室間隔缺損患者循環(huán)miRNA表達(dá)差異研究

許美玲　 吳雪嵩　朱　凱　李金棟　王　倩　紀(jì)　龍

(1.泰安市泰山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東 泰安　271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 泰安　271016)

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室間隔缺損患者循環(huán)miRNA表達(dá)差異研究

許美玲1吳雪嵩2朱凱2李金棟2王倩2紀(jì)龍2

(1.泰安市泰山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東 泰安271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 泰安271016)

目的先天性心臟病(CHD)是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。室間隔缺損(VSD)是CHD中最常見的一種。研究表明，microRNAs(miRNAs)與CHD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但目前缺乏有關(guān)miRNAs與VSD的研究報(bào)道。本研究旨在通過血清差異miRNA的表達(dá)研究闡明miRNA與VSD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法采用miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)進(jìn)行VSD患者血清miRNA表達(dá)差異分析，并對結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)驗(yàn)證，進(jìn)而對miRNA調(diào)控的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果通過miRNA芯片在VSD患者和對照血清樣本中檢測miRNA差異表達(dá)，篩選出36個(gè)表達(dá)差異的miRNA(P<0.05)，其中21個(gè)miRNA在VSD患者表達(dá)顯著下調(diào)，15個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)。經(jīng)過Real-time PCR驗(yàn)證，證實(shí)8個(gè)miRNAs差異表達(dá)有意義。通過生物信息學(xué)預(yù)測出447個(gè)靶基因，經(jīng)GO分析富集度分值(enrichment score value)最大的生物過程(biological process)為心臟右心室形態(tài)發(fā)生(cardiac right ventricle morphogenesis)，對應(yīng)的差異表達(dá)基因?yàn)镹OTCH1、HAND1、ZFPM2和GATA3，調(diào)控這些基因的miRNA可能包括hsa-let-7e-5p、hsa-miR-222-3p和hsa-miR-433。結(jié)論通過微陣列技術(shù)分析和RT-PCR驗(yàn)證，篩選出8個(gè)差異表達(dá)miRNA，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可供分析的miRNA。利用3個(gè)數(shù)據(jù)庫及GO分析, 發(fā)現(xiàn)hsa-let-7e-5p、hsa-miR-222-3p和hsa-miR-433的靶基因分別為NOTCH1、HAND1、ZFPM2和GATA3，為進(jìn)一步在基因水平研究VSD的發(fā)病機(jī)制提供了新的突破口,為將來可能實(shí)現(xiàn)的基因診斷、基因干預(yù)治療以及疾病的預(yù)防奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

室間隔缺損； 微小RNA；NOTCH1；HAND1；ZFPM2；GATA3

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是胎兒期心臟及大血管發(fā)育異常而致的心血管畸形。國外報(bào)道先心病發(fā)病率為5.4/1000～16.1/1000[1]，亞洲國家最高，約為9.3%[2]。我國的監(jiān)測報(bào)告顯示CHD的發(fā)生率為32.74/10000[3]。CHD是小兒最常見的先天畸形之一，也是導(dǎo)致新生兒及嬰兒死亡的最重要的原因[4]。CHD病因復(fù)雜，至今尚未完全明確。多數(shù)CHD (90%)可能與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)[5]。常見的CHD主要有房間隔缺損(atrial septal defect, ASD)、室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)、動脈導(dǎo)管未閉(patent ductus arteriosus, PDA)、法洛氏四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot, TOF)、大動脈轉(zhuǎn)位(transposition of the great arteries, TGA)、肺動脈閉鎖(pulmonary valve atresia, PA)、主動脈縮窄(coarctation of the aorta, COA)和三尖瓣閉鎖(tricuspid atresia, TA)等。VSD是較常見的先天性心臟結(jié)構(gòu)畸形之一，約占CHD的20%[6]，主要是由于左右心室間隔的缺損導(dǎo)致了左右心室的異常交通。盡管其胚胎學(xué)和生理學(xué)已經(jīng)闡明，但其病因與發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚[7]。微小RNA( microRNAs,miRNA)是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，長度介于18～22個(gè)核苷酸的單鏈、非編碼的小分子RNA?？膳c靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)相互配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。 miRNA調(diào)控細(xì)胞的生長、代謝、分化和凋亡，進(jìn)而參與生物體的生長發(fā)育[8]。miRNA除了在細(xì)胞內(nèi)有作用，體液中穩(wěn)定表達(dá)的miRNA在心血管疾病、腫瘤發(fā)生等過程中也起了重要作用，循環(huán)miRNA可作為潛在的生物標(biāo)志物用于疾病的診斷[9-10]。近年研究表明，miRNA在心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展方面發(fā)揮著重要的功能，參與調(diào)控胚胎心臟的發(fā)育，在心臟形態(tài)發(fā)生、心肌細(xì)胞生長及分化過程中發(fā)揮著極其重要的作用[11]。miRNAs表達(dá)譜芯片是篩選與研究疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)特異miRNAs的重要方法之一，本研究通過采用miRNAs表達(dá)譜芯片對VSD患者血漿miRNA表達(dá)進(jìn)行篩選，找出其與正常對照人群差異表達(dá)的miRNA，并且運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對部分明顯差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行檢測，驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性，運(yùn)用靶基因預(yù)測軟件對差異表達(dá)的miRNA下游調(diào)控的靶基因進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)一步分析其生物學(xué)功能，以期為闡明VSD在分子水平上的發(fā)病機(jī)制提供線索。

