Caspases抑制條件下5-FU誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡的作用

張智瑞， 孫小錦， 崇殿龍， 周 燦， 任 凱， 劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，蚌埠 233030；*通訊作者，E-mail: liuhao6886@foxmail.com)

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Caspases抑制條件下5-FU誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡的作用

張智瑞， 孫小錦， 崇殿龍， 周 燦， 任 凱， 劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，蚌埠 233030；*通訊作者，E-mail: liuhao6886@foxmail.com)

目的 探討5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖的抑制作用，并在抑制caspases的條件下，對5-FU誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的死亡形式進(jìn)行探討。 方法 MTT法檢測不同濃度的5-FU(0，4，8，16，24，32 μmol/L)對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，篩選適宜的藥物濃度。在適宜藥物濃度下實(shí)驗(yàn)分為對照組、z-VAD-fmk組、5-FU組、5-FU+z-VAD-fmk組，MTT法檢測乳腺癌細(xì)胞存活率；PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞的死亡率；DAPI染色檢測乳腺癌細(xì)胞核的變化；透射電鏡觀察乳腺癌細(xì)胞的死亡形式；Western blot檢測壞死性凋亡蛋白R(shí)IP1表達(dá)的變化。 結(jié)果 8 μmol/L為5-FU的適宜濃度，該濃度下MDA-MB-231細(xì)胞在24 h,48 h,72 h的存活率分別為(68.94±1.17)%,(48.76±1.47)%和(44.15±2.41)%。 MTT、PI、DAPI實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與對照組和5-FU組相比，5-FU+z-VAD-fmk組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞核濃染加深，核固縮現(xiàn)象顯著。電鏡結(jié)果顯示5-FU組細(xì)胞發(fā)生凋亡，5-FU+z-VAD-fmk組細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。Western blot結(jié)果表明：z-VAD-fmk聯(lián)用時(shí)5-FU明顯上調(diào)RIP1蛋白的表達(dá)。 結(jié)論 5-FU可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡； caspases抑制條件下5-FU通過激活RIP1誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。

乳腺癌； 5-氟尿嘧啶； z-VAD-fmk； 凋亡； caspases； 壞死性凋亡

乳腺癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤，中國的乳腺癌發(fā)病率增長速度是全球的兩倍多[1]，目前的治療手段仍以手術(shù)或放化療為主，其發(fā)生腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后情況差。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)作為經(jīng)典的抗代謝藥物，對胃癌、腸癌、乳腺癌、食管癌、肝癌和胰腺癌治療效果較好[2]。5-FU可通過線粒體途徑啟動(dòng)一系列不同的凋亡相關(guān)蛋白參與調(diào)控凋亡過程[3]，或是產(chǎn)生過量的活性氧自由基促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4]。大多數(shù)抗腫瘤藥物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖都是通過促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡來實(shí)現(xiàn)的。以凋亡耐受及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)為特征的腫瘤多藥耐藥的出現(xiàn)，使凋亡誘導(dǎo)劑及相關(guān)藥物在臨床中的應(yīng)用受到限制。傳統(tǒng)的細(xì)胞死亡形式分為壞死和凋亡，后者又稱為程序性死亡，在最新研究中，壞死性凋亡作為一種新的非caspases依賴的程序性死亡形式被發(fā)現(xiàn)，對腫瘤耐藥細(xì)胞的研究證實(shí)，壞死性凋亡誘導(dǎo)劑在規(guī)避腫瘤多藥耐藥方面具有“廣譜性”[5,6]。本研究旨在觀察5-FU對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的抑制作用，并對caspases抑制條件下5-FU作用后細(xì)胞的死亡形式進(jìn)行分析探討，為5-FU類藥物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

5-FU購于上海麥克林生化科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；MTT、PI購于美國Sigma公司；DAPI購于碧云天生物技術(shù)公司；z-VAD-fmk購于美國Calbiochem公司； RIP1抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司； DMSO、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG與β-actin抗體購于合肥BioSharp公司；ECL發(fā)光試劑盒購于美國Millipore公司。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，由蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理研究室保存。 MDA-MB-231細(xì)胞使用含有10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于 37 ℃、含5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞的存活率

