L9(34)正交試驗優(yōu)化柑橘中橙皮苷的提取工藝

杜歡歡，張 涵，景 嫻，孟怡璠，江 海，2，3*，徐 皓，2，3

1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中 723000；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西漢中 723000)

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L9(34)正交試驗優(yōu)化柑橘中橙皮苷的提取工藝

杜歡歡1，張 涵1，景 嫻1，孟怡璠1，江 海1，2，3*，徐 皓1，2，3

1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中 723000；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西漢中 723000)

[目的]開展柑橘皮中橙皮苷提取純化工藝研究，充分利用漢中豐富的柑橘資源，提高其經(jīng)濟附加值。[方法]以漢中柑橘皮為研究材料，采用堿浸酸析法提取橙皮苷，以堿的種類、堿添加量、提取溫度、提取時間、料液比進行單因素試驗，以堿添加量、提取溫度、提取時間、料液比進行L9(34)正交試驗優(yōu)化橙皮苷的提取工藝，以超高效液相色譜檢測驗證優(yōu)化結(jié)果。 [結(jié)果]影響柑橘皮中橙皮苷提取純化工藝因素大小依次為提取時間、堿添加量、提取溫度、料液比；1 g柑橘皮添加0.08 g的Ca(OH)2，提取時間0.5 h，溫度30 ℃，料液比1∶30 g/mL的工藝條件下能得到最佳提取效果，粗產(chǎn)品收率為4.5%。[結(jié)論]試驗所得優(yōu)化參數(shù)和提取工藝穩(wěn)定，選用的設(shè)備操作簡便、快速，具有良好的應(yīng)用前景。

橙皮苷；堿浸酸沉；提?。还に?；純化

橙皮苷屬于黃酮類化合物，其純品為白色針狀晶體，熔點為258～262 ℃(250 ℃開始軟化)，分子式為C28H34O15，相對分子量為610.57，能溶于稀堿和吡啶溶液，常溫下難溶于水，微溶于甲醇、乙醇、冰醋酸，無臭、無味[1-3]。橙皮苷具有降低毛細管的脆性，保護毛細血管，防止微血管破裂出血的功能，具有較好的抗氧化、降低血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒作用，是醫(yī)藥工業(yè)中重要的原料[4]，也是化妝品和食品添加劑的重要原料[5-7]。橙皮苷是柑橘皮中的主要成分，我國柑橘資源豐富，柑橘產(chǎn)量占世界第2位，橙皮苷提取原料來源充足，成本低廉。據(jù)調(diào)查，橙皮苷市場需求廣，產(chǎn)品價格高。因此，從柑橘果皮中提取橙皮苷，原料來源廣，有很好的市場開發(fā)前景，具有潛在的應(yīng)用價值[8]。

陜西漢中是我國傳統(tǒng)柑橘的產(chǎn)區(qū)，屬我國長江中上游柑橘優(yōu)勢栽培區(qū)域的北緣，年產(chǎn)柑橘超過40萬t，占全國產(chǎn)量的2%。漢中柑橘以鮮食為主，深加工率低。從2013年起，漢中陸續(xù)投產(chǎn)柑橘果酒生產(chǎn)線、柑橘罐頭生產(chǎn)線、柑橘鮮榨果汁生產(chǎn)線，提高了柑橘的深加工率及產(chǎn)品附加值，但柑橘皮多作為柑橘生產(chǎn)加工的廢料丟棄，造成了嚴重的資源浪費。鑒于此，開展柑橘皮綜合利用研究，合理處理柑橘加工的下腳料，對提高漢中柑橘的綜合利用率很有必要[9-10]。

現(xiàn)有報道中，橙皮苷提取方法主要有熱水提取、醇溶劑提取、雙水相提取、超聲波提取、微波提取、堿浸酸析等方法。熱水提取和醇溶劑提取工藝簡單但收率較低；超聲波提取、微波提取等雖然提取率高、提取時間短，但設(shè)備成本高，工藝要求較高。雙水相萃取操作簡單、高效、收率高，但該方法要求精度較高，放大用于規(guī)模化生產(chǎn)還有不少技術(shù)問題。堿浸酸析法工藝成熟，只消耗價格低廉的無機酸及堿，成本低且能得到較高收率[11-14]，是現(xiàn)在常用的一種方法，但關(guān)鍵的參數(shù)還需進一步優(yōu)化。

