微量生物樣品中糖蛋白N-糖鏈電噴霧電離質(zhì)譜分析前處理方法的建立

張 英 劉 影 劉 洋 強(qiáng) 珊 楊冰瑩 黃琳娟 王仲孚

（西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069）

微量生物樣品中糖蛋白N-糖鏈電噴霧電離質(zhì)譜分析前處理方法的建立

張 英 劉 影 劉 洋 強(qiáng) 珊 楊冰瑩 黃琳娟 王仲孚*

（西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069）

基于電噴霧電離質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，建立了一種可靠、高效、簡(jiǎn)單，適合于微量糖蛋白N-糖鏈解離、富集純化的方法。以糖蛋白牛胰核糖核酸酶（Rib B）和卵清白蛋白（OVA）為模型蛋白直接酶解，比較了4種方法純化酶解樣品的效果。比較了直接酶解和經(jīng)過聚偏氟乙烯（PVDF）膜富集后酶解微量復(fù)雜生物來源樣品胎牛血清的酶解效果，最終建立了微量生物樣品中糖蛋白N-糖鏈的質(zhì)譜分析前處理方法。采用PVDF膜吸附復(fù)雜生物樣品中的糖蛋白，N-糖苷酶F（PNGase F）酶直接在膜上完成糖鏈釋放（37℃，24 h），采用微晶纖維素柱結(jié)合石墨碳柱對(duì)糖鏈進(jìn)行富集純化，用于微克級(jí)胎牛血清和健康人血清中N-糖鏈質(zhì)譜分析的前處理。本方法通用性好，在微量生物樣品糖鏈質(zhì)譜分析檢測(cè)的前處理方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。

微量分析；糖蛋白；N-糖鏈；電噴霧質(zhì)譜；前處理

1 引言

蛋白質(zhì)糖基化是真核細(xì)胞中最常見的翻譯后修飾，對(duì)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。糖蛋白上的糖鏈具有高度的微不均一性，在癌癥、衰老等不同的病理生理?xiàng)l件下會(huì)發(fā)生變化［1］。以糖鏈作為研究對(duì)象，篩選癌癥血清標(biāo)志物，可以為癌癥的早期診斷、預(yù)后、治療反應(yīng)預(yù)測(cè)和群體篩查開辟新的途徑［2］。

血清中糖蛋白的特點(diǎn)是微量、成分復(fù)雜、糖鏈含量更少。質(zhì)譜技術(shù)具有微量、快速、準(zhǔn)確和高通量的優(yōu)點(diǎn)，能滿足對(duì)微量糖鏈的分析，為研究生物來源樣品提供了強(qiáng)有力的手段［3］。但質(zhì)譜技術(shù)對(duì)復(fù)雜生物樣品的前處理要求高，樣品中的雜質(zhì)會(huì)影響糖鏈的質(zhì)譜分析。血清成分十分復(fù)雜，含有大量蛋白質(zhì)，以及很多小分子物質(zhì)如鹽類、脂類和游離糖等［4］，給糖組研究帶來困難。聚偏氟乙烯（PVDF）膜由于帶有負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)中的帶正電氨基酸吸附結(jié)合，已廣泛應(yīng)用于蛋白的吸附和轉(zhuǎn)移［5］。在PVDF膜上采用最常用的N-糖苷酶F（PNGase F）［6］酶解法釋放N-糖鏈，解離后的糖鏈常與蛋白質(zhì)變性劑、緩沖劑以及肽段等雜質(zhì)混在一起，導(dǎo)致糖鏈的信號(hào)被嚴(yán)重抑制。另外，高豐度糖鏈還會(huì)掩蓋低豐度糖鏈，降低了樣品中全部糖鏈被鑒定的幾率。因此在糖鏈的質(zhì)譜分析中，對(duì)解離后的樣品進(jìn)行純化和富集至關(guān)重要。常用的方法有石墨碳柱、C18柱、陽離子交換樹脂、Bio-Gel P4或Sephadex G10等，但這些方法的純化效果不穩(wěn)定，應(yīng)用時(shí)有一定的局限性。Bio-Gel P4和Sephadex G10均屬于凝膠排阻色譜，填料前處理步驟復(fù)雜，純化效率緩慢，不適于高通量純化游離糖鏈。離子交換樹脂對(duì)糖鏈無保留，通過H+和鹽類陽離子的交換達(dá)到除鹽的目的，但可能會(huì)造成帶電荷糖鏈的丟失。C18柱能夠吸附水溶液中的疏水性物質(zhì)，比如蛋白質(zhì)，但對(duì)親水物質(zhì)例如糖鏈只有很弱的親和力，因此C18柱常被用于分離蛋白質(zhì)與糖鏈。石墨碳柱基于填充劑與樣品的疏水相互作用，以及電子受體-供體之間的相互作用，不但可以快速分離糖鏈和蛋白質(zhì)，還能除去鹽類、去垢劑等。微晶纖維素柱能夠吸附極性較大的物質(zhì)，但對(duì)疏水性的物質(zhì)吸附能力弱，因此被用于糖鏈與疏水性雜質(zhì)的分離純化［7～9］。但在實(shí)際樣品分析時(shí)，單一使用一種方法得到的樣品往往無法滿足質(zhì)譜分析的要求，經(jīng)常由于雜質(zhì)的干擾而造成質(zhì)譜信號(hào)丟失。因此需要聯(lián)合使用這些方法，實(shí)現(xiàn)糖鏈的有效富集和純化。

