人肺腺癌A549細(xì)胞株胰島素受體與放射敏感性的實驗研究

?！〗?　張顯超　 張本華　李　貞　 張　嫻　 張國慶　許　昕　劉寶軍

(1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 泰安　271000； 　2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬新泰醫(yī)院腫瘤科，山東 新泰　271200)

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人肺腺癌A549細(xì)胞株胰島素受體與放射敏感性的實驗研究

常金1張顯超2張本華1李貞1張嫻1張國慶1許昕1劉寶軍1

(1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 泰安271000； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬新泰醫(yī)院腫瘤科，山東 新泰271200)

目的研究人肺腺癌A549細(xì)胞放射治療組與對照組的胰島素受體(IR)的表達(dá)，探討胰島素受體與放射敏感性的關(guān)系。方法將隨機(jī)分為對照組(0 Gy)和放射治療組(劑量為2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy、12 Gy 6 MV X線)人肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行放射治療，放療后培養(yǎng)25天后用免疫組化S-P法測定肺腺癌A549細(xì)胞株各標(biāo)本的胰島素受體表達(dá)情況。結(jié)果胰島素受體(IR)主要分布于A549細(xì)胞膜上。小劑量(2 Gy、4 Gy)組與對照組(0 Gy)胰島素受體表達(dá)強陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。6 Gy、8 Gy、10 Gy、12 Gy放射治療組與對照組相比，胰島素受體強陽性率與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.005)，其中12 Gy劑量組強陽性率最高。結(jié)論胰島素受體與放射敏感性負(fù)相關(guān)，ISR強陽性的腫瘤細(xì)胞對射線抗拒。胰島素受體有可能成為預(yù)測肺癌放射敏感性的分子標(biāo)志物。

A549細(xì)胞株；胰島素受體 ；免疫組織化學(xué)；放療；放射敏感性；

肺癌放射治療的趨勢為個體化的精準(zhǔn)放療，隨著放療技術(shù)的進(jìn)展，IMRT、IGRT、TOMO及質(zhì)子放療等放療技術(shù)應(yīng)用于臨床，同時分子靶向藥物、化療及免疫治療等廣泛應(yīng)用，但是目前肺癌的5年生存率僅為17.4%[1]。大約65%～75%的惡性腫瘤患者需要接受放射治療[2]，為了進(jìn)一步提高肺癌的生存率，我們需要對肺癌放療敏感性進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)判，來實現(xiàn)對肺癌患者的個體化放療的療效精確預(yù)測，實現(xiàn)肺癌的局部控制率及5年生存率的提高。近年的流行病學(xué)研究表明[3-11]，腫瘤發(fā)生整體風(fēng)險在1型與2型糖尿病的患者中有升高趨勢 (RR=1.17)。其他的研究[12]也顯示高于正常生理濃度的胰島素有可能激活胰島素受體(IR)及胰島素樣生長因子受體(IGF-1R)通路促進(jìn)腫瘤生長與增殖。也有文獻(xiàn)[13-16]報道了胰島素受體在腫瘤組織中高表達(dá)，提示腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移與胰島素受體(IR)及信號通路可能相關(guān)。但是既往的研究沒有涉及IR與放射敏感性的相關(guān)性。因此，本研究通過檢測人肺腺癌A549細(xì)胞不同劑量的放射治療組與對照組IR的表達(dá)情況，探討胰島素受體與放射治療劑量的關(guān)系，為肺癌的放射敏感性的預(yù)測提供新的實驗依據(jù)，為肺癌的臨床決策提供新的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人肺腺癌A549細(xì)胞株由泰山醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供。細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)箱里，參數(shù)為：37℃、5%的CO2飽和濕度。細(xì)胞培養(yǎng)液配方為：新生牛血清10%，青霉素100 μg/ml,鏈霉素100 μg/ml。細(xì)胞傳代：顯微鏡下觀察，選取無污染、生長良好的A549細(xì)胞每2～3天傳代一次。取處于對數(shù)生長期的、無污染的A549細(xì)胞進(jìn)行實驗，放射治療后繼續(xù)培養(yǎng)25天，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2細(xì)胞分組對實驗用人A549細(xì)胞隨機(jī)分為2組：對照組和放射治療組，放射治療組又分為6個放療劑量等級(2 GY組、4 GY組、6 GY組、8 GY組、10 GY組、12 GY組)。實驗組及6組放射治療組每組各3個培養(yǎng)瓶，共21瓶。隨機(jī)分組步驟為：第一步將21個培養(yǎng)瓶分別用數(shù)字1～21編號；第二步查找隨機(jī)數(shù)字表，從任一位置從上到下抄寫21個隨機(jī)數(shù)字，依次并一一對應(yīng)寫在步驟1下面；第三步，將這些隨機(jī)數(shù)字從小到大用1至21標(biāo)記；最后選取培養(yǎng)瓶，A組取標(biāo)記的1～3培養(yǎng)瓶，B4～6，C7～9，D10～12，E13～15，F(xiàn)16～18，G19～21。

