基于凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的模型研究*

覃弘宇，李　銀，李定祥，鄧奕輝

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410208)

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論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.007

基于凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的模型研究*

覃弘宇，李銀，李定祥，鄧奕輝△

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410208)

目的探索凝血酶合并缺氧對(duì)PC12細(xì)胞損傷的最佳反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，為進(jìn)一步研究凝血酶在缺血性腦損傷中的意義提供實(shí)驗(yàn)方法。方法建立體外缺氧合并凝血酶誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型。按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法，采用三氣培養(yǎng)箱(1%O2，5%CO2，94%N2)和無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液造成細(xì)胞缺氧模擬缺血，并同時(shí)加入不同濃度的凝血酶(0、50、100、150和200 U/mL)，再將每組都作用于1、6、12、24 h后，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)分析細(xì)胞的存活率、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡程度。結(jié)果隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)和凝血酶濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，TUNEL細(xì)胞陽(yáng)性率和凋亡率逐漸升高。低濃度凝血酶(50 U/mL)在缺氧1 h后，與對(duì)照組(0 U/mL)相比細(xì)胞存活率有所升高，提示低凝血酶可能有保護(hù)作用。尤以缺氧12 h后開(kāi)始細(xì)胞損傷更為明顯，150 U/mL凝血酶組作用12 h后與對(duì)照組相比細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01),凋亡率顯著增加(P<0.05)；且200 U/mL凝血酶作用12 h和150、200 U/mL凝血酶組作用24 h后細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論150 U/mL凝血酶在缺氧作用12 h后為研究凝血酶合并缺氧對(duì)PC12細(xì)胞損傷的最佳模型條件。

PC12細(xì)胞；凝血酶；缺氧；細(xì)胞損傷

急性缺血性卒中 (acute ischemic stroke，AIS) 是最常見(jiàn)腦卒管疾病之一，占各類腦卒中(stroke)的60%～80%[1]。因血液循環(huán)障礙,如缺血、缺氧等所致的局限性腦組織的缺血性壞死和軟化，所以該病具有發(fā)病急、治療時(shí)間窗短、致殘率及復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)[2]。AIS的基本病理過(guò)程是腦血管阻塞和隨之發(fā)生的腦細(xì)胞損傷，其發(fā)生機(jī)制的學(xué)說(shuō)主要有能量耗竭、興奮性氨基酸毒性、梗死灶周邊半暗帶去極化、炎性細(xì)胞因子、鈣離子超載、一氧化氮(NO)和自由基損傷、細(xì)胞凋亡等[3-6]。近年來(lái)，凝血酶在AIS發(fā)生發(fā)展中的作用受到了學(xué)術(shù)界的重視[7-8]，以凝血酶作為藥理作用靶點(diǎn)來(lái)研究AIS具有重要價(jià)值；腦缺血的模型報(bào)道有很多，為模擬機(jī)體內(nèi)急性缺血的損傷機(jī)制，通常以建立體外的腦缺血細(xì)胞模型來(lái)模擬缺血性腦損傷；而因PC12細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)刺激誘導(dǎo)后可以向交感神經(jīng)元分化，而具有神經(jīng)元功能[9]；故本實(shí)驗(yàn)利用PC12細(xì)胞在凝血酶合并缺氧的環(huán)境下模擬腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞，觀察不同凝血酶濃度對(duì)細(xì)胞損傷的情況，探索其損傷的最佳時(shí)間點(diǎn)，從而為研究腦缺血合并凝血酶細(xì)胞損傷的機(jī)制和藥物防治提供實(shí)驗(yàn)方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑胰蛋白酶(Sango公司)，DMEM HIGH GLUCOSE(1X)培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone試劑公司,批號(hào)NAC1362)；鏈霉素青霉素混合溶液(100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素)、磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2)均購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清(美國(guó)HyClone試劑公司,批號(hào) NWK0489)；凝血酶(中國(guó)Solarbio試劑公司 批號(hào) 106A069)；二甲基亞砜(DMSO,美國(guó)MP Biomedicals，批號(hào)196055)；噻唑藍(lán)(3-4,5-dimethyl-2-thiazoly-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT，中國(guó)Solarbio公司，批號(hào)M8181)。TUNEL試劑盒(瑞士Roche試劑公司，批號(hào)11684817910)。