1　資料與方法

1.1研究對象

采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例—對照研究方法。病例選自2012年8月—2013年6月在濟(jì)南市兒童醫(yī)院就診和治療的心血管外科患者。分流口直徑5～8 mm，超聲及術(shù)中直視下均明確診斷為CHD，所有患者均為VSD，且不合并其他畸形；對照組為同期上述醫(yī)院住院治療的骨外科外傷患者、無CHD遺傳家族史并且與病例來自相同地區(qū)。按照1∶1匹配收集VSD患者和健康對照各3例進(jìn)行miRNAs表達(dá)譜芯片研究；選取20例VSD患者和15例健康對照人群，以RT-PCR法進(jìn)行差異miRNA驗(yàn)證。該研究經(jīng)校倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選個(gè)體均由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書，標(biāo)本用于本實(shí)驗(yàn)研究。

1.2樣本采集

于入院次日清晨空腹采集研究對象靜脈血標(biāo)本5 ml，EDTA采血管收集，收集的全血靜置10 min，1500 r/min離心10 min，上層透明淡黃色液體即為血漿，收集后分裝入無RNase的Ep管中，存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3血漿RNA提取及質(zhì)量檢測

血漿總RNA提?。簯?yīng)用TRIzol and miRNeasy mini kit(美國Qiagen公司)試劑盒提取血漿總RNA。瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA質(zhì)量，紫外分光光度儀測定總RNA在260 nm和280 nm處吸收值的比值(OD值=A260/A280)可直接衡量DNA的純度。OD值在1.8～2.1之間，認(rèn)為質(zhì)量合格。實(shí)驗(yàn)步驟如下：取250 ml血漿加入750 ml TRI Reagent提取液和20 ml冰醋酸，手動劇烈振蕩管體至混勻，室溫放置5 min，再加0.2 ml氯仿，強(qiáng)烈震蕩15 s，室溫放置2～3 min，于4 ℃，12000 r/min離心15 min，將上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管內(nèi)，加入500 ml異丙醇，混勻，15～30 ℃孵育10 min。于4 ℃，12000 r/min離心10 min，棄上清。加1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，于4 ℃，7500 r/min離心5 min，自然晾干。

1.4miRNA分離及標(biāo)記

采用miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower labeling kit (Exiqon, Vedbaek, Denmark)標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將Hy3TM熒光基團(tuán)標(biāo)記在每份樣品中miRNA的3'端，得到用于芯片雜交的熒光探針。分離富集miRNA，分離過程按照試劑盒說明進(jìn)行。

l)將溶于2 μl水的RNA、1 μl CIP buffer及CIP混合，置于37 ℃孵育30 min，于95 ℃孵育5 min以終止反應(yīng)；

2)將3 μl標(biāo)記緩沖液、l.5 μl熒光標(biāo)記物(Hy3TM)、2 μl DMSO，2 μl標(biāo)記酶加入上述步驟的混合液中。置于16 ℃孵育1 h進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，然后于65 ℃孵育15 min以終止反應(yīng)。

