利福昔明對奶牛乳房炎常見病原菌的體外抗菌活性試驗

王 建 ，程雪嬌 ，焦曉軍 ，余貴菊 ，于小婷 ，王 猛 ，曾振靈 ，曾東平

（1.天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司，天津 300380；2.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642）

利福昔明對奶牛乳房炎常見病原菌的體外抗菌活性試驗

王 建1，程雪嬌1，焦曉軍1，余貴菊1，于小婷1，王 猛1，曾振靈2，曾東平2

（1.天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司，天津 300380；2.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642）

旨在測定利福昔明對奶牛乳房炎常見病原菌的體外抗菌活性。采用瓊脂二倍稀釋法測定利福昔明對奶牛乳房炎常見病原菌大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）。結果顯示，利福昔明對19株大腸桿菌的MIC值為8～16 μg/mL，對 25株葡萄球菌的MIC值為0.002～0.06 μg/mL，對 18株鏈球菌的MIC值為0.06～2 μg/mL。大部分臨床分離菌的MIC值與標準菌的相近，表明分離菌株對利福昔明較為敏感，提示利福昔明對奶牛乳房炎常見病原菌具有較強的體外抗菌活性。

利福昔明；奶牛乳房炎；抗菌活性；瓊脂二倍稀釋法

利福昔明 （rifaximin）屬于利福霉素類抗菌藥物，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有較強的抗菌活性［1-2］。歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）已批準該藥用于干乳期奶牛乳房炎和產后奶牛子宮炎的防治［3］。國內對該藥在獸醫(yī)臨床應用的報道還較少，但已有研究表明，該藥在防治奶牛干乳期乳房炎等疾病方面具有廣闊的前景［4］。天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司研制出一種用于預防干乳期奶牛乳房炎的新藥——利福昔明乳房注入劑。該研究根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會 （Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）規(guī)定的抗菌藥物敏感性檢測方法，采用瓊脂二倍稀釋法測定了利福昔明對奶牛乳房炎常見病原菌臨床分離株的最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC），以期為了解利福昔明對奶牛乳房炎常見病原菌的抗菌活性及評估利福昔明耐藥性風險提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及配制 利福昔明原料藥，由天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司提供，含量為95.9%。利福昔明對照品，德國Dr.Ehrenstorfer公司生產，含量為95.5%，批號：30611。準確稱取130.35 mg利福昔明原料藥，用甲醇溶解并定容至25 mL，即配成5 120 μg/mL的儲備液，過濾除菌，分裝，-20℃保存。

1.2 菌株 標準菌株：大腸桿菌ATCC 25922，金黃色葡萄球菌ATCC 29213，由華南農業(yè)大學獸醫(yī)藥理研究室保存。臨床分離菌：大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌臨床菌株，由華南農業(yè)大學獸醫(yī)藥理研究室從奶牛乳房炎病料中分離、鑒定并保存。

1.3 培養(yǎng)基及血清 MH肉湯培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱生物技術有限公司生產，批號：3102079；MH瓊脂培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱生物技術有限公司生產，批號：310662；麥康凱瓊脂，廣州環(huán)凱生物技術有限公司生產，批號：3102142；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱生物技術有限公司生產，批號：3102336；胰蛋白胨大豆肉湯，廣州環(huán)凱生物技術有限公司生產，批號：3101501；甘露醇高鹽瓊脂，青島高科園海博生物有限公司生產，批號：20120106；新生小牛血清：廣州翔博生物工程有限公司生產，批號：20131221。

1.4 器材 一次性培養(yǎng)皿、96孔細胞培養(yǎng)板、移液槍、試管、試管架、接種環(huán)、三角燒瓶、容量瓶、分析天平、培養(yǎng)箱、自動高壓滅菌鍋、超凈工作臺、電動移液器等。1.5 方法

1.5.1 培養(yǎng)基的制備：按照產品說明書制備各類培養(yǎng)基。

1.5.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定：采用瓊脂二倍稀釋法，步驟如下。

1.5.2.1 利福昔明對大腸桿菌和葡萄球菌MIC值的測定

①菌液的制備：將已純化并鑒定過的大腸桿菌臨床分離株和大腸桿菌質控菌株在麥康凱瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，將葡萄球菌臨床分離株和葡萄球菌質控菌株在甘露醇瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于3 mL MH肉湯中，37℃培養(yǎng)4～6 h，再用MH肉湯將菌液稀釋到約105CFU/mL，備用。

