都梁軟膠囊對偏頭痛模型大鼠中腦CGRP及CCK表達的影響

韓喜梅，姚　剛，滿玉紅，于挺敏△

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　024000；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，長春 130041)

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都梁軟膠囊對偏頭痛模型大鼠中腦CGRP及CCK表達的影響

韓喜梅1，姚剛2，滿玉紅2，于挺敏2△

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科024000；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，長春 130041)

目的研究都梁軟膠囊對偏頭痛模型大鼠中腦降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和縮膽囊肽(CCK)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，探討其預(yù)防治療偏頭痛的作用機制。方法健康Wistar大鼠隨機分4組，A為對照組，B為偏頭痛組，C為都梁軟膠囊對照組，D為都梁軟膠囊治療組。C、D組給予都梁軟膠囊0.5 g·kg-1·d-1灌胃，A、B組大鼠灌胃給予等量容積的Tween-80。灌胃7 d后，將B、D兩組大鼠造硝酸甘油型偏頭痛模型，造模2 h，保存中腦標(biāo)本。實時熒光定量PCR檢測CGRP和CCK的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果D組大鼠中腦CGRP 轉(zhuǎn)錄水平明顯低于B組(0.64±0.35和 1.61±0.51，P<0.05)。C組大鼠中腦CCK 轉(zhuǎn)錄水平明顯低于A組(0.32±0.31和1.21±0.38，P<0.05)。結(jié)論都梁軟膠囊可以干預(yù)中腦CGRP和CCK的表達，從而影響內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)的功能。

偏頭痛；中腦；降鈣素基因相關(guān)肽；都梁軟膠囊；縮膽囊肽

偏頭痛是臨床常見疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，目前臨床上采用的預(yù)防性治療藥物并不完全有效，并且容易產(chǎn)生耐受或發(fā)生不良反應(yīng)[1]。偏頭痛患者頭痛發(fā)作若不能得到有效控制，容易發(fā)生藥物濫用，同時還可能與情感障礙共病，給患者帶來更嚴(yán)重的危害。近期一項關(guān)于都梁軟膠囊治療偏頭痛的薈萃分析顯示：臨床上都梁軟膠囊治療偏頭痛的有效率優(yōu)于偏頭痛一線預(yù)防性治療藥物“氟桂利嗪”[2]。目前，關(guān)于都梁軟膠囊治療偏頭痛的基礎(chǔ)研究較為薄弱，其具體機制有待于深入探討。內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)功能異常是參與偏頭痛發(fā)作的重要因素，調(diào)節(jié)內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)的功能對偏頭痛的防治有重要價值[3]。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)和縮膽囊肽(cholecystokinin，CCK)是內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)中兩種重要的神經(jīng)肽，它們可以減弱阿片肽在中腦的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，從而參與痛覺調(diào)節(jié)[4]。本實驗以偏頭痛大鼠為模型，研究了預(yù)防性給予都梁軟膠囊對偏頭痛發(fā)作時模型大鼠中腦CGRP和CCK基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，探討都梁軟膠囊預(yù)防性治療偏頭痛的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器24只健康SPF級Wistar大鼠(雌雄各半)，體質(zhì)量200～220 g，購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心，動物合格證號：SCXK(吉)2003-001。都梁軟膠囊(重慶華森制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：Z20055185)。總RNA提取試劑盒(RNAiso Reagent)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA [PCR Kit(AMV) Ver.3.0]、E.coli DH5α菌株、pEASY-T1載體、限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR V、熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM，購自大連TaKaRa公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(Axygen Biosciences)。定量PCR儀(ABI PRISM 7500)。

1.2大鼠分組、藥物干預(yù)及模型制備按隨機區(qū)組法分為4組，每組6只大鼠：對照組(A組)、偏頭痛組(B組)、都梁軟膠囊對照組(C組)和都梁軟膠囊治療組(D組)。都梁軟膠囊對照組和都梁軟膠囊治療組大鼠灌胃給予都梁軟膠囊，劑量為0.5 g·kg-1·d-1(藥物用Tween-80稀釋為0.1 g/mL，劑量根據(jù)成人常規(guī)每日劑量進行換算)，A組和B組大鼠灌胃給予等容積的Tween-80。給藥7 d后，B、D組皮下給予硝酸甘油注射劑(劑量為：10 mg/kg)制備實驗性偏頭痛模型，以出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁搔頭、爬籠次數(shù)增多、咬尾、往返運動等提示模型動物頭部不適的癥狀為造模成功的指標(biāo)[5]。