將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞按7×103/孔接種于96孔板中，每孔100 μl。在培養(yǎng)箱中放置生長24 h，棄去培養(yǎng)液，加入100 μl不同濃度的5-FU(0，4，8，16，24，32 μmol/L)進(jìn)行處理，每組3個(gè)復(fù)孔。藥物分別作用24，48，72 h，每孔分別避光加入15 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，緩慢吸去上清，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃烘箱孵育30 min，酶標(biāo)儀在波長490 nm處測吸光度值。Pan-caspases抑制劑z-VAD-fmk與藥物合用時(shí)，預(yù)先使用20 μmol/L z-VAD-fmk作用于細(xì)胞1 h，棄去上清，將5-FU與其合用加入96孔板中，再進(jìn)行如上檢測。

1.4 PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞死亡率

MDA-MB-231細(xì)胞以1.2×105/孔接種到12孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)80%時(shí)， 每孔分別加入5-FU、z-VAD-fmk、5-FU+z-VAD-fmk后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的75%乙醇固定，-20 ℃過夜。檢測之前用預(yù)冷的PBS重懸2次，加入600 μl PI檢測液，4 ℃避光孵育2 h，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5 DAPI染色檢測細(xì)胞核的變化

將MDA-MB-231細(xì)胞以1.2×105/孔接種于12孔板培養(yǎng)24 h，分組給藥，藥物處理24 h，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，PBS洗滌3次，每孔加入600 μl DAPI染色液避光反應(yīng)15 min，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。

1.6 透射電鏡實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞死亡形式

細(xì)胞分別在5-FU、5-FU+z-VAD-fmk作用下培養(yǎng)24 h，用巴氏吸管緩慢收集細(xì)胞，置于2.5%戊二醛中固定，乙醇脫水，LR White樹脂進(jìn)行滲透包埋，切片，檸檬酸鉛與醋酸鈾雙染色，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.7 Western blot檢測凋亡蛋白與壞死性凋亡蛋白的表達(dá)

培養(yǎng)細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)皿中，藥物作用24 h，收集細(xì)胞，加入適量預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃低溫離心機(jī)中12 000 r/min離心30 min，提取蛋白，使用BCA蛋白定量法測各組的蛋白濃度。每組取40 μg蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；使用5%脫脂牛奶封閉2 h，TPBS洗膜3次，每次10 min；加一抗室溫孵育4 h，TPBS洗膜3次；加二抗孵育2 h；TPBS洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，并使用Image J軟件進(jìn)行灰度值掃描。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 5-FU對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT結(jié)果表明，隨著5-FU濃度的增加、作用時(shí)間的延長，MDA-MB-231細(xì)胞的存活率明顯降低(見圖1)。8 μmol/L濃度時(shí)，24,48和72 h細(xì)胞的存活率分別為(68.94±1.17)%，(48.76±1.47)%和(44.15±2.41)%，實(shí)驗(yàn)中將8 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所使用的濃度。

2.2 caspases抑制條件下5-FU對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，5-FU組細(xì)胞存活率[(63.28±3.14)%]明顯下降；與5-FU組相比，5-FU+z-VAD-fmk組細(xì)胞存活率為(51.13±2.65)%(見圖2)，對細(xì)胞增殖抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)。即在caspases抑制條件下，5-FU對MDA-MB-231的增殖抑制作用增強(qiáng)。

圖1 5-FU對MDA-MB-231細(xì)胞存活率的變化Figure 1 Changes of the viability of MDA-MB-231 cells after treated with 5-FU for different time

2.3 PI單染實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的死亡率

PI染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞死亡率為(3.93±0.45)%；與對照組相比，5-FU組細(xì)胞的死亡率[(35.8±2.27)%]明顯增加；與5-FU組相比，5-FU+z-VAD-fmk組細(xì)胞死亡率[(44.3±1.45)%]進(jìn)一步增加。即當(dāng)使用caspases抑制劑z-VAD-fmk時(shí)，5-FU誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞死亡率明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 Caspases抑制條件下，5-FU對MDA-MB-231的增殖抑制作用Figure 2 Effects of 5-FU on MDA-MB-231 cells under the condition of caspases inhibition