1.3放射治療將隨機(jī)分組、生長狀況好的A549細(xì)胞，在泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放療中心應(yīng)用新華醫(yī)用電子直線加速器(LA)進(jìn)行放射治療，放療中保持合適的溫度、濕度及環(huán)境清潔。直線加速器參數(shù)：6 MV X線放療，劑量率為2 Gy/分鐘。放射治療后立即送實驗室繼續(xù)培養(yǎng)25天。

1.4免疫組化胰島素受體的判定采取免疫組化S-P法，顯微鏡下觀察A549細(xì)胞株對照組(0 Gy)與各個劑量的放射治療組細(xì)胞的IR表達(dá)情況，并拍照與記錄。CD220胰島素受體抗體(北京市博奧森公司)，工作液稀釋倍數(shù)1∶20。SP-9001免疫組化染色試劑盒(北京市中杉金橋公司)，DAB顯色試劑盒(北京市中杉金橋公司)。

1.5免疫組化結(jié)果判定免疫組化結(jié)果判定在泰山醫(yī)學(xué)院中心實驗室的專業(yè)技術(shù)人員指導(dǎo)和二次確認(rèn)下進(jìn)行。(1)胰島素受體的定位：以鏡下棕黃色或黃色顆粒為IR表達(dá)陽性的標(biāo)準(zhǔn)。(2)胰島素受體的表達(dá)分級：陰性為無染色，陽性為淺染色，強陽性為深染色。在顯微鏡高倍野(400×)下觀察A549細(xì)胞胰島素受體染色情況，由實驗室技術(shù)人員隨機(jī)選取每張切片4～5個高倍野(400×)記數(shù)，依據(jù)染色情況進(jìn)行分級記錄，每個實驗組各自記數(shù)1000個細(xì)胞左右。

2　結(jié)　果

2.1胰島素受體(IR)表達(dá)定位實驗組及放射治療組胰島素受體(IR)均普遍分布，分布位置主要位于細(xì)胞膜，也有部分細(xì)胞的胞質(zhì)染色。見圖1。