1.3標(biāo)本采集造模2.0 h，麻醉并處死各組大鼠(腹腔注射10%水合氯醛每100克0.3 mL/100 g)，分離中腦，存于-70 ℃冰箱中備用。

1.4實時定量PCRcDNA合成：根據(jù)試劑盒說明書提取各組大鼠中腦總RNA，每一標(biāo)本取總RNA 200 ng，MgCl24 μL,10×RT Buffer 2 μL，dNTP Mixture(各10 mmol/L) 2 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，Random 9 mers 1 μL，加RNase Free ddH2O至20 μL。30℃ 10 min,42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min,5 ℃ 5 min進行反轉(zhuǎn)錄。定量標(biāo)準(zhǔn)品制備：CGRP引物上游5′-AAG TTC TCC CCT TTC CTG GT-3′，下游5′-GGT GGG CAC AAA GTT GTC CT-3′，擴增片段長度為318 bp。CCK引物上游5′-CCC GAT ACA TCC AGC AGG TC-3′，下游5′-AAA TCC ATC CAG CCC ATG-TAG TC-3′，擴增片段長度為121 bp。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，CGRP 53 ℃(CCK 57 ℃)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物膠回收純化后與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coli DH5α進行亞克隆，篩選獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)化子后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序驗證，證實克隆到的CGRP cDNA和CCK cDNA全長序列完全正確。根據(jù)所提質(zhì)粒的A260計算其濃度，梯度稀釋后用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。SYBR GreenⅠ實時定量PCR：20 μL反應(yīng)體系中包括：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA標(biāo)本2.0 μL，dH2O 6.8 μL。將CGRP(CCK)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行10倍系列稀釋，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，同時進行PCR。以上各標(biāo)本均做3個復(fù)孔。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，CGRP 53 ℃(CCK 57 ℃)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，根據(jù)熒光信號記錄Ct值(threshold cycle,Ct)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算絕對含量。同時設(shè)置95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,95 ℃ 15 s進行溶解曲線分析以確定定量準(zhǔn)確性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS1 7.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差別采用單因素方差分析和Tukey比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1CGRP、CCK基因標(biāo)準(zhǔn)品實時定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線10倍系列稀釋的CGRP和CCK質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制作PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測的線性范圍達7個數(shù)量級。CGRP檢測上限為2.7×109copy/μL，下限為2.7×103copy/μL，回歸方程Ct=-2.69Log(x)+38.875，r=0.993，見圖1。CCK檢測上限為2.8×109拷貝/μL，下限為2.8×103copy/μL，回歸方程Ct=-1.907Log(x)+35.224，r=0.953，見圖2。

圖1　CGRP mRNA熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2各組大鼠中腦CGRP mRNA的表達各組大鼠中腦總RNA(每200納克)中CGRP mRNA拷貝數(shù)(×104copy)分別為：A組1.13±0.68；B組1.61±0.51；C組0.53±0.43；D組0.64±0.35。B組大鼠中腦CGRP 轉(zhuǎn)錄水平明顯高于C組(q=5.242，P<0.05)；D組大鼠中腦CGRP 轉(zhuǎn)錄水平明顯低于B組(q=4.671，P<0.05)，見圖3。

圖2　CCK mRNA熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

a：q=5.242，P<0.05；b：q=4.671，P<0.05；CGRP：降鈣素基因相關(guān)肽。

圖3各組大鼠中腦CGRP mRNA表達比較

2.3各組大鼠中腦CCK mRNA的表達各組大鼠中腦總RNA(每200納克)中CCK mRNA拷貝數(shù)(×106copy)分別為：對照組 1.21±0.38；B組1.71±0.83；C組0.32±0.31；D組1.00±0.48。B組大鼠中腦CCK轉(zhuǎn)錄水平明顯高于C組(q=6.301，P<0.05)；C組大鼠中腦CCK轉(zhuǎn)錄水平明顯低于A組(q=4.035，P<0.05)，見圖4。

a：q=4.035，P<0.05；b:q=6.301，P<0.05；CCK：縮膽囊肽。

圖4各組大鼠中腦CCK mRNA表達比較

3　討　論

流行病學(xué)調(diào)查顯示：全球患偏頭痛的人口約占14.7%[6]。由Yu等[7]牽頭進行的流行病學(xué)調(diào)查顯示我國偏頭痛患病率約為9.3%。目前臨床上常用的偏頭痛預(yù)防性治療藥物主要包括如下幾類：鈣離子拮抗劑(氟桂利嗪)、β受體阻滯劑(普萘洛爾)、抗癲癇藥(丙戊酸、托吡酯)、抗抑郁藥物(阿米替林)等[8]。然而，上述藥物長期應(yīng)用可能出現(xiàn)的副作用及不良反應(yīng)常常限制了這些藥物的臨床應(yīng)用。

都梁軟膠囊由白芷和川芎兩味中藥組成，具有祛風(fēng)散寒，活血通絡(luò)的功效，臨床用于偏頭痛的治療，取得了較為滿意的效果[9]。李偉仕等[10]應(yīng)用都梁軟膠囊對偏頭痛進行預(yù)防性治療，發(fā)現(xiàn)都梁軟膠囊療效明顯，并且遠期療效仍可達到64.71%。內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)對痛覺感受起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，都梁軟膠囊對偏頭痛的治療是否影響到內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)的功能還不清楚。本研究在制備硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型之前，連續(xù)給予都梁軟膠囊7 d，觀察都梁軟膠囊對內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)的核心結(jié)構(gòu)——中腦疼痛相關(guān)神經(jīng)肽的影響，進而探討都梁軟膠囊預(yù)防性治療偏頭痛的機制。