本研究以糖蛋白牛胰核糖核酸酶（Rib B）和卵清白蛋白（OVA）為模型蛋白，采用PVDF膜吸附糖蛋白，PNGase F直接在膜上完成糖鏈釋放。比較了常用色譜柱聯(lián)合使用對(duì)糖鏈的純化效果，最終確定采用微晶纖維素柱結(jié)合石墨碳柱對(duì)糖鏈進(jìn)行富集純化，進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)前的樣品制備。將本方法應(yīng)用于微克級(jí)微量復(fù)雜生物樣品如人和胎牛血清中N-糖鏈質(zhì)譜分析的前處理，效果良好。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LTQ-XL電噴霧電離質(zhì)譜儀（ESI，美國(guó)Thermo Finnigan公司）。雞卵清白蛋白（OVA）、微晶纖維素填料、陽離子交換樹脂均為Sigma公司產(chǎn)品；N-糖苷酶F（PNGase F，美國(guó)Bio-Rad公司）；牛胰核糖核酸酶B（Rib B，Worthington公司）；胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin，1∶250）、聚偏氟乙烯膜（PVDF，0.45μm）均購(gòu)自西安舟鼎國(guó)有限公司；石墨碳柱、C18小柱（美國(guó)Waters公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。健康人O型Rh（+）血清由西安交通大學(xué)附屬醫(yī)院提供；實(shí)驗(yàn)用水由Millipore Integral制備。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜分析條件參考文獻(xiàn)［9］。電噴霧離子源（ESI）；正負(fù)離子模式掃描，掃描范圍為中分子量端m/z 150～2000及高分子量端m/z 2000～4000；電噴霧電壓：4.00 kV；鞘氣（N2）：30.00 arb；輔助氣（N2）：5.00 arb；吹掃氣（N2）：0 arb；離子傳輸毛細(xì)管溫度：300℃；管透鏡電壓：250V；進(jìn)樣量2 μL，流動(dòng)相是50%甲醇，流速為200 μL/min。

2.3 N-糖鏈的解離方法

2.3.1 方法1［10］50 μg糖蛋白溶于100 μL蛋白質(zhì)變性液，沸水浴10 min，冷卻至室溫，加10 μL酶解緩沖液（1.9 g Na3PO4溶于10 mL水中，pH 7.5），10%NP40（乙基苯基聚乙二醇）及0.25 μL PNGase F，37℃反應(yīng)24 h。

2.3.2 方法2（改進(jìn)N-糖鏈解離方法）將PVDF膜剪成約2 mm×2 mm的小塊，用70%甲醇潤(rùn)洗3次使其充分活化，然后水洗5次除去甲醇。在PVDF膜表面滴加5 μL血清樣品，室溫孵育1 h；在PVDF膜還未干燥時(shí)迅速用水輕微潤(rùn)洗3次，然后放入離心管中，后續(xù)的糖鏈解離酶解反應(yīng)如方法1所述。