2.2胰島素受體(IR)表達(dá)分級對比胰島素受體的陽性表達(dá)率及強陽性表達(dá)率，結(jié)果見表1。①劑量為2 Gy、4 Gy的放射治療組的胰島素受體(IR)與對照組(0 Gy)的表達(dá)的強陽性率基本一致(P>0.05)。而放射治療組(6 Gy、8 Gy、10 Gy、12 Gy組)與對照組(0 Gy)相比，其胰島素受體(IR)表達(dá)強陽性率明顯升高，具有顯著的差異(P<0.005)。②劑量為2 Gy與4 Gy放射治療組的組間胰島素受體(IR)表達(dá)強陽性率基本一致(P>0.05)，而6 Gy、8 Gy、10 Gy、12 Gy放射治療組的胰島素受體(IR)表達(dá)強陽性率均顯著高于2 Gy放射治療組，具有顯著的差異(P<0.005)。③劑量為4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy的放射治療組各組之間的統(tǒng)計學(xué)對比顯示，隨著射線劑量增加，胰島素受體(IR)表達(dá)強陽性率顯著升高，各組之間具有顯著性差異(P<0.005)。④從放射治療劑量與胰島素受體表達(dá)強陽性率的關(guān)系圖(圖2)分析顯示，A549細(xì)胞在接受低于4 Gy放射治療時，其胰島素受體(IR)表達(dá)強陽性率無明顯變化，但是隨著放療劑量的增加，細(xì)胞的胰島素受體(IR)表達(dá)強陽性率也逐漸增加，其中強陽性率最高是劑量為12 Gy的放射治療組。

圖1　胰島素受體表達(dá)(8 Gy)

放療組別細(xì)胞計數(shù)淺染色深染色強陽性率(%)0GY104880424423.32GY118993225721.64GY104379824523.56GY108171836333.68GY114368046340.510GY108461047443.712GY106239666662.7合計76504938271235.5

注:χ2=624.26，P<0.001。

圖2　A549細(xì)胞IR強陽性率與放射治療劑量關(guān)系

X軸為6MV X射線劑量，Y軸為IR強陽性表達(dá)率。

3　討　論

放射治療是一種治療腫瘤的歷史悠久的、重要的、療效確切的治療方法，既往的數(shù)據(jù)顯示接受放射治療的患者大約占所有腫瘤患者的65%～75%[2]。對于由于身體狀況、腫瘤分期及患者意愿等各種原因未手術(shù)的腫瘤患者，放療是其局部治療最佳的選擇。隨著放療技術(shù)的進(jìn)展， IMRT、IGRT、TOMO及質(zhì)子放療等放療技術(shù)應(yīng)用于臨床，同時分子靶向藥物及免疫治療廣泛應(yīng)用，但是目前肺癌的5年生存率為17.4%[1]。因此，預(yù)測肺癌患者的個體放射敏感性及提高個體的放射敏感性，對肺癌患者個體化的精準(zhǔn)放療至關(guān)重要，因此放射敏感性的個體化預(yù)測被認(rèn)為是放射治療的圣杯[2]。

對于實體腫瘤，目前放射敏感性預(yù)測的傳統(tǒng)方法主要有：SF2法，PCC+Fish，Tpot及“Comet”分析等，其共同的缺點為需要進(jìn)行原代細(xì)胞的培養(yǎng)，成功率低，無法應(yīng)用于臨床大樣本的檢測[2]。改良的“Comet”分析雖然有了很大的改進(jìn)，但是也未能夠得到臨床的廣泛應(yīng)用。目前，多種分子標(biāo)志物有可能與腫瘤的放射敏感性相關(guān)，有可能預(yù)測腫瘤的放射敏感性[17-22]。對非小細(xì)胞肺癌[17-21]，多種分子標(biāo)志物如：(1)癌基因：Mdm2、Ras癌基因；(2)抑癌基因p53、乳癌易感基因1 (BRCA1)；(3)凋亡相關(guān)基因Bcl-2及凋亡抑制因子Survivin；(4)生長因子受體：表皮生長因子受體(EGFR)、VEGF及具有酪氨酸激酶活性的IGF-1R胰島素樣生長因子1受體；(5)細(xì)胞周期調(diào)控基因p14ARF、Cyclins；(6)乏氧有關(guān)因子：缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1；(7) DNA修復(fù)：ATM，切除修復(fù)交叉互補基因1(ERCC1)、DNA結(jié)合蛋白Ku80(DNA-PK組成之一)、其他分子標(biāo)記物如NF-κB、哺乳動物生物鐘控系統(tǒng)基因mPeriod2(mPer2)、核苷酸還原酶亞單位M1(RRM1)、胸苷合成酶(TS)、β-微管蛋白III、DNA錯配修復(fù)基因等；(8)炎性介質(zhì)[23-24]：COX-2等可以作為預(yù)測非小細(xì)胞肺癌放化療敏感性的分子標(biāo)志物，但是上述產(chǎn)品對放療敏感性的預(yù)測均未大規(guī)模的應(yīng)用于臨床。