1.1.2細(xì)胞 PC12細(xì)胞，來(lái)源于大鼠的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(高分化，永生性)，購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司，編號(hào)2015032007。

1.1.3主要儀器倒置顯微鏡(重慶，型號(hào)：XDS-1B)，普通二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)賀利氏，Heracell)，三氣培養(yǎng)箱(Thermo，3131)，SP-756型紫外分光光度計(jì)(上海光譜，ZW0907060805)，酶標(biāo)儀(美國(guó)，ELX800)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及缺氧合并凝血酶損傷模型的建立PC12細(xì)胞以含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液一次，待細(xì)胞成長(zhǎng)融合后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.18 mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后再加終濃度為50 μg/L的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)分化并繼續(xù)培養(yǎng)72 h后[5]，吸棄原培養(yǎng)液；將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，分別為0 U/mL凝血酶組(對(duì)照組)、50 U/mL凝血酶組，100 U/mL凝血酶組，150 U/mL凝血酶組和200 U/mL凝血酶組。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，分別加入0、50、100、150、200 U/mL濃度的凝血酶10 μL和100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中(5%CO2，1%O2，94%N2)培養(yǎng)模擬缺氧缺血過(guò)程。不同濃度凝血酶組按1、6、12、24 h時(shí)間點(diǎn)依次培養(yǎng)孵育后取出。制備不同濃度(0、50、100、150、200 U/mL)不同時(shí)間點(diǎn)(1、6、12、24 h)缺氧合并凝血酶損傷模型。

1.2.2指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1細(xì)胞生存率測(cè)定[四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT法)]分別取上述不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞檢測(cè)，加10 μL 5 mg/mL的MTT于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去上清液加150 μL的DMSO，振蕩10 min后于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值(A)。A值越大，表明細(xì)胞存活率越高，細(xì)胞損傷越小。

1.2.2.2細(xì)胞凋亡率檢測(cè)(TUNEL檢測(cè))細(xì)胞固定爬片后，去掉孔板中的培養(yǎng)基加入固定液固定后，吸棄固定液加破膜工作液覆蓋爬片，常溫下孵育10 min，取Tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按1∶9混合，用錫紙包住平放于水浴鍋內(nèi)，滴加適量DAPI染液到爬片上，室溫避光孵育5 min，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

2　結(jié)　果

2.1NGF誘導(dǎo)前后PC12細(xì)胞形態(tài)的變化初次復(fù)蘇PC12細(xì)胞在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)，胞體圓形，處于游離期細(xì)胞貼壁能力較差，易聚集成團(tuán)，呈半懸浮狀態(tài)；培養(yǎng)24 h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)并分裂增殖，吸附期PC12細(xì)胞在培養(yǎng)基中多呈橢圓或多角形，傾向于聚集成團(tuán)簇狀；培養(yǎng)約72 h后，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞快速生長(zhǎng)和分裂，細(xì)胞折光性強(qiáng)，數(shù)目明顯增多。NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)元樣細(xì)胞的培養(yǎng)后，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增加，細(xì)胞長(zhǎng)出突觸增粗增長(zhǎng)，貼壁牢固；培養(yǎng)7 d后基本無(wú)法消化傳代；培養(yǎng)10 d后細(xì)胞進(jìn)入衰退期。形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)24 h可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)出較短、較細(xì)的突觸；48 h突觸數(shù)量及長(zhǎng)度增加；72 h突觸長(zhǎng)度可達(dá)胞體的4～5倍，交織成網(wǎng)狀，呈典型的神經(jīng)元形態(tài)，占總數(shù)96%以上。

2.2細(xì)胞存活率變化隨著時(shí)間的缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)和凝血酶濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降。50 U/mL凝血酶組在缺氧1 h后，與對(duì)照組相比細(xì)胞存活率有所升高，提示低凝血酶可能有保護(hù)作用。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降(圖1)，1、6、12、24 h均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞損傷，尤以缺氧12 h后細(xì)胞損傷更為明顯，150、200 U/mL凝血酶組作用12 h后與對(duì)照組相比細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)表1。

圖1　各時(shí)間短不同濃度凝血酶的作用

組別1h6h12h24h對(duì)照組0．8217±0．02230．7456±0．02100．6913±0．01780．6179±0．016450U/mL凝血酶組0．8517±0．02120．7312±0．02090．6639±0．01650．5839±0．0155100U/mL凝血酶組0．8091±0．02080．7156±0．01980．6544±0．01610．5771±0．0145150U/mL凝血酶組0．7968±0．01990．7074±0．01980．5573±0．0156b0．4980±0．0123b200U/mL凝血酶組0．7852±0．01770．6770±0．0153a0．4777±0．0122b0．4319±0．0098b