筆者采用堿浸酸析法對橙皮苷進行提取，研究了各種工藝參數(shù)對提取率的影響，采用超高效液相色譜法對結(jié)果進行驗證，確定了橙皮苷提取最優(yōu)工藝參數(shù)，以期為漢中柑橘綜合開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。2014年采摘于陜西漢中的柑橘，剝皮，柑橘皮經(jīng)烘箱45 ℃烘干、粉粹，備用。

1.1.2主要儀器。超高效液相色譜儀(UPLC)，美國waters儀器有限公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；CLF-06C型300 g密封型搖擺式粉碎機，浙江省溫嶺市創(chuàng)立藥材器械廠；101-OES型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器；pHS-3C型酸度計，上海雷磁；DK-98-11型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉儀器有限公司；BJBLAA-1000型玻璃砂蕊過濾器，北京華運安特科技有限責(zé)任公司。

1.1.3主要試劑。Na2CO3(分析純)、KOH(分析純)，西安化學(xué)試劑廠；NaOH(分析純)、鹽酸(分析純)，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；Ca(OH)2(分析純)，天津大茂化學(xué)試劑廠；甲醇(分析純)、乙醇(分析純)，天津百世化工有限公司。

1.2試驗原理橙皮苷在堿液條件下首先開環(huán)生成易溶于水的橙皮苷查爾酮，通過過濾，去除不溶于水的雜質(zhì)。濾液中的橙皮苷查爾酮在酸性條件下，關(guān)環(huán)生成水溶性較差的橙皮苷，過濾得到目標產(chǎn)物。

提取工藝流程為：首先將一定量的柑橘皮烘干研碎加入到蒸餾水中，加入一定量的堿調(diào)節(jié)pH至堿性，靜置，過濾，濾液加入酸，調(diào)節(jié)pH至酸性，靜置，待結(jié)晶后經(jīng)過濾、干燥，得到橙皮苷粗品。然后將橙皮苷粗產(chǎn)品加入到有機溶劑中，加入堿調(diào)節(jié)pH至堿性，靜置、過濾，濾液加入酸，調(diào)節(jié)pH至酸性，靜置待結(jié)晶，過濾，干燥后得到純化的橙皮苷目標產(chǎn)物。最后利用超高效液相色譜進行分析測定[15]。

1.3方法

1.3.1樣品干燥。將柑橘皮洗凈后放在室溫通風(fēng)處進行干燥至恒重，然后用高速萬能粉碎機進行粉碎至60目，裝入保鮮袋中進行避光密封保存。

1.3.2橙皮苷提取。將1 g橘皮粉加入到定量配置的堿液中，調(diào)節(jié)pH至堿性，反應(yīng)至一定時間后，減壓過濾，濾液加入0.1 mol/L 鹽酸，調(diào)節(jié)體系至酸性后，靜置12 h后，得到少量淡黃色固體，常壓過濾，再加入甲醇溶解后，用超高效液相色譜儀進行檢測。

1.3.3液相色譜儀分析檢測。按“1.3.2”方法得到的提取液在液相色譜條件下進行分析，比較溶液中橙皮苷的含量，確定最優(yōu)提取方法。色譜條件：Waters ACQUITY UPLC&BEH C18色譜柱(50.0 mm×2.5 mm，1.7 μm)；流動相A為乙睛，B為純水；采用梯度洗脫，A梯度為10%(0 min)-10%(1 min)-40%( 5 min)-10%(6 min)；檢測波長288 nm；流速為0.3 mL/min；進樣量5 μL；PDA檢測器；柱溫30 ℃[16]。

1.3.4單因素試驗。采用堿浸酸析法提取柑橘皮中的橙皮苷。分別就堿的種類[Na2CO3、 K2CO3、NaOH、KOH、Ca(OH)2]；堿的用量(0.04、0.06、0.08、0.10 g)；提取時間(0.5、1.0、2.0、4.0 h)；液料比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)；提取溫度(25、30、40、50、60 ℃)進行單因素試驗。

1.3.5正交試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計了4因素3水平正交試驗，重點研究堿的用量、提取溫度、提取時間、料液比4個因素對橙皮苷提取率的影響，確定橙皮苷提取的最佳工藝參數(shù)。正交試驗因素水平設(shè)計見表1。