2.4 DAPI實(shí)驗(yàn)觀察MDA-MB-231細(xì)胞核的變化

細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色熒光顯微鏡結(jié)果顯示，對照組與z-VAD-fmk組的細(xì)胞核呈淺藍(lán)色，均勻淡染；與對照組相比，5-FU組胞核濃染，出現(xiàn)了核碎裂；與5-FU組相比，5-FU+z-VAD-fmk組細(xì)胞核濃染加深，核碎裂現(xiàn)象加劇(見圖4)。

圖3 PI單染法檢測5-FU和z-VAD-fmk以及兩者聯(lián)用24 h時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞的死亡率Figure 3 Analysis of the cell death rate of MDA-MB-231 cells after treated with 5-FU,z-VAD-fmk and their combination for 24 h by PI staining

圖4 DAPI染色檢測5-FU和z-VAD-fmk單獨(dú)及聯(lián)合使用時(shí)對MDA-MB-231細(xì)胞核的影響Figure 4 Changes of MDA-MB-231 cell nuclei after treated with 5-FU,z-VAD-fmk and their combination by DAPI staining

2.5 MDA-MB-231細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變

電鏡結(jié)果表明，與對照組相比，5-FU作用后的細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)明顯改變，細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)邊聚，線粒體有正常的超微結(jié)構(gòu)，呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化(見圖5)。而5-FU和z-VAD-fmk聯(lián)用組的電鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞破裂，線粒體腫脹、細(xì)胞內(nèi)容物外泄，呈典型的壞死性凋亡形態(tài)學(xué)變化(見圖5)。

圖5 單用5-FU 及與 z-VAD-fmk合用24 h細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Figure 5 Changes of the ultrastructure of the cells after treated with 5-FU and its combination with z-VAD-fmk for 24 h

2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

RIP1是壞死性凋亡通路的關(guān)鍵蛋白，Western blot結(jié)果顯示，單獨(dú)使用 5-FU 組和z-VAD-fmk組均不能激活RIP1蛋白的表達(dá)，而5-FU+z-VAD-fmk 組RIP1蛋白表達(dá)明顯增加(P≤0.05,見圖6)，由單用時(shí)的1.31±0.05增加至3.95±0.20。

3 討論

5-氟尿嘧啶(5-FU)是常用的影響核酸合成的抗癌藥物，能影響DNA的合成，對細(xì)胞具有抑制作用，用于多種腫瘤的治療[7，8]。5-FU耐藥性的發(fā)生成為其臨床使用中的一大威脅，因此克服其耐藥成為關(guān)鍵性問題。壞死性凋亡(necroptosis)是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種非caspases依賴的程序性死亡方式，即在caspases被抑制的情況下，死亡受體與配體相結(jié)合，調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)觸發(fā)壞死性凋亡[9]。壞死性凋亡的誘導(dǎo)與抑制不僅參與機(jī)體的生理調(diào)節(jié)過程，在腦缺血、心肌缺血、急性和慢性神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等多種人類疾病中也具有重要作用。它是一個(gè)主動(dòng)的、信號(hào)依賴的過程，可以被許多因素所誘導(dǎo)，如TOLL樣受體激動(dòng)劑、FAS配體的產(chǎn)物、c-IAP1/2拮抗劑等。有研究表明，壞死性凋亡的誘導(dǎo)劑可激活細(xì)胞死亡而無需“觸動(dòng)”已揭示的最“難以捉摸”并高度可控的腫瘤耐藥機(jī)制[10,11]。因此，引發(fā)癌細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡的方法是治療癌癥的有效手段之一。在caspases被抑制情況下，5-FU可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞通過RIP1和NF-kB通路發(fā)生壞死性凋亡[12]；Smac可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)中，透射電鏡結(jié)果表明，單獨(dú)使用5-FU時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡，而加入pan-caspases抑制劑z-VAD-fmk時(shí)，MDA-MB-231則發(fā)生壞死性凋亡。

細(xì)胞凋亡是受死亡信號(hào)調(diào)節(jié)并伴隨天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶caspases活化的一種細(xì)胞主動(dòng)自殺的死亡方式，凋亡是由多基因嚴(yán)格調(diào)控的過程[14]。有研究報(bào)道，Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中具有重要的控制作用，其蛋白成員之間的協(xié)同作用共同決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序[15,16]。本課題設(shè)置不同劑量的5-FU處理MDA-MB-231細(xì)胞，MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著藥物劑量的增大，5-FU對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率明顯升高。

