新疆產(chǎn)桑屬植物HPLC指紋圖譜研究

楊 璐， 范少麗， 程 平， 李 宏

新疆林業(yè)科學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054)

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新疆產(chǎn)桑屬植物HPLC指紋圖譜研究

楊 璐， 范少麗， 程 平， 李 宏*

新疆林業(yè)科學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054)

[目的]采用HPLC建立新疆產(chǎn)桑屬植物指紋圖譜。[方法]采用SunFire C18(4.6 mm×150.0 mm，5.0 μm)色譜柱；以甲醇-0.2%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長330 nm，流速0.8 mL/ min，柱溫25℃，進(jìn)樣體積10 μL。[結(jié)果]對(duì)13批新疆不同來源的桑葚、桑葉進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，建立的桑葚、桑葉指紋圖譜精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。[結(jié)論]桑葚、桑葉HPLC指紋圖譜可作為新疆桑屬植物鑒別與質(zhì)量控制的科學(xué)依據(jù)。

新疆；桑屬植物；指紋圖譜；高效液相色譜

桑屬(MorusLinn.)植物是桑科多年生落葉喬木或灌木，新疆作為古絲綢之路的重要通道，擁有豐富的桑樹資源[1]。桑屬植物是重要的藥用植物資源，其根皮、莖、果實(shí)和葉子均可入藥，其果實(shí)(桑葚)具有補(bǔ)血滋陰、生津潤燥的功效[2]，其葉(桑葉)具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目的功效[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，桑葚與桑葉均具有抗氧化[4-5]、降血糖[6]、降血脂[7-8]等藥理活性。指紋圖譜是國內(nèi)外廣泛采用的一種藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，而HPLC指紋圖譜具有分離效能高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。研究者對(duì)廣西、陜西等地產(chǎn)桑葚、

桑葉藥材的指紋圖譜進(jìn)行研究[11-13]，但對(duì)于新疆產(chǎn)桑葚、桑葉的指紋圖譜系統(tǒng)研究鮮見報(bào)道[14]。筆者采用高效液相色譜法，建立新疆產(chǎn)桑葚、桑葉的指紋圖譜，并對(duì)不同來源的13批新疆產(chǎn)桑葚、桑葉HPLC色譜圖進(jìn)行分析，以期為更好地評(píng)價(jià)新疆桑屬植物的綜合質(zhì)量提供參考。1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料桑葚(鮮果)、桑葉(干燥葉)采自新疆吐魯番地區(qū)，共采集13批桑葚、桑葉樣品(表1)，采集時(shí)間為2015年5月。

表1　桑葚、桑葉樣品來源

1.2試劑對(duì)照品：蕓香葉苷(批號(hào)：C10027472，上海麥恪林生化科技有限公司，含量≥98%)；桑色素(批號(hào)：C10031384，上海麥恪林生化科技有限公司，含量≥98%)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)；磷酸(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

1.3儀器高效液相色譜儀(美國Waters，Alliance E2695，包括自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower色譜工作站等)；紫外檢測器(美國Waters，Alliance 2998)，數(shù)控超聲清洗器(KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.4色譜條件色譜柱：SunFire C18(4.6 mm×150.0 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸；檢測波長：330 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序見表2。

表2　梯度洗脫程序

1.5供試品溶液制備精密稱取桑葚(鮮果勻漿0.50 g)、桑葉(干燥粉末1.00 g)樣品，分別加入10 mL 70%的甲醇超聲提取30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液全量，氮吹，再定容至2 mL，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.6混合對(duì)照品溶液制備分別精密稱定蕓香葉苷、桑色素對(duì)照品，各加甲醇制成對(duì)照品濃度分別為0.600、0.400、0.200、0.100、0.060、0.010、0.002 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，再用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得混合對(duì)照品溶液。0.4 mg/mL的混合對(duì)照品溶液色譜見圖1。

注：1.蕓香葉苷；2.桑色素。Note: 1.Rutin hydrate; 2.Morin hydrate. 圖1　混合對(duì)照品的HPLC色譜 Fig.1　HPLC chromatogram of mixed reference substances

