藥材中合成色素的方法研究

姜　偉　張　璐　傅小紅　戴群芳　廖樹偉

（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所南昌330038）

陰離子交換固相萃取-HPLC快速測定中藥材中合成色素的方法研究

姜偉張璐傅小紅戴群芳廖樹偉

（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所南昌330038）

目的：針對中藥材染色現(xiàn)象，建立快速測定中藥材中亮藍(lán)、檸檬黃、日落黃、赤蘚紅、莧菜紅、誘惑紅等6種合成色素的HPLC檢測方法。方法：樣品用甲醇-0.1％甲酸溶液提取后，再經(jīng)陰離子固相萃取去除大部分基質(zhì)干擾，采用Agilent C18色譜柱（4.6mm× 250mm，5μm），以甲醇-20mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相，梯度洗脫，以二極管陣列檢測器測定。結(jié)果：在山茱萸、黃柏兩種基質(zhì)中，這6種色素在0.1μg/L至100μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。檢測限為0.16～1.04mg/kg，回收率為80.5％～102.9％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6％～4.8％。結(jié)論：本方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，適用于中藥材中多種人工色素的快速檢測。

陰離子交換固相萃取 高效液相色譜 中藥材 色素

中藥材非法染色行為不僅嚴(yán)重影響中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，也嚴(yán)重危害人民健康。研究表明，合成色素具有不同程度的致敏性和致癌性，中藥材標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，禁止添加任何合成色素。但在利益的驅(qū)動(dòng)下，中藥材的非法染色行為屢禁不止，甚至藥材同時(shí)使用多種色素染色，對中藥材的有效監(jiān)管提出了挑戰(zhàn)，目前染色的檢測大多僅適用于個(gè)別藥材，中藥材基質(zhì)干擾嚴(yán)重限制了方法的通用性，2015版《中國藥典》將合成色素的檢測分析作為指導(dǎo)原則列入，但是仍缺少對色素通用的前處理方法。急需建立起多種合成色素的快速檢測方法。

目前，中藥材中測定合成色素的常用方法有薄層色譜法、高效液相色譜法等、示波極譜法[1～4]。中藥材的染色所用合成色素多集中于水溶性色素，結(jié)構(gòu)上主要分為偶氮類色素（莧菜紅、日落黃等）和非偶氮類色素（赤蘚紅等）。本研究采用陰離子交換固相萃取法，可去除中藥材基質(zhì)干擾，快速測定6種不同結(jié)構(gòu)類別的合成色素。

1　儀器與試藥

1.12695e型高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測器（Waters公司）；C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm，美國安捷倫科技有限公司）；超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；陰離子交換柱Cleanert PWAX柱（150mg/6mL，天津博納艾杰爾科技有限公司）。

1.2甲醇（色譜純，默克公司）、乙酸銨；甲酸、氨水（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬黃、日落黃、赤蘚紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍(lán)（中國計(jì)量科學(xué)研究院）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（自制）。

1.3山茱萸、黃柏等中藥材購自南昌市場。

2　方法與結(jié)果

2.1混合對照試劑溶液的制備：取亮藍(lán)、檸檬黃、日落黃、赤蘚紅、莧菜紅、誘惑紅對照品溶液1mL，加水制成每1mL分別含0.1mg的混合溶液，作為對照試劑溶液。精密量取對照試劑溶液適量，用水依次稀釋成質(zhì)量濃度為100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、1μg/ mL、100ng/mL的系列溶液，作為系列混合對照試劑工作溶液。

2.2供試品溶液的制備：取粗粉（過二號篩）0.5g，精密稱定，置25mL具塞離心管中，用甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）避光超聲提?。l率：53HZ，功率：500W），第1次10mL 30min，第2次，5mL 15min，第3次，5mL10min合并上清液置25mL棕色量瓶中，用甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）稀釋至刻度，搖勻。

精密取上述溶液5mL，快速通過陰離子固相小柱（預(yù)先用6mL甲醇、6mLpH6.0水活化），依次用6mL水（pH6.0）、6mL甲醇淋洗，通入空氣干燥5min，用2％氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈桑?mL水定容。

2.3液相色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（C18，4.6mm×250mm，5μm，美國安捷倫公司）；以甲醇為流動(dòng)相A，20mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為254nm。

表1　梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

2.4通用性考察：本實(shí)驗(yàn)選擇山茱萸、黃柏作為研究對象，山茱萸為山茱萸科果實(shí)，黃柏為黃柏樹樹皮，兩者成分復(fù)雜，質(zhì)量與顏色有密切關(guān)系，易出現(xiàn)非法染色的現(xiàn)象，具有代表性，能夠考察方法的通用性。

2.5線性關(guān)系：在上述色譜條件下，6種酸性色素的液相色譜圖（見圖1），取系列混合對照試劑工作溶液進(jìn)樣測定，以各組分峰面積對濃度繪制曲線，結(jié)果表明，各色素在0.1μg/L至100μg/L范圍內(nèi)均有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。

表2　6種合成色素線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)Tab.2 Regression and correlation coefficient of 6 synthetic pigments