1.5miRNA芯片雜交

選擇miRCURYTMLNA Array (v.18.0) (Exiqon) 表達(dá)譜芯片，總的25 μl被標(biāo)記Hy3TM的樣品混合液與25 μl雜交緩沖液混合，置于95 ℃變性2 min，冰上孵育2 min，然后使用phalanTM熱收縮雜交袋將標(biāo)記好的探針與miRCURYTM芯片于56 ℃條件下雜交16～20 h。

1.6芯片掃描及圖像數(shù)據(jù)處理

采用GenePix 4000B microarray scanner (Axon Instruments, Foster City，CA)掃描儀進(jìn)行芯片掃描，采集熒光強(qiáng)度。采用Genepix Pro 6.0 software (Axon)圖像分析軟件對采集的雜交圖像進(jìn)行數(shù)字化分析，用每個(gè)探針的原始信號值減去該點(diǎn)的背景值得到每個(gè)探針的修正值；用同一批次實(shí)驗(yàn)中在每張芯片上修正值≥50的非對照探針做標(biāo)準(zhǔn)化，以這部分探針中值作為標(biāo)準(zhǔn)化因子對整張芯片的點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)化處理。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)后處理后，分別用VSD組/對照組計(jì)算相應(yīng)miRNAs分子的差異倍數(shù)，挑選差異大于1.5或小于0.67的miRNA作為有表達(dá)差異的miRNAs。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)

隨機(jī)挑選表達(dá)差異的8個(gè)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，以has-miR-93為內(nèi)參照，引物參照GenBank數(shù)據(jù)庫基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。PCR 反應(yīng)條件：取100 ng總miRNAs加入20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系，16 ℃30 min，42 ℃40 min，85 ℃5 min，反應(yīng)結(jié)束后，將其放在冰上待用。再取2 μl cDNA加入8 μl實(shí)時(shí)PCR體系，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃10 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，測定熒光強(qiáng)度，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；從60 ℃緩慢加熱到99 ℃，繪制溶解曲線；數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

1.8miRNAs靶基因預(yù)測

采用targetscan (http://www.microrna.org/microrna/home.do)，mirbase(http://pictar.mdc-berlin.de),和Miranda (http://www.targetscan.org/vert_60/)3個(gè)數(shù)據(jù)庫，輸入VSD組和正常對照組表達(dá)差異的miRNAs，預(yù)測得到差異miRNA的靶基因，然后取3個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測共有的靶基因(交集部分)。

1.9miRNA與靶基因的相關(guān)性分析

利用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫對上述差異miRNA調(diào)控的靶基因進(jìn)行注釋，得到靶基因的所有功能注釋，采用Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)功能的顯著性水平(P-value)，根據(jù)顯著性水平進(jìn)行篩選，得到靶基因的顯著性功能及功能所屬的基因。篩選標(biāo)準(zhǔn)：P≤0.05，P值越低，GO越顯著。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)　果

2.1人群特征

進(jìn)行miRNAs表達(dá)譜芯片研究的3例VSD患者和3例健康對照組人群按照性別、年齡、出生地、出生方式、母親孕期情況、遺傳家族史等方面1∶1配對。另外20例VSD患者和15例健康對照人群按照年齡(P=0.354)、性別(P=0.573)進(jìn)行匹配，基本情況見表1。

表1　病例組和對照組基本情況

2.2血清miRNA微陣列芯片表達(dá)譜分析結(jié)果

利用miRCURY LNA Array (version 11.0) miRNA芯片技術(shù)檢測了3例VSD患者和3例健康對照血漿中的miRNA表達(dá)特征，初步確定了VSD差異miRNA表達(dá)譜。微陣列芯片雜交結(jié)果顯示：與對照組相比，有36個(gè)表達(dá)差異的miRNA(P﹤0.05)，其中21個(gè)miRNA在VSD患者表達(dá)顯著下調(diào)，表達(dá)顯著上調(diào)的miRNA有15個(gè)，見表2、圖1。