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組相比。

2.3TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡程度比較TUNEL熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，見(jiàn)極少量的綠色熒光，細(xì)胞核形狀為較規(guī)整橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，未見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞。在缺氧1、6 h時(shí)間點(diǎn)，隨著凝血酶濃度的增加，綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量較對(duì)照組有所增加，可見(jiàn)核形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞。缺氧12 h，50 U/mL和100 U/mL凝血酶濃度下，綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步增加，當(dāng)凝血酶濃度達(dá)到150 U/mL，綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，可見(jiàn)細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞死亡數(shù)量增加。缺氧達(dá)到24 h后，細(xì)胞多數(shù)死亡，藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)量已明顯減少。見(jiàn)表2，圖2～5。

圖2　凝血酶150 U/mL作用1 h(×200)

圖3　凝血酶150 U/mL作用6 h(×200)

圖5　凝血酶150 U/mL作用24 h(×200)

表2　不同時(shí)間不同濃度凝血酶細(xì)胞的凋亡率比較

續(xù)表2　不同時(shí)間不同濃度凝血酶細(xì)胞的凋亡率比較

3　討　論

缺血缺氧是缺血性腦卒中導(dǎo)致神經(jīng)損傷的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，大腦能夠耐受低氧而不產(chǎn)生功能性損害的時(shí)間約為5 min，如果缺血時(shí)間較長(zhǎng)，將導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生不可逆性死亡。另一方面，凝血酶在缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到學(xué)術(shù)界的重視，凝血酶不僅是血液凝固血栓形成的關(guān)鍵水解酶，而且也通過(guò)與蛋白酶活化受體(PAR)結(jié)合發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。很多研究證明，凝血酶原mRNA在腦組織，尤其是對(duì)缺血敏感的組織，如大腦皮質(zhì)、紋狀體、下丘腦、海馬和小腦均有表達(dá)。缺血性腦血管病患者及其高危人群中，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)凝血酶原的mRNA的表達(dá)上調(diào)，凝血酶生成增加[7]。研究認(rèn)為凝血酶還可能通過(guò)與其受體結(jié)合，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上黏附分子ICAM-1、VCAM-1結(jié)合進(jìn)而向血管外浸潤(rùn)，表達(dá)和產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)和IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素(IFN)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)等炎癥因子[10-12]，促發(fā)炎癥反應(yīng)，加重神經(jīng)細(xì)胞損害。MCAO模型大鼠的缺血中心區(qū)域凝血酶的活性增加，凝血酶原基因表達(dá)上調(diào)可持續(xù)數(shù)小時(shí)。

體外實(shí)驗(yàn)顯示，凝血酶對(duì)神經(jīng)元具有損傷作用，凝血酶的非蛋白水解活性可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使小膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子明顯增加，增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，凝血酶注入腦內(nèi)6 h后可檢測(cè)到凋亡的神經(jīng)細(xì)胞，并且Caspase-3的活性明顯增加[10]；凝血酶可誘導(dǎo)腦VEC炎性黏附分子表達(dá)，改變血腦屏障(BBB)的通透性[13]。所以本研究采用對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用NGF刺激誘導(dǎo)PC12細(xì)胞，使其向神經(jīng)元分化，用于神經(jīng)元的凝血酶合并缺氧模型的建立；旨在通過(guò)本模型探討凝血酶毒性反應(yīng)在AIS病理生理過(guò)程中的地位，從而更加真實(shí)地模擬AIS后神經(jīng)細(xì)胞所處的微環(huán)境，更加貼近于臨床。凝血酶對(duì)于神經(jīng)元的毒性作用與時(shí)間、劑量呈依賴關(guān)系。本研究觀察了不同濃度(0、50、100、150、200 U/mL)的凝血酶在不同時(shí)間點(diǎn)(1、6、12、24 h)對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示，凝血酶對(duì)PC12細(xì)胞具有直接的毒性損傷作用，低濃度的凝血酶作用較短時(shí)間可能對(duì)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凝血酶對(duì)細(xì)胞毒性損傷作用增加。MTT對(duì)細(xì)胞存活率的檢測(cè)結(jié)果表明50 U/mL低濃度的凝血酶可能對(duì)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，原因可能是低濃度凝血酶(50 U/mL)在缺氧1 h左右細(xì)胞處于對(duì)缺氧損傷的可逆修復(fù)期，此時(shí)如果馬上進(jìn)行氧的供應(yīng)可以降低細(xì)胞的損傷，與之前文獻(xiàn)的報(bào)道相符。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在6、12、24 h均對(duì)細(xì)胞具有毒性損傷作用，150 U/mL凝血酶在作用12 h后對(duì)細(xì)胞的損傷與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而24 h組的細(xì)胞存活率較低，不利于之后實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。6 h組200 U/mL凝血酶與12 h組150 U/mL凝血酶相比，二者對(duì)細(xì)胞的損傷無(wú)明顯差異，而150 U/mL的凝血酶與腦出血血腫內(nèi)凝血酶濃度更為接近。凝血酶合并缺氧在不同時(shí)間均可以造成細(xì)胞損傷，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)及凝血酶濃度的增加，對(duì)細(xì)胞的損傷逐漸加重，故選擇150 U/mL凝血酶在缺氧作用12 h后為研究凝血酶合并缺氧對(duì)PC12細(xì)胞損傷的最佳模型條件。