2　結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

2.1.1精密度。取同一批次的樣品(亞亞長黑1號(hào))，按“1.5”供試品溶液的制備方法處理后，在已確定的HPLC色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄圖譜，考察主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.01%～0.02%；各峰相對(duì)峰面積RSD在0.2%～1.2%。應(yīng)用相似度軟件對(duì)色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，結(jié)果表明，各指紋圖譜的相似度均等于1。表明儀器的精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.1.2重復(fù)性。取同一批次的樣品(亞亞長黑1號(hào))，按“1.5”供試品溶液的制備方法處理后，平行6份，在已確定的色譜條件下進(jìn)行檢測，記錄圖譜，考察試驗(yàn)方法的重復(fù)性。結(jié)果表明，6 份樣品中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.01%～0.02%，共有峰相對(duì)峰面積RSD在1.2%～0.2%，應(yīng)用相似度軟件對(duì)色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，結(jié)果表明，各指紋圖譜的相似度均大于0.999，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.1.3穩(wěn)定性。取同一批次的樣品(亞亞長黑1號(hào))，按“1.5”供試品溶液的制備方法制備一份供試品，在已確定的色譜條件下分別在 0、 2、 4、 8、16、 24 h 進(jìn)行檢測，記錄圖譜，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.03%～0.08%，各峰相對(duì)峰面積RSD在0.2%～0.8%，應(yīng)用相似度軟件對(duì)色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，結(jié)果表明，各指紋圖譜的相似度均大于0.9。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜的檢測要求。

圖2　5批黑桑HPLC指紋圖譜Fig.2　HPLC fingerprint overlapping of 5 batches of black mulberry

圖3　7批白桑HPLC指紋圖譜Fig.3　HPLC fingerprint overlapping of 7 batches of white mulberry

圖4　13批桑葉HPLC指紋圖譜Fig.4　HPLC fingerprint overlapping of 13 batches of mulberry leaves

2.2指紋圖譜的建立2.2.1共有峰的確定。精密稱定13批桑葚、桑葉樣品，分別按“1.5”方法制備供試品溶液，按“1.4”色譜條件分析，記錄色譜圖，桑葚、桑葉樣品HPLC圖譜見圖2～4。采用國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)》，以均值法生成指紋圖譜共有模式，生成的對(duì)照指紋圖譜R1、R2、R3見圖5～7。按照峰面積的大小，13批桑葉樣品共標(biāo)示出9個(gè)共有峰，5批黑桑樣品共標(biāo)示出5個(gè)共有峰，7批白桑樣品則標(biāo)示出2個(gè)共有峰。經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間定位及色譜峰紫外光譜分析，鑒別出2個(gè)共有峰。圖5的峰2、圖6的峰2與圖7的峰5為蕓香葉苷，圖5的峰5與圖7的峰8則為桑色素。

注：2.蕓香葉苷；5.桑色素。Note: 2.Rutin hydrate; 5.Morin hydrate圖5　5批黑桑HPLC特征指紋圖譜的共有模式R1Fig.5　Common pattern R1 of HPLC fingerprints of 5 batches of black mulberry

圖6　7批白桑HPLC特征指紋圖譜的共有模式R2Fig.6　Common pattern R2 of HPLC fingerprints of 7 batches of white mulberry

注：5.蕓香葉苷；8.桑色素。Note: 5.Rutin hydrate; 8.Morin hydrate.圖7　13批桑葉HPLC特征指紋圖譜的共有模式R3Fig.7　Common pattern R3 of HPLC fingerprints of 13 batches of mulberry leaves

2.2.2各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的測定。由HPLC色譜圖可以看出，蕓香葉苷是13批桑葚、桑葉共有的主要藥效成分。選擇圖5的峰2、圖6的峰2與圖7的峰5(蕓香葉苷)作為參照峰，分別計(jì)算各指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果13批桑葉樣品各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.01%～0.30%，各峰相對(duì)峰面積RSD在0.204%～0.839%。5批黑桑樣品各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.02%～0.04%，各峰相對(duì)峰面積RSD在49.22%～100.51%。7批白桑樣品各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%，相對(duì)峰面積RSD為19.55%。13批桑葚、桑葉樣品的蕓香葉苷含量見表3。由表3可知，各批樣品之間共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性，但各桑葚、桑葉樣品中共有指紋峰的相對(duì)峰面積與蕓香葉苷含量均有很大差異。

表3　樣品中蕓香葉苷含量

2.2.3相似度分析。通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)》將13批桑葉、5批黑桑與7批白桑樣品色譜圖與相應(yīng)的對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果表明，桑葉樣品S1～S13與對(duì)照指紋圖譜R的相似度均大于0.900(表4)，符合指紋圖譜的要求，可建立共有模式。但桑葚色譜圖與對(duì)照指紋圖譜有一定差異，可見桑葚品種與種植環(huán)境對(duì)桑葚質(zhì)量的控制有重要影響。