表2　VSD患者表達(dá)差異的miRNAs

圖1microRNA芯片篩選VSD血漿microRNA差異表達(dá)熱圖

2.3差異表達(dá)miRNA的RT-PCR定量檢測分析

結(jié)合生物信息學(xué)分析，隨機(jī)選擇8個(gè)差異表達(dá)的miRNA(其中表達(dá)下調(diào)的miRNA共7個(gè)，分別為hsa-let-7e-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-433、hsa-miR-487b；表達(dá)上調(diào)miRNA共1個(gè)，為hsa-miR-498)運(yùn)用RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行檢測，結(jié)果與miRNA芯片結(jié)果基本相符合，提示miRNA芯片結(jié)果能正確反映VSD患者和對照組人群血漿中miRNA的表達(dá)差異。同時(shí)，更精確的測定了上述miRNA表達(dá)水平的變化。即hsa-let-7e-5p表達(dá)下調(diào)0.27倍(P=0.024)，hsa-miR-155-5p表達(dá)下調(diào)0.45倍(P=0.033)，hsa-miR-222-3p表達(dá)下調(diào)0.51倍(P﹤0.001)，hsa-miR-379-5p表達(dá)下調(diào)0.18倍(P=0.013)，hsa-miR-409-3p表達(dá)下調(diào)0.56倍(P﹤0.001)，hsa-miR-433表達(dá)下調(diào)0.10倍(P﹤0.001)，hsa-miR-487b表達(dá)下調(diào)0.24倍(P=0.025)，hsa-miR-498表達(dá)上調(diào)4.33倍(P﹤0.001)，圖2。

圖2　20例VSD與15例對照8種血漿microRNAs相對表達(dá)量

2.4差異miRNAs靶基因預(yù)測

對VSD組和正常對照組表達(dá)差異的36個(gè)miRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測。研究發(fā)現(xiàn)與VSD的發(fā)生可能有關(guān)的15個(gè)差異表達(dá)miRNAs的447個(gè)靶基因，并且大部分差異miRNAs的靶基因中含有與心臟發(fā)育直接相關(guān)的關(guān)鍵基因(HAND1、NKX2-4、TBX-1、MAP2K4、GATA4、NOTCH1、ZFPM2等)。15個(gè)差異表達(dá)miRNAs的代表性靶基因，見表3。

表3　VSD患者36個(gè)差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測

2.5靶基因GO分析

篩選出的447個(gè)可能參與VSD發(fā)病機(jī)制的潛在功能靶基因，通過GO分析生物學(xué)過程后揭示了這些差異表達(dá)的miRNA在cardiac right ventricle morphogenesis等過程中富集，排名前十的生物學(xué)過程，見表4，圖3。富集度最高的GO相關(guān)靶基因?yàn)镹OTCH1、HAND1、ZFPM2、GATA3與cardiac right ventricle morphogenesis發(fā)育有關(guān)，并且調(diào)控這4個(gè)基因的miRNA分別為hsa-let-7e-5p、hsa-miR-222-3p和hsa-miR-433，在VSD患者血漿中表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)，見表3。

表4　miRNA的預(yù)測靶基因Gene Ontology分析*

*表中僅列出功能顯著性排名前10的GO terms。

圖3　預(yù)測靶基因富集度居前的生物學(xué)過程條目(部分)

2.6構(gòu)建miRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

對靶基因通過顯著性功能分析，構(gòu)建miRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。取差異miRNA與顯著性功能所屬的靶基因，構(gòu)建差異表達(dá)的miRNA與調(diào)控VSD有關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖4。得到網(wǎng)絡(luò)核心調(diào)控的關(guān)鍵miRNA(15個(gè))和被調(diào)控的核心靶基因，并提示這些miRNA可能與VSD相關(guān)。