另外，尹利杰[25]的研究表明，非小細(xì)胞肺癌的放療近期療效與Survivin及K-ras蛋白表達(dá)明顯相關(guān)，Survivin及K-ras蛋白顯著降低非小細(xì)胞的放療局部控制率。趙瑩瑩[26]的研究提示，DNA-PKcs與 XRCCl蛋白高表達(dá)降低放療療效，而PCNA蛋白高表達(dá)可提高放療療效。提示檢測Survivin、K-ras、XRCCl、DNA-PKcs和PCNA蛋白有可能預(yù)測NSCLC放射治療的近期療效。也有研究[27]提示Caspase3低表達(dá)、suvrivin高表達(dá)有可能成為一種獨立性因素，預(yù)示術(shù)后NSCLC患者具有不良的預(yù)后。

但是，目前尚沒有被普遍認(rèn)可并應(yīng)用于臨床的指標(biāo)來預(yù)測個體的腫瘤放射敏感性。而既往對于胰島素受體通路與腫瘤的相關(guān)性的研究，主要集中IGF-1R受體及傳導(dǎo)通路的研究上，已經(jīng)研發(fā)出多種靶向IGF-1R的拮抗劑、單克隆抗體及靶向下游信號通路上的分子靶向藥物[28-29]，而對腫瘤的胰島素受體IR的研究及藥物涉及甚少。

本實驗對人肺腺癌A549細(xì)胞的胰島素受體(IR)與放射治療的關(guān)系進(jìn)行研究，應(yīng)用能量為6 MV的X線對肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行放射治療，劑量率為2 Gy/分鐘，放療劑量分別為2 GY、4 GY、6 GY、8 GY、10 GY和12 GY。結(jié)果示：A549細(xì)胞在接受低于4 Gy放射治療時，IR表達(dá)強陽性率無明顯變化(P>0.05)，但是隨著放療劑量的增加，IR表達(dá)強陽性率也逐漸增加，其中強陽性率最高是劑量為12 Gy的放射治療組的(P<0.005)，有統(tǒng)計學(xué)差異。本實驗結(jié)果對IR表達(dá)非強陽性的人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞，細(xì)胞的IR表達(dá)率在低劑量區(qū)(0～4 Gy)存在一個相對平坦的區(qū)域，提示有可能存在一個閾值，該閾值有可能與A549的原生的放射敏感性有關(guān)，需要我們進(jìn)一步的研究。隨著放射治療劑量的增加，其IR表達(dá)非強陽性細(xì)胞的比例逐漸降低，而提示6 MV X射線對IR表達(dá)非強陽性細(xì)胞具有相對強烈的殺傷能力。而對于IR表達(dá)強陽性的人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞，其分布在低劑量區(qū)(0～4 Gy)放療時與對照組基本一致，而隨著射線劑量增加，IR表達(dá)強陽性細(xì)胞的比例顯著升高，提示胰島素受體強陽性的細(xì)胞則表現(xiàn)出對放射治療不敏感，有可能導(dǎo)致腫瘤的局部控制率降低。

