芽孢桿菌對(duì)番茄抗枯萎病防御性酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)

張 亮，王改蘭

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

尖孢鐮刀菌所致的番茄枯萎病是一種嚴(yán)重威脅番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的土傳性病害[1]。目前應(yīng)用根圍促生細(xì)菌等有益微生物來(lái)控制作物病害的發(fā)生已經(jīng)成為生物防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2-3]。以過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）等為代表的相關(guān)植物防御性酶在植物抵抗病蟲(chóng)害的生理生化過(guò)程中起著非常重要的作用。PPO能夠催化植物體內(nèi)酚類(lèi)物質(zhì)形成醌從而抑制病原菌生長(zhǎng)，并能抑制病原菌果膠分解酶和纖維素分解酶的活性[4]。SOD能夠清除植物體內(nèi)活性氧和H2O2[5]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）參與抗病有關(guān)的次生代謝與其催化反應(yīng)[6]。植物經(jīng)誘導(dǎo)所分泌的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶能夠降解病原菌細(xì)胞，從而抵御病原菌的侵染[7]。通過(guò)研究植物相關(guān)防御性酶活性的變化來(lái)了解植物獲得系統(tǒng)性抗性和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性已成為研究微生物-植物互作機(jī)理的重要共識(shí)途徑[8]。大量研究結(jié)果表明，芽孢桿菌和假單胞菌等生防菌株可以誘導(dǎo)寄主植物通過(guò)改變細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、提高病程蛋白、產(chǎn)生防御性酶等作用機(jī)制來(lái)獲得寄主植株自身的系統(tǒng)性抗性，從而起到抵御病原菌侵染的作用[9-11]。多粘芽孢桿菌SR10和解淀粉芽孢桿菌SR22篩選分離于健康大豆植株，具有對(duì)尖孢鐮刀菌等病原菌良好的室內(nèi)抑菌能力和番茄枯萎病防病效果[12]。本研究采用菌株SR10、SR22誘導(dǎo)番茄抗枯萎病菌的盆栽試驗(yàn)，測(cè)定了POD、PPO等7類(lèi)重要防御性酶的早期活性變化，揭示了2株芽孢菌對(duì)番茄寄主系統(tǒng)性防御機(jī)制的誘導(dǎo)激活性能，明確并完善了其生防機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

多粘芽孢桿菌SR10和解淀粉芽孢桿菌SR22由筆者分離于田間土壤種植的大豆根內(nèi)。病原菌為尖孢鐮刀菌番茄專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersic，F(xiàn)orl）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)采取NBY培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)肉湯粉8 g，酵母提取物2 g、磷酸氫二鉀2 g、磷酸二氫鉀0.5 g、葡萄糖2.5 g、1 mol/L七水硫酸鎂1 mL、去離子水1 L）。真菌培養(yǎng)采用PDA配方培養(yǎng)基（SIGMA公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

采用溫室盆栽法。番茄品種為Bonny Best。土壤為堿性砂土（3.6%有機(jī)質(zhì)，pH 8.0），采自15～20 cm土層小麥耕作層。選取長(zhǎng)勢(shì)相同的4葉1心番茄幼苗作為供試植株。感病土壤配制采用拌種法[13]，即將病原菌接種于PDB液體培養(yǎng)基于24 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)120 h后，經(jīng)雙層滅菌紗布過(guò)濾，用無(wú)菌水稀釋至1×106CFU/mL，與供試土壤按1∶10體積質(zhì)量比混合制備而成。生防菌接種采用超細(xì)滅菌泥炭裹根法[14]，即誘導(dǎo)前1 d，將經(jīng)24 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h的生防菌離心，經(jīng)生理鹽水重新懸?。?×109CFU/mL），與輻照滅菌泥炭按1∶10體積質(zhì)量比制備成生防泥炭（1×108CFU/mL）。誘導(dǎo)時(shí)，取3 g生防泥炭均勻包裹于番茄幼苗根部，并移栽至感病土壤中。