2.4 糖鏈的富集純化方法

2.4.1 微晶纖維素純化方法［9］將微晶纖維素粉末裝入層析柱（30 mg/mL）中，用約50倍柱體積的水充分洗去填料中的雜質(zhì)；再用約3倍柱體積洗脫液（正丁醇-甲醇-水，4∶1∶1，V/V）平衡柱子；上樣后，用約50倍柱體積平衡液洗脫除去蛋白質(zhì)或多肽雜質(zhì)；最后分管收集2倍柱體積的水洗脫液，即為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.4.2 陽離子交換樹脂純化方法［11］將樹脂裝入層析柱（30 mg/mL）中，用約5倍柱體積水洗去填料中的雜質(zhì)；樣品用水溶解，上樣，直接分管收集2倍柱體積的水洗脫液，即為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.4.3 C18柱純化方法［12］用5倍柱體積的乙腈活化C18柱（100 mg/mL），然后用5倍柱體積的5%乙酸溶液平衡柱子，上樣，直接分管收集2倍柱體積的洗脫液，即為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.4.4 石墨碳柱純化方法［12］用5倍柱體積乙腈活化石墨碳柱（37.5 mg/mL），再用5倍柱體積的水平衡柱子；上樣后，用50倍柱體積水除去鹽、蛋白質(zhì)和多肽等雜質(zhì)；最后用0.1%三氟乙酸-25%乙腈洗脫糖鏈，分管收集2倍柱體積洗脫液，即為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.5 N-糖鏈富集純化方法的優(yōu)化

分別采用微晶纖維素結(jié)合陽離子交換樹脂（圖1A）、C18柱結(jié)合石墨碳柱（圖1B）、C18柱結(jié)合陽離子交換樹脂柱（圖1C）、石墨碳柱結(jié)合微晶纖維素柱（圖1D）的方法，對(duì)糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Rib B和OVA中的N-糖鏈進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 N-糖鏈富集純化方法的考察

以標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白R(shí)ib B和OVA為模型，考察了對(duì)單一蛋白酶解后糖鏈的富集純化方法。發(fā)現(xiàn)石墨碳柱結(jié)合微晶纖維素法純化得到的樣品質(zhì)譜信號(hào)相對(duì)較好。圖2是Rib B酶切后用上述石墨碳柱結(jié)合微晶纖維素柱富集純化后得到的質(zhì)譜圖。每條糖鏈都有兩種加和峰，即［M+H］+和［M+Na］+，對(duì)應(yīng)著質(zhì)譜圖上的5組峰，與文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致，證明了上述純化方法在樣品質(zhì)譜分析前處理的可行性。石墨碳柱具有同時(shí)除去蛋白和鹽類等雜質(zhì)的能力，而且除鹽、表面活性劑等雜質(zhì)的效果較為顯著；微晶纖維素柱能夠很好地分離蛋白、多肽與游離糖鏈，除蛋白能力較強(qiáng)。聯(lián)合使用兩種技術(shù)，綜合其優(yōu)點(diǎn)，效果良好。

圖1 N-糖鏈富集純化的4種方法Fig.1 Four methods for purifying and enriching N-linked glycans from mixture

圖3是OVA酶切后用上述石墨碳柱結(jié)合微晶纖維素柱富集純化后檢測(cè)得到的質(zhì)譜圖。共檢測(cè)到18條糖鏈的單糖組成，結(jié)果與文獻(xiàn)［13］一致，同樣證實(shí)了該糖鏈純化方法的可行性。