CGRP是目前公認(rèn)的與偏頭痛關(guān)系最為密切的神經(jīng)肽之一。研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛發(fā)作時頸外靜脈血中CGRP的含量增加，但同一時刻肘靜脈血中CGRP的含量并無明顯變化，此現(xiàn)象提示偏頭痛發(fā)作時顱內(nèi)釋放CGRP增加[11]。CGRP在神經(jīng)系統(tǒng)中具有增強突觸傳遞的作用。動物實驗發(fā)現(xiàn)，脊髓背角突觸后神經(jīng)元AMPA型谷氨酸受體與CGRP受體共表達，外源性給予CGRP預(yù)處理可以明顯增加這些神經(jīng)元對AMPA的放電頻率，同時也發(fā)現(xiàn)CGRP拮抗劑CGRP8-37可以阻斷這種反應(yīng)[12]。當(dāng)CGRP水平升高時，感覺傳入信號可能被異常放大而超過疼痛的閾值，CGRP起到傳遞和擴大痛覺信號的作用[13]。另外，CGRP在中腦還可以減弱內(nèi)源性阿片肽的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，都梁軟膠囊預(yù)防性治療的偏頭痛大鼠中腦CGRP mRNA表達明顯低于偏頭痛組大鼠，說明都梁軟膠囊預(yù)防性治療可以抑制偏頭痛發(fā)作時模型大鼠中腦CGRP的基因表達，這樣一方面可以減弱CGRP對痛覺信息的傳遞作用；另一方面可以抵抗CGRP對阿片肽鎮(zhèn)痛作用的抑制效應(yīng)。

腦中與痛覺調(diào)制相關(guān)的腦區(qū)均有CCK存在，動物實驗發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)損傷后及攝入阿片后CCK水平都會上升，提示CCK 是阿片拮抗劑，當(dāng)CCK水平升高時，阿片所誘發(fā)的鎮(zhèn)痛作用便大大減弱了，但若同時使用CCK拮抗劑，則阿片的鎮(zhèn)痛作用增強[4]。因此，目前認(rèn)為CCK在內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)中的作用主要是拮抗阿片鎮(zhèn)痛[4,14]。本研究顯示都梁軟膠囊對照組大鼠中腦CCK mRNA拷貝數(shù)明顯低于對照組和偏頭痛組，說明都梁軟膠囊可以抑制大鼠中腦CCK的基因表達，都梁軟膠囊下調(diào)CCK的表達會減弱CCK對阿片鎮(zhèn)痛的拮抗作用，從而，一定程度上增強了內(nèi)源性阿片肽的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。但研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)都梁軟膠囊治療組大鼠中腦CCK基因表達與對照組及偏頭痛組有顯著性差異，說明大鼠偏頭痛發(fā)作時中腦CCK基因表達并未發(fā)生明顯的下調(diào)，考慮與偏頭痛病理生理過程復(fù)雜有關(guān)，同時也提示都梁軟膠囊鎮(zhèn)痛機制可能與其調(diào)節(jié)CCK的表達無直接關(guān)系。

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Effects of Duliang capsule on the expression of calcitonin gene-related peptide and cholecystokinin in the midbrain of a rat migraine model

Han Ximei1,Yao Gang2,Man Yuhong2,Yu Tingmin2△

(1.DepartmentofNeurology,ChifengMunicipalHospital,Chifeng,InnerMongoliaAutonomousRegion024000,China;2.DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun,Jilin130041,China)

ObjectiveTo study the effects of Duliang capsule on the expression of calcitonin gene-related peptide(CGRP) and cholecystokinin(CCK) in the midbrain of a rat migraine model,and explored treatment effects and mechanisms of Duliang capsule on rats with migraine.MethodsA total of 24 rats were randomly divided into four groups:normal control groups(A),migraine model groups(B),Duliang capsule control groups(C) and Duliang capsule treatment groups(D).C and D were intragastrically perfused with Duliang capsule(0.5 g·kg-1·d-1).After 7 days,nitroglycerin was subcutaneously injected into the buttocks of the B and D to induce migraine.Two hours after nitroglycerin injection,the midbrain were isolated CGRP and CCK expression in midbrain were determined using SYBR Green I real-time quantitative PCR.ResultsCGRP mRNA expression was significantly lower in midbrains of rats in the Duliang capsule treatment groups compared with migraine model groups(P<0.05).CCK mRNA expression was significantly lower in midbrains of rats in the Duliang capsule control groups compared with normal control groups(P<0.05).ConclusionDuliang capsule can exhibit the expression of CGRP and CCK in the midbrain of the migraine rats.weaken the CGRP and CCK-induced inhibition of the analgesic effects of opioid peptides.

migraine disorders;mesencephalon;calcitonin gene-related peptide;duliang capsule;cholecystokinin

韓喜梅(1983-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事慢性頭痛的基礎(chǔ)與臨床研究。△

，E-mail:ytm_396@163.com。

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.005

R747.2

A

1671-8348(2016)27-3760-03

2016-02-15

2016-04-06)