凝血酶的分子信號(hào)作用是通過(guò)其受體的介導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但其作用的確切靶點(diǎn)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未明確，通過(guò)對(duì)凝血酶合并缺氧對(duì)PC12細(xì)胞損傷模型的探索，進(jìn)一步研究凝血酶對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的相關(guān)機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)防治AIS后凝血酶毒性作用可能具有更大的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

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Model of PC12 cell injury induced by thrombin combined with hypoxia*

Qin Hongyu,Li Yin,Li Dingxiang,Deng Yihui△

(KeyLaboratoryofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineforPreventionandTreatmentofCardiacandCerebralofHunanTraditionalChineseMedicineUniversity/KeyLaboratoryofCellBiologyandMolecularTechnologyofUniversitiesandCollegesofHunanProvince,Changsha,Hunan410208,China)

ObjectiveTo explore the optimal reaction time of thrombin combined with hypoxia on PC12 cell injury,and to provide experimental method for the study of the significance of thrombin in ischemic brain injury.Methodsthe PC12 cell injury model induced by hypoxia in vitro was established.In the conventional cell culture method,three 1%O2(5%CO2,6 h,94%N2) and DMEM (24 h) cells were used to simulate ischemia,and four (50,150 and 200 U/ml) were added to the different concentrations of thrombin (0,100,and 12 h).Cell survival rate was detected by MTT and apoptosis rate of cell was detected by TUNEL.Resultsthe survival rate of the cells decreased,the positive rate and apoptosis rate of TUNEL cells increased gradually with the increase of time and the concentration of thrombin.Low concentrations of thrombin (50 U/mL) in hypoxia 1H,compared with the control group (0 U/mL),the survival rate increased,suggesting that low thrombin may have protective effect.The cell viability was significantly decreased (P<0.01),and the apoptosis rate was significantly increased (P<0.05),and the difference was statistically significant(P<0.05) between 200 U/mL and control group(U/mL) after 12 h was significantly decreased (12 h).ConclusionThrombin combined with hypoxia in different time can cause cell damage,with the increase of time and thrombin concentration,the damage of cells increased gradually,the MTT and TUNEL cells apoptosis,the minimum dose of thrombin induced damage to PC12 cells,150 U/mL thrombin in the role of 12 h cells after the damage and compared with the control group,it has significant statistical significance,therefore,the optimal model for the damage of PC12 cells after 150 U/mL was selected.

PC12 cells;thrombin;anoxia;cell injury

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(13JJ6061，14JJ2113)；湖南省中醫(yī)藥科研基金資助項(xiàng)目(201319)；湖南省教育廳資助項(xiàng)目(12A105)；湖南省重點(diǎn)學(xué)科中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)資助項(xiàng)目；湖南省自然科學(xué)創(chuàng)新群體基金資助項(xiàng)目；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助。作者簡(jiǎn)介：覃弘宇(1990-)，在讀碩士，主要從事中西結(jié)合防治糖尿病血管并發(fā)癥研究?！?/p>

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R743.3

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1671-8348(2016)27-3766-04

2016-02-13

2016-04-06)