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)6個(gè)處理，分別為：陰性對(duì)照，接種清水（CK）；陽(yáng)性對(duì)照，接種番茄枯萎病菌（Forl）；單獨(dú)接種生防菌SR10（SR10）；接種生防菌SR10與病原菌（SR10＋Forl）；單獨(dú)接種生防菌SR22（SR22）；接種生防菌SR22與病原菌（SR22＋Forl）。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8盆，每盆（直徑10 cm）添加500 g感病土壤并移栽1株番茄。按上述方法接種芽孢桿菌誘導(dǎo)劑并移栽后，分別于第0、24、48、72、96、120、144 h時(shí)，隨機(jī)對(duì)每個(gè)處理選取3盆，采集倒數(shù)第2片番茄葉子并立即置于液氮中，于-80 ℃低溫保存供防御性酶測(cè)定。日常管理25 d后收獲并調(diào)查統(tǒng)計(jì)各處理的病情指數(shù)。

病情指數(shù)采用3級(jí)分類(lèi)統(tǒng)計(jì)[15]，0級(jí)為無(wú)癥狀；1級(jí)為根尖部位輕度褐色；2級(jí)為維管組織中度褐變，但沒(méi)超過(guò)土壤基線；3級(jí)為土壤基線以上維管組織重度褐變或植株枯萎死亡。其計(jì)算公式為：病情指數(shù)＝∑（病情等級(jí)×發(fā)病株數(shù)÷（總植株數(shù)×最高病情等級(jí)）×100。防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）÷對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.2.2 粗酶液的提取

稱(chēng)取2 g番茄葉片，加入2 mL的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH為6.8）以及少許石英砂，冰浴研磨后于4 ℃、15 000 r/min離心20 min，取上層清液即為粗酶液，保存于4 ℃并于24 h內(nèi)使用[16]。粗酶液蛋白含量使用ND-1000核酸蛋白濃度檢測(cè)儀（美國(guó)NanoDrop公司）測(cè)定。

1.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定

4.4 mL的反應(yīng)體系中含有3 mL的50 μmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）、1 mL的0.1 mol/L鄰苯二酚以及400 μL粗酶液。加入粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，室溫條件下測(cè)定10 min內(nèi)在490 nm下吸光值讀數(shù)的變化。以每分鐘吸光值增加0.01作為一個(gè)酶活性單位U，酶的比活以U/mg蛋白表示[17]。

1.2.4 過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定

3.195 mL反應(yīng)體系中含有3 mL的0.05 mol/L磷酸緩沖液（7.8）、15 μL愈創(chuàng)木酚、30 μL的15% H2O2以及150 μL粗酶液。加入粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，室溫條件下測(cè)定30 s內(nèi)在470 nm下吸光值的變化。以每分鐘增加0.01作為1個(gè)單位的酶活性單位U，酶的比活以U/μg蛋白表示[18]。

1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定

4.3 mL的反應(yīng)體系中含有3 mL的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）、300 μL 26 mmol/L蛋氨酸、300 μL 0.75 μmol/L NBT、300 μL 22 μmol/L維生素B2以及 400 μL粗酶液。25 ℃、4 000 lx 光照強(qiáng)度下反應(yīng)15 min后置于黑暗條件下5 min結(jié)束反應(yīng)，并在560 nm下測(cè)定其吸光值。以抑制NBT還原50%的酶量作為一個(gè)單位的酶活性單位U，酶的比活以U/mg蛋白表示[19]。

1.2.6 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測(cè)定

5 mL的反應(yīng)體系中含有3.9 mL的0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 8.8）、1 mL的0.6 mmol/L苯丙氨酸以及100 μL粗酶液，以未添加苯丙氨酸的反應(yīng)液作為對(duì)照。加入粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，室溫條件下測(cè)定30 min內(nèi)在290 nm下吸光值的差值。以每小時(shí)增加0.01作為1個(gè)單位的酶活性單位U，酶的比活以U/μg蛋白表示[20]。