3.2 微量復(fù)雜生物樣品中糖蛋白N-糖鏈質(zhì)譜檢測(cè)前處理方法的建立

3.2.1 N-糖鏈解離方法以生物樣品胎牛血清為例，分別用方法1和2解離N-糖鏈，石墨碳柱結(jié)合微晶纖維素柱富集純化，質(zhì)譜檢測(cè)。圖4是胎牛血清樣品用方法1解離得到的N-糖鏈的質(zhì)譜圖，雜質(zhì)峰較高，基線不平穩(wěn)，對(duì)低豐度糖鏈的分析鑒定干擾較大，只檢測(cè)到4條主要糖鏈。圖5是用PVDF膜法（方法2）得到的N-糖鏈的質(zhì)譜圖，改進(jìn)的糖鏈解離方法能顯著增強(qiáng)后續(xù)的富集純化效果，除與圖4一致的4條糖鏈外，還出現(xiàn)了不同程度唾液酸化的N-糖鏈，糖鏈歸屬見表1，結(jié)果與文獻(xiàn)［14］一致，說明與傳統(tǒng)方法相比，所建立的方法富集純化效果更好，可以得到更豐富的糖鏈信息。

圖2 Rib B N-糖鏈的正離子模式的ESI-MS分析譜圖Fig.2 Positive ion ESI-MS spectrum of N-linked glycans from bovine ribonuelease B（Rib B）

圖3 雞卵清白蛋白N-糖鏈的正離子模式的ESI-MS分析譜圖Fig.3 Positive ion ESI-MS spectrum of N-linked glycans from ovalbumin from chicken egg white

圖4 直接酶解的胎牛血清N-糖鏈的ESI-MS分析譜圖Fig.4 ESI-MS analysis of N-linked glycans from fetal bovine serum by direct enzymolysis

圖5 PVDE膜富集后酶解的胎牛血清中N-糖鏈的負(fù)離子模式的ESI-MS分析譜圖Fig.5 Negative ion analysis of N-linked glycans from fetal bovine serum by enzymolysis after polyvinylidene fluoride（PVDF）enrichment

表1 胎牛血清中N-糖鏈的結(jié)構(gòu)推測(cè)表Table 1 Composition of N-linked glycans from fetal bovine serum

3.2.2人血清N-糖鏈的質(zhì)譜分析前處理方法以5 μL健康人血清為研究對(duì)象，直接使用方法2進(jìn)行酶解，并對(duì)酶解后樣品用上述4種糖鏈富集純化方法（微晶纖維素柱結(jié)合陽離子交換樹脂柱、C18柱結(jié)合石墨碳柱、C18柱結(jié)合陽離子交換樹脂柱和石墨碳柱結(jié)合微晶纖維素柱）進(jìn)行富集純化，考察各個(gè)方法富集純化微量生物樣品的效果。結(jié)果表明，前3種方法的純化效果均不穩(wěn)定，通用性不強(qiáng)，常導(dǎo)致純化失敗，表現(xiàn)為兩類特征：（1）無目標(biāo)峰，雜質(zhì)峰呈典型的正態(tài)分布狀（如圖6A所示的微晶纖維素結(jié)合陽離子法，而 C18結(jié)合陽離子柱結(jié)果與其相似，質(zhì)譜圖略），此類譜圖表明樣品中還含有大量蛋白雜質(zhì)；（2）雜質(zhì)峰信號(hào)強(qiáng)度太高，掩蓋了低豐度的目標(biāo)峰。例如，圖6B（C18結(jié)合石墨碳）所示的譜圖中，4個(gè)分子離子峰是目標(biāo)峰，未檢測(cè)到文獻(xiàn)［15］報(bào)道的低豐度糖鏈。這可能由于樣品中仍然存在表面活性劑SDS等雜質(zhì)，降低了糖鏈的離子化效率，基線漂移。

圖6 純化失敗的健康人血清N-糖鏈的正離子模式的ESI-MS分析譜圖Fig.6 MS spectra of N-linked glycans subjected to a failing purification in healthy human serum glycoproteins by positive ion ESI-MS analysis