胰島素受體的高表達(dá)引起放射敏感性降低的分子機(jī)制可能與胰島素受體及下游的信號通路激活有關(guān)系，也有可能通過激活I(lǐng)GF/INS 雜合受體，使得IGF信號通路與Insulin/IR系信號通路相互結(jié)合，協(xié)同刺激細(xì)胞的生長于增殖[15]。胰島素受體信號的激活依靠2個主要的信號通路，MARK(絲裂原活化蛋白激酶)與PI3K(磷脂酰肌醇3 激酶)信號通路。MARK通路可以激活癌基因、轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，是腫瘤細(xì)胞生長、合成、分裂、增殖的中心環(huán)節(jié)[30-31]。而PI3K通路可以激活細(xì)胞增殖與存活的效應(yīng)分子，抑制凋亡。者兩個信號通路的激活，有可能促進(jìn)了放射損傷的修復(fù)，抑制凋亡，促進(jìn)了放射抗拒的產(chǎn)生。另外也不能排除其他的信號通路及途徑[15]如：PTEN 蛋白，WNT 信號通路及單核苷酸多態(tài)性(SNP)等，需要我們進(jìn)一步深入研究。

目前的研究證實，多種人類的分子標(biāo)志物參與了肺癌放射敏感性的調(diào)控，而且許多的基因、分子之間又有相互的促進(jìn)、拮抗作用，組成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而本研究提示胰島素受體及其下游的信號通路與肺癌的內(nèi)在放射敏感性調(diào)控有關(guān)，胰島素受體(IR)的表達(dá)率有可能作為肺癌個體化放射敏感性預(yù)測的敏感性及獨立性的指標(biāo)之一，有可能成為肺癌的放射治療計劃的制定及近期放療預(yù)后預(yù)測的指標(biāo)之一。在臨床治療中我們有可能將胰島素受體的高表達(dá)作為患者放療的敏感性指標(biāo)之一，判斷患者的放療療效，制定更加合理的治療方案。這需要我們進(jìn)一步的將現(xiàn)在的數(shù)據(jù)與臨床患者的放射治療進(jìn)一步結(jié)合，探討胰島素受體(IR)與放療近期療效的關(guān)系，并進(jìn)一步應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方法探討胰島素受體(IR)與放射劑量關(guān)系的分子機(jī)制，早日實現(xiàn)腫瘤患者的精準(zhǔn)的個體化治療。

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Experimental study for the relationship between radiosensitivity and insulin receptor expression rate of lung cancer A549 cell lines

CHANG Jin ZHANG Xian-chao ZHANG Ben-hua ZHANG Xian ZHANG Guo-qing XU Xin LIU Bao-jun

(1. Dept.of Oncology, Affiliated Hospital of Taishan Medical University,Taian 271000,China; 2. Xintai People's Hospital,Xintai 271200,China)

Objective：To find relation between insulin receptorand cancer radiosensitivity. Methods： A549 cells were randomly divided into two groups , matched group (0 Gy) and radiation groups (2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy, 10 Gy, 12 Gy with 6MV X rays). The cells were radiated and the cells were cultured for 25 days after radiotherapy and expression of lung adenocarcinoma A549 cell line samples were detected by Immunohistochemistry (SP method ).Results： Insulin receptor was located mainly in the A549 cell membrane. There was no difference in the expression of insulin receptorbetween small dose (2 GY, 4 GY) groups and control group (0 GY). The groups with the doses of 6 GY, 8 GY, 10 GY and 12 GY were compared with the control group, and the insulin receptor expression had statistical significance (P<0.005), and the highest dose group with dose of 12 GY had strongest positive expression. Conclusion：Insulin receptor and radiosensitivity have negative correlation, and tumor cells with ISR strong positive are resistant to radiation.Insulin receptor may become one of cancer radiosensitivity predictive molecular markers.

A549 cells; insulin receptor; immunohistochemistry; radiotherapy; radiosensitivity

常金(1977—)，男，山東新泰人，碩士，主治醫(yī)師，講師，主要從事腫瘤放療與微創(chuàng)治療工作。

R734.2

A

1004-7115(2016)09-0990-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.09.008

2016-05-05)