②抗菌藥的稀釋：用滅菌水將利福昔明儲備液按二倍稀釋法稀釋至需要濃度，稀釋濃度范圍為0.002～256 μg/mL。分別吸取1 mL的各濃度藥液放入標記相應濃度的一次性平皿中。

③含藥瓊脂平板的制備：用移液管吸取19 mL的MH瓊脂，加入已有1 mL利福昔明藥液的平皿中，輕搖混勻，同時做2個不含藥的空白瓊脂平板。在超凈工作臺中冷卻后，備用。

④細菌接種和培養(yǎng)：將稀釋好的菌液按照多點接種儀的設計特點加入無菌的96孔聚苯乙烯U型微量板中，按藥物濃度從低到高的順序，用多點接種器蘸取菌液接種到瓊脂平板表面。將接種好的瓊脂平板放置于室溫下，直到接種點被瓊脂完全吸收，然后放入培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)16～18 h。

⑤結果判定：經培養(yǎng)后，當2個不含藥的空白瓊脂平板上的所有接種點的菌落均生長良好，而無接種細菌的平皿無菌落生長時，試驗組完全不見細菌生長的最低藥物濃度即為該藥物對細菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.5.2.2 利福昔明對鏈球菌MIC的測定

①肉湯的配制：稱取適量MH肉湯培養(yǎng)基粉末溶解于去離子水中，121℃高壓20 min，冷卻至50～60℃后，加入新生牛血清，使其終濃度為5%。

②菌液培養(yǎng) 挑取純化的鏈球菌單菌落，接種于3 mL含5%新生牛血清的MH肉湯中。37℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)6～8 h，將菌液稀釋至濃度約為105CFU/mL，備用。

③藥物稀釋、含藥瓊脂平板的制備、細菌接種和培養(yǎng)、結果判定方法同1.5.2.1中的相應步驟。

表1 利福昔明對奶牛乳房炎常見病原菌的最小抑菌濃度（MIC）測定結果 μg/mL

2 結果與分析

利福昔明對奶牛乳房炎常見病原菌的MIC值測定結果見表1～表4。由表1～表4可知，利福昔明對19株臨床分離的大腸桿菌的MIC值為8～16 μg/mL，對25株臨床分離的葡萄球菌的MIC值為0.002～0.06 μg/mL，對18株臨床分離的鏈球菌的MIC值為 0.06～2 μg/mL。

3 討論

該研究結果表明，利福昔明對大部分奶牛乳房炎致病菌臨床分離株的MIC值與其對標準菌株的MIC值相近，提示利福昔明對臨床分離菌株較為敏感。大量的研究報道指出，利福昔明對分離自不同國家和地區(qū)的奶牛乳房炎大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌的敏感性存在差異［5-14］。盡管臨床上已有部分菌株對利福昔明產生了耐藥性，但目前利福昔明仍然可以用來防治奶牛乳房炎或者子宮內膜炎等疾病。該研究中，大腸桿菌、鏈球菌大都來自臨床型奶牛乳房炎病例，所測菌株的MIC值與不同地區(qū)學者報道的研究結果基本一致或略低，表明利福昔明對采樣地區(qū)流行的奶牛乳房炎主要致病菌都較為敏感，具有較強的體外抗菌活性。該研究結果為進一步評價天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司研制的利福昔明乳房注入劑的臨床應用效果奠定了基礎。

表2 利福昔明對19株奶牛乳房炎大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）測定結果

表3 利福昔明對25株奶牛乳房炎葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）測定結果

表4 利福昔明對18株奶牛乳房炎鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）測定結果

［1］JIANG Z D，DUPONT H L.Rifaximin：in vitro and in vivo antibacterial activity-a review［J］.Chemotherapy，2005，51（Suppl 1）：67-72.

［2］HOOVER W W，GERLACH E H，HOBAN D J，et al.Antimicrobial activity and spectrum of rifaximin，a new topical rifamycin derivative ［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，1993，16（2）：111-118.

［3］European Agency for the Evaluation of Medicinal Products.Rifaximin（Extension to topical use）：Summary report（3）-Committee for Veterinary Medicinal Products.［EB/OL］.（1998-05-01）［2016-04-10］.http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/includes/document/document_de tail.jsp?webContentId=WC500015830&mid=WC0b01ac 058008d7ad.