1.2.7 β-1,3葡萄糖酶活性測(cè)定

將62.5 μL的4%海帶多糖與62.5 μL粗酶液混勻并置于37 ℃條件下靜置30 min，然后加入1 mL的DNS試劑終止反應(yīng)并迅速放入沸水浴中加熱顯色5 min，流水冷水至室溫后于500 nm下測(cè)定吸光度值，以沸水浴10 min失活的酶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，以吸光度差值（樣品液A值減去標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照A值）從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出產(chǎn)生的葡萄糖量。相同反應(yīng)下以加入0～20 mg/mL葡萄糖替代粗酶液來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以37 ℃條件下每克新鮮組織每分鐘催化昆布多糖所產(chǎn)生1 μg葡萄糖的酶量作為一個(gè)酶活單位U，酶的比活以U/mg蛋白表示[21]。

1.2.8 幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定

將混有1 mL的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 5.0）、200 μL的4%膠狀幾丁質(zhì)溶液以及200 μL粗酶液于37 ℃下靜置30 min，然后放入沸水浴中2 min并終止反應(yīng)，隨后于12 000 r/min 離心1 min。吸取1 mL上清液并加入2 mL鐵氰化鉀溶液并置于沸水浴中15 min，流水冷卻至室溫后于420 nm下測(cè)定吸光值。相同反應(yīng)下以加入不同濃度的乙酰氨基葡萄糖取代粗酶液來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以37 ℃條件下水解幾丁質(zhì)每小時(shí)降低1 μmol/L糖的酶量作為一個(gè)酶活單位U，酶的比活以U/mg蛋白表示[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析，并采用SAS 9.1進(jìn)行方差分析，顯著性水平采用Duncan’s新復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌株SR10和SR22后番茄對(duì)枯萎病的抗病效果

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），接種芽孢桿菌25 d后，與單接病原菌處理相比，F(xiàn)orl+SR10和Forl+SR22對(duì)番茄枯萎病具有顯著的防治效果，并對(duì)植株生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，其防治效果分別為41.11%和51.11%，株高分別增加了114%和115%，鮮質(zhì)量分別提高了453%和447%，干質(zhì)量分別提高了178%和189%。

2.2 菌株SR10和SR22誘導(dǎo)番茄防御性酶活性變化分析

2.2.1 菌株SR10和SR22誘導(dǎo)番茄PPO酶活性變化

圖1表明，與對(duì)照相比，接種病原菌或芽孢桿菌后，PPO酶活性持續(xù)性升高，單接種病原菌的處理在96 h達(dá)到最高，此時(shí)的PPO酶活性比對(duì)照增加了28%；單接芽孢桿菌處理的PPO酶活性則至120 h達(dá)到最高，此時(shí)其PPO酶活性比對(duì)照增加了39%～44%。與單接病原菌處理相比，同時(shí)接種芽孢桿菌和病原菌的處理（Forl+SR10和Forl+SR22）在120 h時(shí)出現(xiàn)PPO酶活峰值，此時(shí)其PPO酶活性比單接病原菌處理分別增加了9%和13%。

2.2.2 菌株SR10和SR22誘導(dǎo)番茄POD酶活性變化

從圖2可以看出，與對(duì)照相比，接種病原菌或芽孢桿菌24 h后，POD酶活性持續(xù)性升高；單接芽孢桿菌處理均在96 h達(dá)到酶活峰值，此時(shí)其POD酶活性比對(duì)照增加了31%和47%；單接病原菌處理的POD酶活性則在120 h達(dá)到峰值，此時(shí)其酶活性比對(duì)照增加了39%。與單獨(dú)接種病原菌相比，接種芽孢桿菌與病原菌的處理的酶活變化差異不明顯，但表現(xiàn)不同，其中Forl+SR10處理在120 h峰值時(shí)的POD酶活性比單接病原菌處理升高了4%；而Forl+SR20處理的POD酶活峰值則出現(xiàn)在144 h，且此峰值POD酶活性比單接病原菌處理降低了2%。