表4　樣品HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜R的相似度

3　討論

3.1色譜條件的優(yōu)化該試驗(yàn)對(duì)不同提取溶劑(體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%、100%甲醇)的超聲提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，以70%甲醇提取效果較優(yōu)。孫蓮等[15]、譚振鵬[16]研究表明，桑葉指紋圖譜的檢測波長為蘆丁的最大吸收波長280 nm。該試驗(yàn)對(duì)供試品進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果表明，在330 nm處檢測的峰數(shù)目較多，多數(shù)峰響應(yīng)值較大，因此，選擇330 nm作為桑葚、桑葉HPLC指紋圖譜的檢測波長。為了保證色譜圖能從總體上反映桑葚的化學(xué)信息，各化學(xué)成分盡可能出峰，并達(dá)到基線分離，有良好的分離度，不斷優(yōu)化流動(dòng)相的比例[17]，最終確定色譜條件，可實(shí)現(xiàn)圖譜各峰較好分離，出峰時(shí)間適宜，峰形正態(tài)分布。

3.2共有峰的標(biāo)定指紋圖譜共有峰的標(biāo)定，按照《重要注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》，根據(jù)13批供試品的檢測結(jié)果，采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定指紋共有峰，色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間根據(jù)參照峰的保留時(shí)間計(jì)算[18]。該研究借助《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)》自動(dòng)匹配色譜圖相關(guān)參數(shù)，13批桑葉樣品共標(biāo)示出9個(gè)共有峰，5批黑桑樣品共標(biāo)示出5個(gè)共有峰，7批白桑樣品則標(biāo)示出2個(gè)共有峰，避免人工判斷的盲目性與誤差。

從該試驗(yàn)得出的指紋圖譜可看出，對(duì)于不同批次的新疆桑葉，共有指紋峰數(shù)量較多，其相對(duì)保留時(shí)間一致，且HPLC色譜圖譜相似；相似度均較高(﹥0.900)，說明不同來源、批次桑葉的質(zhì)量相對(duì)較穩(wěn)定。7批白桑HPLC色譜圖相似度有一定差異，可以反映不同批次白桑樣品的內(nèi)在質(zhì)量差別。5批黑桑HPLC指紋圖譜中，各批次樣品間共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間比較吻合，但不同批次的部分峰面積比值差別很大。

蕓香葉苷為桑葚及其有關(guān)制劑的主要藥效成分，在桑葚藥品開發(fā)過程中，蕓香葉苷為其制劑的主要質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[19]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，蕓香葉苷含量由高到低依次為桑葉、黑桑、白桑，尤其是桑葚樣品，不同果實(shí)顏色的桑葚樣品，蕓香葉苷含量具有明顯差異，推測這也是新疆黑桑藥用價(jià)值高于白桑的原因之一[20]。該試驗(yàn)樣品是于相近時(shí)間在新疆吐魯番不同種植區(qū)采收的樣品，且采收后使用統(tǒng)一前處理方法和保存條件，故認(rèn)為品種因素與種植環(huán)境造成樣品中各組分含量比例差異，在以后的研究中，將進(jìn)一步累積樣品，著重考慮品種因素的影響深入研究。該研究建立的HPLC指紋圖譜方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可為評(píng)價(jià)新疆桑葚、桑葉質(zhì)量提供方法依據(jù)，爭取優(yōu)選出新疆產(chǎn)藥效含量高的優(yōu)質(zhì)桑屬植物品種，實(shí)現(xiàn)新疆桑屬植物的規(guī)范化種植以保持其產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。

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Study on Fingerprints ofMorusalbafrom Xinjiang by HPLC

YANG Lu,FAN Shao-li,CHENG Ping,LI Hong*

Xinjiang Academy of Forestry Sciences,Urumqi,Xinjiang 830054)

[Objective] To establish the fingerprints ofMorusalba. from Xinjiang by HPLC.[Methods] The samples were separated on SunFire C18 (4.6 mm×150.0 mm,5.0 μm) with methanol-0.2% phosphoric acid as the mobile phase to conduct gradient eluent at the flow rate of 0.8 mL/min at 30 ℃,and the detection wavelength was 330 nm.The sample injection was 10 μL.[Results] 13 samples of mulberry and mulberry leaves from different origins of Xinjiang were detected.The results showed that the fingerprints had good accuracy,repeatability and stability.[Conclusion] The HPLC fingerprints can be used as the scientific evidence for identification and quality control ofM.albafrom Xinjiang.

Xinjiang;Morusalba; Fingerprint; HPLC

自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(KY201521)。

楊璐(1985- )，女，新疆烏魯木齊人,助理研究員，碩士，從事植物資源化學(xué)與生物活性物質(zhì)研究。*通訊作者，研究員，博士，從事林果栽培和綜合利用研究。

2016-07-20

S 188

A

0517-6611(2016)26-0111-04