圖4microRNA-Gene-Network調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖

3　討　論

miRNA在很多生物的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，miRNA基因數(shù)目只為蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)目的1%，但是通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以調(diào)控大約30%的人類基因，影響細(xì)胞發(fā)育、增殖和凋亡，并與許多疾病相關(guān)。miRNA與許多先CHD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[12]，并且在心臟相關(guān)疾病的診斷和治療中發(fā)揮越來越重要的作用[13-14]。有研究表明，miR-1和miR-133控制心肌及骨骼的發(fā)育[15]。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在顱面部和心血管系統(tǒng)發(fā)生中起核心作用，如發(fā)生變異，將導(dǎo)致神經(jīng)-顱面部-心臟先天性缺陷。VSD是先天性心臟病中最常見的一種類型，雖已查明多個(gè)可能與VSD有關(guān)的miRNA調(diào)控的靶基因，如在敲除小鼠Dicer基因后，小鼠出現(xiàn)VSD表型，發(fā)現(xiàn)miRNA-21和miRNA-181a在VSD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[17]，但與VSD 發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的miRNAs數(shù)量繁多，對其表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍不十分清楚，因此仍需進(jìn)一步的深入研究和發(fā)掘。最新研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miRNA在血清中非常穩(wěn)定，不能被血液中降解其他RNA分子的酶降解，可以作為先天性心臟病敏感和特異的生物學(xué)標(biāo)記[18- 19]。miRNAs表達(dá)譜芯片是篩選與研究疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)特異miRNAs的重要方法之一，本研究采用miRNAs表達(dá)譜芯片篩選VSD患者和正常對照人群中表達(dá)差異的miRNAs，并初步確定了這些miRNA調(diào)控的靶基因，為闡明VSD在分子水平上的發(fā)病機(jī)制提供可靠線索。

本研究通過檢測3例VSD患者血漿中差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)與正常對照人群(3例)相比存在36個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中21個(gè)表達(dá)下調(diào)，15個(gè)表達(dá)上調(diào)，見表1。采用RT-PCR技術(shù)對其中8個(gè)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，8個(gè)miRNA與芯片結(jié)果基本相符。預(yù)測出的447個(gè)靶基因中，大部分靶基因是與心臟發(fā)育有關(guān)。進(jìn)一步對447個(gè)靶基因進(jìn)行功能顯著性分析。富集度最高的GO相關(guān)靶基因功能表現(xiàn)為調(diào)控右心室形態(tài)發(fā)育，其關(guān)鍵基因有包括NOTCH1、HAND1、ZFPM2和GATA3等4個(gè)。調(diào)控這些基因的3個(gè)miRNA分別為hsa-let-7e-5p、hsa-miR-222-3p和hsa-miR-433，在VSD患者血漿中表達(dá)均下調(diào)(P﹤0.05)，見表3。

分析結(jié)果提示，hsa-miR-433可能調(diào)控的靶基因?yàn)镹OTCH1和GATA3。已有研究表明，NOTCH1與心室發(fā)育密切相關(guān)，心室發(fā)育過程中心肌前體細(xì)胞分化為外部致密層和內(nèi)部肌小梁層，在胚胎發(fā)育第9.5天發(fā)現(xiàn)NOTCH1于小梁層底部的心內(nèi)膜表達(dá)，而敲除NOTCH1大鼠胚胎肌小梁形成缺陷，且失去特征標(biāo)志物表達(dá)能力[20]。余章斌等[21]通過芯片篩選和定量PCR表明VSD胎兒心肌組織NOTCH1表達(dá)下調(diào)，從而影響下游的效應(yīng)基因Hes1，其表達(dá)也下調(diào)，表明NOTCH信號通路在胎兒VSD中起重要作用。

GATA家族目前有六個(gè)基因(GATA1-6)。 GATA4是一個(gè)在心臟發(fā)生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)控者作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與心臟的正常發(fā)育及功能基因的表達(dá)[22]。GATA4 基因正常水平的表達(dá)對心臟的環(huán)化、心房、心室發(fā)育、房室瓣形成及動脈干分隔都起著關(guān)鍵作用，是心臟發(fā)育成熟并發(fā)揮其正常生理功能所必需的[23]。對斑馬魚的研究表明，GATA4不僅參與心臟的形成，而且對心肌受損后的修復(fù)與重建也起著重要作用[24]。GATA3是該家族中另一重要的轉(zhuǎn)錄因子，特異性表達(dá)于Th2細(xì)胞中，在Th2細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育中起關(guān)鍵作用[25]，有關(guān)GATA3與VSD關(guān)系的研究極少，金立臣等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在VSD合并肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)組患兒中GATA3基因表達(dá)比單純PAH患兒顯著降低(P﹤0.05)，提示GATA3基因的低表達(dá)可能與VSD的發(fā)生有關(guān)。