表1 芽孢桿菌SR10、SR22對(duì)溫室番茄生長(zhǎng)及枯萎病病情指數(shù)的影響

圖1 芽孢桿菌SR10、SR22誘導(dǎo)番茄PPO酶活性變化

圖2 芽孢桿菌SR10、SR22誘導(dǎo)番茄POD酶活性變化

2.2.3 菌株SR10和SR22誘導(dǎo)番茄SOD酶活性變化

從圖3可以看出，與對(duì)照相比，接種病原菌或芽孢桿菌后，SOD酶活性均持續(xù)升高；單接病原菌處理的SOD酶活性在96 h時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)其SOD酶活性比對(duì)照增加了53%；單接芽孢桿菌處理的SOD酶活性分別在96 h（SR10）和72 h（SR22）時(shí)達(dá)到最高，其峰值時(shí)的酶活性比對(duì)照分別增加了82%和100%。與單接病原菌相比，接種芽孢桿菌和病原菌的處理的SOD酶活變化差異明顯，其峰值SOD酶活性分別比單接病原菌處理增加了38%（Forl+SR10，96 h）和27%（Forl+SR20，72 h）。

2.2.4 菌株SR10和SR22誘導(dǎo)番茄PAL酶活性變化

從圖4可以看出，與對(duì)照相比，盆栽24 h后，接種病原菌或芽孢桿菌處理的PAL酶持續(xù)升高，并分別于96、120 h達(dá)到最高，其峰值時(shí)的PAL酶活性比對(duì)照增加了11%～41%；單接病原菌處理在96 h達(dá)到最高，此時(shí)其PAL活性比對(duì)照增加了11%；單接芽孢桿菌處理（SR22和SR10）在120 h達(dá)到最高，此時(shí)其PAL活性分別比對(duì)照增加了27%和29%。與單接病原菌相比，接種芽孢桿菌和病原菌的處理（Forl+SR10和Forl+SR22）均表現(xiàn)出PAL酶活性顯著提高，其峰值PAL酶活性分別比單接病原菌處理增加了23%（96 h）和27%（120 h）。

2.2.5 菌株SR10和SR22誘導(dǎo)番茄β-1,3葡聚糖酶活性變化

從圖5可以看出，與對(duì)照相比，接種病原菌和芽孢桿菌處理的葡聚糖酶活性總體持續(xù)增加，并在120 h內(nèi)達(dá)到最高；單接病原菌處理的葡聚糖酶活性在120 h時(shí)達(dá)到最高，比對(duì)照增加了14%；單接芽孢桿菌處理的葡聚糖酶峰值則分別在96 h（SR22）、120 h（SR10）達(dá)到最高，其葡聚糖酶活性分別比對(duì)照增加74%和31%。與單接病原菌相比，接種芽孢桿菌和病原菌處理的葡聚糖酶活性得到明顯提高，F(xiàn)orl+SR10和Forl+SR20最高葡聚糖酶活性分別比單接病原菌處理增加15%和26%，且Forl+SR22處理顯著高于Forl+SR10菌株處理。

2.2.6 菌株SR10和SR22誘導(dǎo)番茄幾丁質(zhì)酶活性變化

圖3 芽孢桿菌SR10、SR22誘導(dǎo)番茄SOD酶活性變化

圖4 芽孢桿菌SR10、SR22誘導(dǎo)番茄PAL酶活性變化

圖5 芽孢桿菌SR10、SR22誘導(dǎo)番茄β-1,3葡萄糖酶活性變化

圖6 芽孢桿菌SR10、SR22誘導(dǎo)番茄幾丁質(zhì)酶活性變化

從圖6可以看出，與對(duì)照相比，接種病原菌或芽孢桿菌后，各處理的幾丁質(zhì)酶活性均持續(xù)增加，并在120 h內(nèi)達(dá)到最高，其中單接病原菌處理的幾丁質(zhì)酶活性在96 h達(dá)到最高，比對(duì)照增加了43%；單接芽孢桿菌處理的幾丁質(zhì)酶活性分別在96 h（SR10）和120 h（SR22）內(nèi)達(dá)到最高，比對(duì)照分別增加了88%和103%。與單接病原菌相比，接種芽孢桿菌和病原菌的處理（Forl+SR10和Forl+SR22）的幾丁質(zhì)酶活性在短時(shí)間內(nèi)得到顯著提高，并在120 h時(shí)表現(xiàn)出最高酶活性，分別比單接病原菌處理增加了39%和44%。