與其他三組比較，*P≤0.05圖6 單用5-FU和z-VAD-fmk及兩者合用對RIP1蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effects of 5-FU, z-VAD-fmk and their combination on protein expression of RIP1

壞死性凋亡定義為:一種與壞死具有相似的形態(tài)學(xué)特征(細(xì)胞體積及胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹，包膜完整性破壞，內(nèi)容物外泄)，且為非caspases依賴性的程序性細(xì)胞死亡，即在caspases抑制的條件下，死亡受體與配體的結(jié)合可觸發(fā)壞死性凋亡。壞死性凋亡的調(diào)節(jié)涉及一系列分子的表達(dá)與活化，RIP在此過程中發(fā)揮了重要的作用[17]，研究報(bào)道，caspases-8與RIP蛋白的交互表達(dá)可引起壞死性凋亡與凋亡的相互轉(zhuǎn)化[18]。本實(shí)驗(yàn)中，使用pan-caspases抑制劑z-VAD-fmk聯(lián)用后，5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞死亡率明顯增加。通過Western blot檢測壞死性凋亡關(guān)鍵蛋白R(shí)IP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與z-VAD-fmk聯(lián)用時(shí)，RIP1明顯被激活，觸發(fā)壞死性凋亡。

綜上所述，5-FU誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡，但在caspases被抑制的情況下，5-FU通過激活RIP1誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生了壞死性凋亡。本研究不僅加深了對細(xì)胞死亡方式的理解與認(rèn)識(shí)，也為5-FU在腫瘤治療及其多藥耐藥克服的研究、壞死性凋亡誘導(dǎo)劑在臨床中的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步考察。

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5-FU induces necroptosis in breast cancer cells after the inhibition of caspases

ZHANG Zhirui, SUN Xiaojin, CHONG Dianlong, ZHOU Can, REN Kai, LIU Hao*

(FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege,AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,Bengbu233030,China;*Correspondingauthor,E-mail:liuhao6886@foxmail.com)

ObjectiveTo explore the inhibitive effect of 5-fluorouracil(5-FU) on the proliferation of human breast cancer MDA-MB-231 cells and analyze the form of cell death in the condition of caspase inhibition.MethodsMTT assay was used to detect the viability of breast cancer MDA-MB-231 cells after exposed to different concentrations(0,4,8,16,24,32 μmol/L) of 5-FU for screening the appropriate concentration of 5-FU. Then the experiment was divided into four groups:control group, z-VAD-fmk group, 5-FU group, 5-FU+z-VAD-fmk group. The viability of breast cancer was evaluated by MTT assay, the cell death rate was assessed using flow cytometry with PI staining, DAPI staining was performed to demonstrate the cell nucleus changes, the form of cell death was observed under transmission electron microscopy, and Western blot was used to detect the expression of necroptosis-related protein RIP1.ResultsThe appropriate concentration of 5-FU in MDA-MB-231 cells was 8 μmol/L, and the cell survival rates were(68.94±1.17)%, (48.76±1.47)% and (44.15±2.41)% after exposed to 8 μmol/L 5-FU for 24,48,72 h.MTT,PI,DAPI results showed that compared to control group and 5-FU group,the cell survival was significantly decreased in 5-FU+z-VAD-fmk group(P<0.05),and the hyperchromatic nuclei was gradually darkened and karyopyknosis was observed.The electron microscope results indicated that apoptosis occurred in 5-FU group,and the necroptosis happened in 5-FU+z-VAD-fmk group. RIP1 protein was up-regulated clearly after the combined treatment with 5-Fu and z-VAD-fmk.Conclusion5-FU can induce the apoptosis in MDA-MB-231 cells, and it can induce the necroptosis by activating RIP1 when caspases activation is blocked by z-VAD-fmk.

breast cancer; 5-fluorouracil; z-VAD-fmk; apoptosis; caspases; necroptosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372899)；安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目重大項(xiàng)目(KJ2016SD39)

張智瑞，女，1992-04生，碩士，E-mail：824039564@qq.com

2016-07-05

R737.9

A

1007-6611(2016)09-0808-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.006