2.6回收率和精密度：取2種藥材（山茱萸、黃柏），經(jīng)檢測不含上述6種酸性色素（見圖2），然后分別添加低（0.1μg/mL）、中（1μg/ mL）、高（10μg/mL）3個(gè)水平的色素對照品溶液，一式3份，共9份，按“1.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法和“1.4”項(xiàng)下液相色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率和精密度（n=9）。6種色素3種質(zhì)量濃度下加樣的樣品回收率在80.5％～102.9％之間（見表3）。特別是赤蘚紅的加標(biāo)回收率由約40％提高至80％以上，完全可以滿足檢測回收率的要求。該方法前處理可有效去除基質(zhì)干擾且對目標(biāo)色素具有較好的保留，HPLC檢測方法穩(wěn)定可靠，耐受性良好。

2.7檢測限：分析低水平添加溶液的信噪比，計(jì)算6種色素的檢出限（S/N=3），結(jié)果見表3，6種酸性合成色素在黃柏和山茱萸中的檢出限為0.16～1.04mg/kg范圍內(nèi)，檢出限的差別可能由于山茱萸中的生物堿等物質(zhì)易與合成色素發(fā)生相互作用。由于中藥材的非法染色能達(dá)到相應(yīng)的效果，色素的使用量至少要達(dá)到50mg/kg，即使考慮到多種合成色素的混合使用，該方法仍可滿足禁用合成色素檢查的要求。

表3　6種色素測定的回收率、精密度和檢測限Tab.3 Recoveries，precision and limits of detection of 6 pigments

3　討論

3.1提取溶劑的選擇：根據(jù)合成色素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和理化性質(zhì)，分別考察了0.1％甲酸溶液、甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）、甲醇-0.1％甲酸溶液（2∶3）、0.1％甲酸甲醇溶液對目標(biāo)合成色素的提取率，結(jié)果表明采用甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）的提取效率高于其他提取溶液，重復(fù)性較好，故采用甲醇-0.1％甲酸溶液（3∶2）避光超聲提取。

3.2固相萃取柱的選擇：本實(shí)驗(yàn)研究的6種色素中赤蘚紅結(jié)構(gòu)中含羧基，其余5種結(jié)構(gòu)中含磺酸基，但多以鹽的形式存在。由于多數(shù)中藥材的纖維細(xì)孔狀結(jié)構(gòu)，易吸附合成色素。聚酰胺吸附材料能提供合成色素的反相保留能力，能有效地去除樣品中雜質(zhì)。但是由于赤蘚紅的羧酸結(jié)構(gòu)保留較弱，淋洗過程中，造成赤蘚紅的損失，回收率低，僅為40％，不能滿足檢測要求。本實(shí)驗(yàn)比較陰離子交換固相萃取和聚酰胺固相萃取兩種方法，最終確定采用陰離子交換法。該方法相對于聚酰胺法，可提高吸附酸性色素的能力，同時(shí)對赤蘚紅的反保留能力予以提高，可滿足檢測要求。故而利用商品化的陰離子交換固相萃取小柱，可實(shí)現(xiàn)純化并富集酸性色素，且操作方便，重復(fù)性好。

3.3采用陰離子交換固相萃取-HPLC法，建立了中藥材中誘惑紅、莧菜紅、赤蘚紅、檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)等6種人工合成色素的快速檢測方法，操作簡單，快速高效，重復(fù)性好，適用于快速測定多種中藥材中不同結(jié)構(gòu)的人工合成色素。

[1]顏琪.液-液分配高效液相色譜法測定飲料中合成色素[J].監(jiān)督與選擇，2005（10）：60-61.

[2]晏立新.食用合成色素的檢驗(yàn)方法[J].職業(yè)與健康，2006，22（20）：1662-1663.

[3]邵仕萍，奚星林，陳潔貞，等.飲料和糖果中5種非法添加色素的檢測[J]食品科學(xué)，2011，32（4）：189-192.

[4]楊勝琴，倉書華.高效液相色譜法快速測定糕點(diǎn)中亮藍(lán)[J]中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（4）：934-935.

Rapid determination of synthetic pigments in medicinal Chinese herbs by anion exchange SPE–HPLC

Jiang Wei Zhang Lu Fu Xiaohong Dai QunfangLiao Shuwei（Nanchang Institute of Food and Drug Control，Nanchang 330038，China）

Objective：To develop an HPLC method for rapid determination of six synthetic pigments，including brilliant blue，tartrazine，sunset yellow，erythrosine B，amaranth，allura red，to distinguish the dyeing from medicinal Chinese herbs.Methods：the sample were extracted by methanol-0.1％fornic acid，then purified by anion exchange solid phase extraction（SPE）.Results：A reversed phase column，C18（4.6mm×250mm，5μm）was used for determination.six pigments presented in shanzhuyu（Corni Fructus）and Huang bo（Phellodendri Chinensis Cortex）possessed good linear correlation in the concentration range from 0.1μg/mL to 100μg/mL.their quantitative detection limits ranged from 0.16mg/kg to 1.04mg/kg，and their recoveries ranged from 80.5 to 102.9％，the RSDs ranged from 1.6％to 4.8％.Conclusion：this method is simple，reliable and reproducible，and suitable for simple detections of synthetic pigments in medicinal Chinese herbs.

Nion exchange SPE HPLC Medicinal Chinese herb Synthetic pigments

R927.2

A

1672-8351（2016）10-0002-02