對(duì)上述酶解后的樣品，采用石墨碳柱結(jié)合微晶纖維素柱進(jìn)行富集純化，結(jié)果令人滿意。進(jìn)一步對(duì)該純化方法進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)。在用石墨碳柱進(jìn)行純化時(shí)，為避免被吸附的游離糖鏈洗脫不完全，改用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈溶液作洗脫劑。由于微晶纖維素的前處理時(shí)間與裝柱填料的多少成正比，根據(jù)上樣量調(diào)整裝柱填料量，能有效減少純化時(shí)間。對(duì)微量生物樣品糖蛋白的N-糖鏈進(jìn)行富集純化，只需要少量的微晶纖維素填料，可大大減少純化時(shí)間。采用本方法處理人血清樣品，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果見圖7和圖8。結(jié)果表明，人血清糖蛋白上的N-糖鏈含量多，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，既有中性糖又有酸性糖，能夠同時(shí)在正、負(fù)離子模式下檢測(cè)到，并且單電荷和多電荷形式同時(shí)存在。在正離子模式下檢測(cè)到30條中性糖鏈，其中22條與文獻(xiàn) ［8，16］一致；新發(fā)現(xiàn)8條糖鏈，即 m/z 1444.33，1688.42，1751.17，1954.42，2151.17，1083.75，2427.83和2289.18。在負(fù)離子模式下，共檢測(cè)了16條糖鏈，其中12條糖鏈與文獻(xiàn)［8，16］一致，新發(fā)現(xiàn)4條糖鏈，即m/z 2133.00，2295.91，2384.00和791.67，其單糖組成見表2和表3。

圖7 健康人血清中N-糖鏈的正離子模式的ESI-MS分析譜圖Fig.7 Positive ion ESI-MS analysis of N-linked glycans from a control human serum

上述結(jié)果表明，經(jīng)過改進(jìn)的微量生物來源樣品N-糖鏈質(zhì)譜前處理純化方法，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了分離、純化、濃縮過程，操作簡(jiǎn)單，適用于微量樣品的檢測(cè)前處理。

圖8 健康人血清中N-糖鏈的負(fù)離子模式的ESI-MS分析譜圖Fig.8 Negative ion ESI-MS analysis of N-linked glycans from a control human serum

表2 正離子模式下人血清中N-糖鏈的結(jié)構(gòu)推測(cè)表Table 2 Composition of N-linked glycans from a control human serum in positive ion mode

表3 負(fù)離子模式下人血清中N-糖鏈的結(jié)構(gòu)推測(cè)表Table 3 Composition of N-linked glycans from a control human serum in negative ion mode

4 結(jié)論

糖組研究的首要目標(biāo)是盡可能獲得樣品中全部的糖鏈。由于糖鏈種類多，豐度不一，相對(duì)于蛋白質(zhì)的含量差距懸殊等，要獲得所有的糖鏈，首先要采用合適的糖鏈解離方法；其次要選擇合適的富集純化方法。

本研究在電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了更適合于微量生物來源樣品糖蛋白N-糖鏈解離、富集純化的方法。本方法利用PVDF膜富集復(fù)雜生物樣品中糖蛋白，用PNGase F直接在膜上完成糖蛋白中糖鏈的解離；同時(shí)提高糖鏈解離純化效率。通過比較幾種糖鏈富集純化方法，最終篩選出微晶纖維素柱結(jié)合石墨碳柱進(jìn)行糖鏈的富集純化的方法，并成功應(yīng)用于微量生物來源樣品如血清中（μg級(jí)）糖蛋白的N-糖鏈的質(zhì)譜分析前處理。本方法快速、穩(wěn)定、通用性好，能夠用于N-糖鏈的高通量制備，有利于糖鏈定量分析和結(jié)構(gòu)解析研究。

1 El-Serag H B，Marrero J A，Rudolph L，Reddy K R.Gastroenterology，2008，134（6）：1752-1763

2 Zhang Y，Yuan J B，Song J J，Wang Z F，Huang L J.Glycobiology，2013，23（6）：643-653

3 WANG Rui-Guo，SU Xiao-Ou，CHENG Fang-Fang，WANG Pei-Long，F(xiàn)An-Xia，ZHANG Wei.Chinese J.Anal.Chem.，2015，43（2）：264-270

王瑞國(guó)，蘇曉鷗，程芳芳，王培龍，樊霞，張維.分析化學(xué)，2015，43（2）：264-270

4 Alley W R，Vasseur J A，Goetz J A，Syoboda M，Mann B F，Matei D E，Menning N，Hussein A，Mechref Y，Novotny MV.J.Proteome Res.，2012，11（4）：2282-2300.