［4］郭旭，李培鋒，關紅，等.利福昔明乳房注入劑對干奶期奶牛臨床型乳房炎預防效果觀察［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（7）：115-120.

［5］CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing：Twenty-Second Informational Supplement［S］.Wayne：CLSI，2012.

［6］HOPKINS K L，MUSHTAQ S，RICHARDSON J F，et al.In vitro activity of rifaximin against clinical isolates of Escherichia coli and other enteropathogenic bacteria isolated from travellers returning to the UK［J］.Int J Antimicrob A-gents，2014，43（5）：431-437.

［7］MALINOWSKI E，LASSA H，MARKIEWICZ H，et al.Sensitivity to antibiotics of Arcanobacterium pyogenes and Escherichia coli from the uteri of cows with metritis/endometritis［J］.The Vet J，2011，187（2）：234-238.

［8］VICENZONI G，PONZONI A，MADINELLI R，et al.Sensitivity to rifaximin of strains of Staphylococcus aureus isolated from 1997 to 1999-Comparison between years and calculation of the correlated MIC ［J］.O biettivi e Documenti Veterinari，2000，21（6）：39-42.

［9］PICCININI R，TASSI R，DAPRá V，et al.Study of Staphylococcus aureus collected at slaughter from dairy cows with chronic mastitis［J］.JDairy Res，2012，79（2）：249-255.

［10］BERTOCCHI L，VARISCO G，F(xiàn)ARINA R，et al.Rifaximin andcephacetrileinacontrolprogramforStaphylococcusaureusinfectionsindairyherds［C］//ProceedingsoftheⅩⅩⅠWorld Buiatrics Congress，Punta del Este，Uruguay，Dec，2000.Budapest：World Association for Buiatrics，2000.

［11］PILLA R，BONURA C，MALVISI M，et al.Methicillinresistant Staphylococcus pseudintermedius as causative agent of dairy cow mastitis［J］.Vet Rec，2013，173（1）：19.

［12］MALINOWSKI E，LASSA H，SMULSKI S，et al.Antimicrobial susceptibility of bacteria isolated from cows with mastitis in 2006-2007 ［J］.Bull Vet Inst Pulawy，2008，52：565-572.

［13］GUéRIN-FAUBLéE V，TARDY F，BOUVERON C，et al.Antimicrobial susceptibility of Streptococcus species isolated from clinical mastitis in dairy cows［J］.Int J Antimicrob Agents，2002，19（3）：219-226.

［14］RATO M G，BEXIGA R，F(xiàn)LORINDO C，et al.Antimicrobial resistance and molecular epidemiology of Streptococci from bovine mastitis ［J］.Vet Microbiol，2013，161（3/4）：286-294.

In Vitro Antibacterial Activity of Rifaximin against Bacterial Pathogens Associated with Bovine Mastitis

WANG Jian1，CHENG Xue-jiao1，JIAO Xiao-jun1，YU Gui-ju1，YU Xiao-ting1，WANG Meng1，ZENG Zhenling2，ZENG Dong-ping2
（1.Tianjin Speerise Challenge Biotechnology Co.，Ltd，Tianjin 300380，China；2.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The purpose of the present study was to evaluate the in vitro antibacterial activity of rifaximin against the common bacterial pathogens associated with bovine mastitis.Agar dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration（MIC）of rifaximin against clinical isolates of E.coli,Streptococci and Staphylococci from dairy cows with mastitis.The MIC range of rifaximin against 19 E.coli strains,25 Staphylococcus strains and 18 Streptococcus strains were 8-16 μg/mL,0.002-0.06 μg/mL and 0.06-2 μg/mL,respectively.The MIC of the most clinical isolates was similar with that of their corresponding standard strains,indicating that they were sensitive to rifaximin.The combined data suggest that rifaximin exhibits strong antibacterial activity against the common bacterial pathogens associated with bovine mastitis.

rifaximin；bovine mastitis；antibacterial activity；agar dilution method

S859.796；S858.237.26

A文章順序編號：1672-5190（2016）05-0045-04

2016-04-28

王建（1970—），男，獸醫(yī)師，碩士，主要從事獸藥的研發(fā)、生產及銷售管理工作。

曾東平（1979—），男，高級實驗師，博士，碩士生導師，主要從事新獸藥研制與評價工作。

（責任編輯：趙俊利）