1.3.6驗證試驗。稱取適量的柑橘皮，根據(jù)正交試驗所得的最佳工藝條件，進行3組平行試驗提取橙皮苷，驗證方法準確性。

表1　正交試驗因素水平設(shè)計

2　結(jié)果與分析

2.1超高效液相色譜分析結(jié)果按“1.3.3”的液相色譜方法，分別測定橙皮苷標準品和柑橘皮提取液，標準品色譜圖見圖1，樣品色譜圖見圖2。色譜分析方法經(jīng)穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗、精密度試驗、回收率試驗驗證，滿足分析檢測要求。

注：出峰時間為2.60 min的為橙皮苷。Note：Peak appearance time of hesperidin was at 2.60 min.圖1　橙皮苷標準品色譜Fig.1　Chromatogram for standard sample of hesperidin

注：出峰時間為2.60 min的為橙皮苷。Note：Peak appearance time of hesperidin was at 2.60 min.圖2　柑橘皮提取物色譜Fig.2　Chromatogram for extraction of citrus peel

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1橙皮苷提取工藝中堿的篩選。在提取溫度30 ℃，浸提時間0.5 h，堿用量0.06 g，料液比1∶30 g/mL的條件下，考察不同堿種類對橙皮苷色譜峰面積的影響。

試驗表明(圖3)，在加入堿量均為0.06 g的試驗條件下，選擇強堿的色譜峰峰面積最大，選擇弱堿峰面積小。這可能因為是弱堿的堿性太弱，無法使橘皮中的橙皮苷開環(huán)形成橙皮苷查爾酮有關(guān)。試驗結(jié)果同時顯示，強堿Ca(OH)2的處理效果最好，這與王靈果的試驗中用KOH和NaOH提取橙皮苷的產(chǎn)率高有差異[14]。

圖3　不同堿作用下橙皮苷色譜峰面積趨勢Fig.3　Chromatographic peak area of hesperidin under the effect of different alkalis

2.2.2橙皮苷提取工藝中堿用量的篩選。在提取溫度30 ℃，浸提時間0.5 h，堿為Ca(OH)2，料液比1∶30 g/mL的條件下，考察體系中不同堿用量對橙皮苷色譜峰面積的影響。

試驗發(fā)現(xiàn)(圖4)，體系中Ca(OH)2添加量大小對于橙皮苷的提取率有一定的影響。隨著體系中Ca(OH)2添加量的增加，橙皮苷的提取率先增加后減小。這是因為隨著體系中Ca(OH)2添加量的增加，使橘皮中更多的橙皮苷開環(huán)溶解在水相中，當達到一定的平衡后，隨著Ca(OH)2添加量增加，粗產(chǎn)品的收率反而略有下降。最終選擇在體系添加0.08 g的Ca(OH)2。

圖4　不同堿用量條件下橙皮苷峰面積變化趨勢Fig.4　Peak area of hesperidin under the different alkali weights

2.2.3橙皮苷提取工藝中提取時間的篩選。在提取溫度30 ℃，堿為Ca(OH)2，堿用量0.06 g，料液比1∶30 g/mL的條件下，考察不同浸提時間對橙皮苷色譜峰面積的影響。

試驗發(fā)現(xiàn)(圖5)，室溫下提取時間1 h，峰面積最高，為39 760，而提取時間的延長并不能明顯增加收率，反而明顯下降。這是因為堿液中的橙皮苷查爾酮對氧氣比較敏感，提取時間過長會導(dǎo)致橙皮苷查爾酮被氧化，因而降低橙皮苷提取率。

圖5　不同提取時間條件下橙皮苷峰面積趨勢Fig.5　Peak area of hesperidin under the different extraction times

2.2.4橙皮苷提取工藝中料液比的篩選。在提取溫度30 ℃，浸提時間0.5 h，堿為Ca(OH)2，堿用量0.06 g的條件下，考察不同料液比對橙皮苷色譜峰面積的影響。

試驗發(fā)現(xiàn)(圖6)，料液比1∶30 g/mL時橙皮苷的收率較高，峰面積可以達到42 672。而料液比中溶劑用量繼續(xù)增加，反而降低橙皮苷的提取率。當料液比為1∶50 g/mL時，峰面積只有27 836。這是因為料液比中溶劑用量的增加在一定程度上降低了堿的濃度，因此試驗選擇料液比為1∶30 g/mL。

圖6　不同料液比條件下橙皮苷峰面積趨勢Fig.6　Peak area of hesperidin under the different solid-liquid ratios

2.2.5橙皮苷提取工藝中提取溫度的篩選。在浸提時間0.5 h，堿為Ca(OH)2，堿用量0.06 g，料液比1∶30 g/mL的條件下，考察不同提取溫度對橙皮苷色譜峰面積的影響。