3 討論與結(jié)論

由病原菌所誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）和由非致病菌所介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）是植物抵御病菌侵染的重要機(jī)制[23-24]。通過(guò)誘導(dǎo)植物防御性酶、PR蛋白以及植保素的積累等生理生化變化來(lái)抵御病原菌的侵害是根圍促生菌和有益內(nèi)生菌等生防微生物非常重要的作用機(jī)制之一[25-26]。例如，Sun等[27]研究發(fā)現(xiàn)接種芽孢桿菌KY-21能夠誘導(dǎo)香蕉體內(nèi)POD、PPO酶活性快速增加，從而對(duì)尖孢鐮刀菌引起的枯萎病起到抑制效果。Liu等[28]報(bào)導(dǎo)接種芽孢桿菌SY1能夠誘導(dǎo)茄子體內(nèi)SOD活性顯著提高103.2%。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)接種芽孢桿菌B579能夠誘導(dǎo)黃瓜PLA酶活性顯著增強(qiáng)并抑制枯萎病的發(fā)生。Hyakumachi等[30]研究發(fā)現(xiàn)，蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）能夠誘導(dǎo)番茄植株幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶基因表達(dá)并降低青枯病的發(fā)生。雖然目前關(guān)于芽孢桿菌誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)性抗性的研究較多，但通過(guò)芽孢桿菌誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性來(lái)防治Forl型番茄枯萎病的報(bào)道并不多見(jiàn)。

本研究采用根部包裹接種法對(duì)多粘芽孢桿菌SR10和解淀粉芽孢桿菌SR22誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)性抗性（ISR）以及病原菌Forl誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）的相關(guān)防御性酶活性變化進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，受病原菌對(duì)番茄SAR誘導(dǎo)效應(yīng)的影響，單獨(dú)接種Forl能夠在短時(shí)間內(nèi)增加番茄PPO、POD等防御性酶活性，即系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）得到了提高；而單獨(dú)接種多粘芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌亦表現(xiàn)出短時(shí)間內(nèi)迅速提高番茄PPO、POD、SOD、PAL、葡萄糖酶以及幾丁質(zhì)酶等相關(guān)防御性酶活性的能力，即誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性（ISR），這些研究結(jié)果驗(yàn)證了前人有關(guān)植物誘導(dǎo)抗性的研究結(jié)果。本研究供試的多粘芽孢桿菌SR10與解淀粉芽孢桿菌SR22對(duì)番茄不同防御性酶活性變化的誘導(dǎo)效果以及峰值時(shí)間的影響存在差異，這可能與作為產(chǎn)生誘導(dǎo)因子的生防菌株自身代謝特性有關(guān)[21]。試驗(yàn)第25天時(shí)的枯萎病防治效果統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，同時(shí)接種病原菌和多粘芽孢桿菌SR10與解淀粉芽孢桿菌SR22的番茄植株枯萎病防治效果分別達(dá)到41.11%和51.11%，這很可能與病原菌脅迫條件下芽孢桿菌的誘導(dǎo)抗性有關(guān)，即受SAR與ISR的共同作用影響，番茄相關(guān)防御性酶活性得到顯著增強(qiáng)，從而提高了番茄抵御枯萎病病原菌侵染的能力。

研究揭示了多粘芽孢桿菌SR10和解淀粉芽孢桿菌SR22通過(guò)誘導(dǎo)并提高番茄系統(tǒng)性抗性來(lái)抑制Forl型番茄枯萎病病原菌侵染的生理學(xué)特性，進(jìn)一步論證和完善了2株芽孢桿菌抑制Forl型尖孢鐮刀菌侵染、防治番茄枯萎病的作用機(jī)制，為后續(xù)生防工作提供了必要的理論基礎(chǔ)。