5VanhoorenV，Liu X E，F(xiàn)ranceschi C，Chun-Fang Gaod C F，Liberta C，Contrerasa R，Chen C.Mech.Ageing Dev.，2009，130（1）：92-97

6 Marginean I，Kronewitter S R，Moore R J，Slysz G W，Monroe M E，Anderson G，Tang K，Smith R D.Anal.Chem.，2012，84（21）：9208-9213.

7 Packer N H，Lawson M A，Jardine D R，Redmond J W.Glycoconjug.J.，1998，15（8）：737-747

8 Kang P，Mechref Y，Kyselova Z，Goetz J A，Novotny MV.Anal.Chem.，2007，79（16）：6064-6071

9 Zhang Y，Wang Z，Zhang X，Zhou W，Huang L.Carbohyd.Res.，2011，346（14）：2156-2164

10 Kim Y G，Jeong H J，Jang K S，Yang Y H，Song Y S，Chung J，Kim B G.Anal.Biochem.，2009，391（2）：151-153

11 Fauquenoy S，Morelle W，Hovasse A，Bednarczyk A，Slomianny C，Schaeffer C，Dorsselaer AV，Tomavo S.Mol.Cell Proteomics，2008，7（5）：891-910

12 Kyselova Z，Mechref Y，Al Bataineh M M，Dobrolecki L E，Hickey R J，Vinson J，Sweeney C J，Novotny MV. J.Proteome Res.，2007，6（5）：1822-1832

13 Harvey D J.J.Am.Soc.Mass Spectrom.，2000，11（10）：900-915

14 Green E D，Adelt G，Baenziger J U.J.Biol.Chem.，1988，263：18253-18268

15 Takasaki S，Mizuochi T，Kobata A.Method Enzymol.，1982，83：263-268

16 Harvey D J，Royle L，Radcliffe C M，Rudd P M，Dwek R A.Anal.Biochem.，2008，376（1）：44-60

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.31170773，31370804 and 31300678 ）

Pretreatment Method for Detecting of N-linked Glycans of Glycoprotein in Micro-scale Complex Biological Sample based on Electrospray Ionization Mass Spectrometry

ZHANG Ying，LIU Ying，LIU Yang，QIANG Shan，YANG Bing-Ying，HUANG Lin-Juan，WANG Zhong-Fu*
（Life Science College，Northwest University，Xi′an 710069，China）

A reliable，efficient and simple method was developed for releasing，enrichment and purification of N-glycan from glycoprotein based on electrospray ionization mass spectrometric （ESI-MS）detection technology.The bovine ribonuclease B（Rib B）and ovalbumin were used as model glycoprotein samples andsubjected to direct enzymolysis to investigate the purification effects of four different purification methods.Then the enzymatic efficiency of micro-scale complex fetal bovine serum sample subjected to direct and indirect enzymolysis after polyvinylidene fluoride（PVDF）membrane enrichment was fully investigated.Finally，a pretreatment method of N-linked glycans from glycoprotein in micro-scale complex biological sample analyzed by ESI-MS was established.The PNGase F was exploited for directly releasing of glycans from glycoprotein enriched on PVDF membrane（37℃，24 h）.Then microcrystalline cellulose chromatography column combined with graphite carbon chromatography column was used to enrich and purify glycans from enzymolysis products.The assay was eventually applied to pretreatment of N-glycan in micro-scale biological samples（μg level）of fetal bovine serum and healthy human serum for MS analysis.The method with universality showed good prospects in pretreatment of N-glycan in micro-scale biological sample for MS analysis.

Micro-scale analysis； Glycoprotein； N-Linked glycans； Electrospray ionization mass spectrometry；Pretreatment

11 April 2015；accepted 7 July 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150119

2015-04-11收稿；2015-07-07接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金（Nos.31170773，31370804，31300678）資助

*E-mail：wangzhf@nwu.edu.cn