圖7　不同溫度條件下橙皮苷峰面積趨勢Fig.7　Peak area of hesperidin under the different temperatures

試驗發(fā)現(xiàn)(圖7)，在30 ℃條件下，橙皮苷的提取率較高，峰面積可以達到43 066。而隨著提取溫度的升高，橙皮苷的提取率反而降低。當提取溫度60 ℃時，峰面積只有16 296。這是因為堿液中的橙皮苷查爾酮對于溫度比較敏感，提取溫度的升高，加速橙皮若查爾酮的氧化，會降低粗產(chǎn)品的收率，因此提取溫度確定為30 ℃。

2.3正交試驗正交試驗及極差分析結(jié)果如表2所示，可知4個因素對橙皮苷提取得率的影響大小依次為A、B、D、C，即提取時間、堿用量、提取溫度、料液比，其中A、B為主要影響因素，可以選出最佳水平為A1B3C2D2，即提取時間0.5 h，堿用量0.08 g，料液比為1∶30 g/mL，提取溫度30 ℃。

表2　正交試驗結(jié)果

2.4驗證試驗在正交試驗得出的優(yōu)化工藝條件下進行了3次重復(fù)試驗驗證，最佳提取條件下橙皮苷的峰面積為38 996，RSD值為2.3%。因此可得，優(yōu)選的條件穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，該最佳工藝條件合理。經(jīng)過計算得出，粗產(chǎn)品的收率為4.5%。

3　結(jié)論與討論

該試驗通過對堿的種類、堿的添加量、料液比、提取時間及提取溫度等因素的研究，確定了影響柑橘皮中橙皮苷提取的因素。研究確定了柑橘皮中橙皮苷提取的最佳工藝條件為：30 ℃下，1 g的橙皮粉中加入30 mL蒸餾水，0.08 g Ca(OH)2，攪拌浸提0.5 h。與熱水提取法、醇溶劑提取法、雙水相提取法等方法相比，堿浸酸析法具有試劑簡單、提取率高、成本低等優(yōu)點，可作為工業(yè)化生產(chǎn)提取柑橘皮中橙皮苷的首選工藝。

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Extraction Process of Hesperidin in Citrus Optimized by L9(34) Orthogonal Test

DU Huan-huan1, ZHANG Han1, JING Xian1, JIANG Hai1, 2, 3*et al

1. School of Biological Science and Engineering, Shaanxi Sci-Tech University, Hanzhong, Shaanxi 723000; 2. Shaanxi Provincial Key Laboratory of Bio-resources, Hanzhong, Shaanxi 723000; 3. Collaborative Innovation Center for Comprehensive Development of Bio-resources in Qinba Mountainous Area of Southern Shaanxi, Hanzhong, Shaanxi 72300)

[Objective] In order to carry out the research on extraction and purification process of hesperidin in citrus peel, make full use of abundant citrus resources in Hanzhong and increase the added economical value. [Method] Taking the Hanzhong citrus peel as research material, hesperidin was extracted by alkali extraction and acid precipitation method. The single factor experiment was carried out with the kinds of alkali, alkali content, extraction temperature, extraction time and the ratio of material to liquid. Alkali dosage, extraction temperature, extraction time and solid-liquid ratio were studied by L9(34) orthogonal test to optimize the extraction technology of hesperidin. The ultra performance liquid chromatography was used to test the optimization results. [Result] The sequence for the factors affecting extraction and purification process of hesperidin in citrus peel was extraction time, alkali weight, extraction temperature and the ratio of material to liquid. When the process conditions were 0.08 g of Ca(OH)2per gram citrus peel, extraction time 0.5 h, temperature 30 ℃, and the material and liquid ratio 1∶30 g/mL, the best extraction effect could be obtained. The yield rate of crude product was 4.5%. [Conclusion] The optimization parameters and extraction process obtained in the test were stable, and the operation of selected equipment was simple and rapid, which had good application prospects.

Hesperidin; Alkali extraction-acid precipitation; Extraction; Process; Purification

陜西省教育廳項目(14JS018)。

杜歡歡(1991- )，男，陜西咸陽人，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制技術(shù)研究。*通訊作者，高級實驗師，碩士生導(dǎo)師，從事食品質(zhì)量與安全控制技術(shù)研究。

2016-06-27

S 609；S 666

A

0517-6611(2016)26-0041-04