hsa-miR-222-3p參與調(diào)控的靶基因ZFPM2，又名FOG2(transeription factor GATA4, FOG2)，同屬GATA轉(zhuǎn)錄因子家族，在心臟發(fā)育過程中必不可少。FOG2基因與GATA4基因發(fā)生特異性相互作用，同時(shí)抑制GATA4依賴性轉(zhuǎn)錄過程[27]。FOG2基因敲出小鼠于胚胎期 E13.5天左右因心臟缺陷導(dǎo)致胚胎期致死，其心臟發(fā)育缺陷主要包括心肌發(fā)育不良心室壁變薄、大的室間隔缺損、嚴(yán)重的房室心內(nèi)膜墊缺失 、主動脈騎跨和嚴(yán)重的冠狀動脈血管叢發(fā)育不全[28]，可能與VSD的發(fā)生有關(guān)。

在預(yù)測的4個(gè)靶基因中，HAND1是HAND家族的重要成員之一，和HAND2一起作為參與心臟發(fā)育調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，與心室肌細(xì)胞分化成形、傳導(dǎo)束、心臟流出道、心外膜及心內(nèi)膜的發(fā)育密切相關(guān)[29]。HAND1在調(diào)控過程中通過啟動子區(qū)域的四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與GATA4相結(jié)合，共同發(fā)揮調(diào)控作用[30]。Cheng等在中國人群VSD患者中也發(fā)現(xiàn)HAND1基因存在突變，提示HAND1可能參與房室間隔缺損的發(fā)生[31]。Zhao等[32]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1可以在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)候阻止HAND2蛋白的合成，使心臟得以正常發(fā)育。但目前尚無有關(guān)調(diào)控HAND1的miRNA與VSD的研究報(bào)道。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，hsa-let-7e-5p在VSD發(fā)生過程中顯著下調(diào)，對芯片結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，hsa-let-7e-5p表達(dá)水平下降了0.27倍(P=0.024)，圖3。提示hsa-let-7e-5p很有可能參與VSD進(jìn)程且發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。推測這些表達(dá)差異的miRNAs與右心室形態(tài)發(fā)育特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而引起VSD發(fā)生，但是這些信息學(xué)分析需要進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告基因結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

多數(shù)CHD屬于多基因遺傳病，其發(fā)生涉及多個(gè)miRNA調(diào)控的多種基因的表達(dá)，這些基因相互影響形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[33]，從而影響心臟的發(fā)育。本研究篩選到VSD患者和正常對照人群血漿差異表達(dá)miRNAs，首次報(bào)道hsa-let-7e-5p、hsa-miR-222-3p和hsa-miR-433可能通過與心臟特異的靶基因結(jié)合，從而引起心臟發(fā)育異常，這些靶基因如NOTCH1、HAND1、ZFPM2和GATA3等可能在右心室形態(tài)發(fā)育中相互影響，從而導(dǎo)致VSD發(fā)生(見圖5)。隨著特異性心臟發(fā)育相關(guān)miRNAs的進(jìn)一步深入研究，結(jié)合靶基因的功能性研究，以及差異miRNA作為無創(chuàng)性診斷標(biāo)志物，為進(jìn)一步研究VSD的病因、以及早期診斷和治療提供了新的思路，具有重大的臨床意義。

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Characterization of circulating microRNA expression in patients with a ventricular septal defect

XU Mei-ling1WU Xue-song2ZHU Kai2LI Jin-dong2WANG Qian2JI Long2

(1.Taishan District Center for Disease Control and Prevention, Taian 271000,China;2. School of Public Hhealth, Taishan Medical University, Taian 271016,China)

Objective: To characterize the expression of miRNAs that might be involved in the development or reflect the consequences of VSD. Methods: MiRNA microarray analysis and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were employed to determine the miRNA expression profile from 3 patients with VSD and 3 VSD-free controls. The expression of eight selected miRNAs (hsa-let-7e-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-379-5p, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-433, hsa-miR-487b and hsa-miR-498) were then independently validated by RT-PCR of plasma samples from 20 VSD patients and 15 VSD-free controls. A total of 446 target genes were predicted by bioinformatic methods. Results: Thirty-six differentially expressed miRNAs were found in the patients with VSD and the VSD-free controls. Compared with VSD-free controls, expression of 15 miRNAs were up-regulated and 21 miRNAs were down-regulated in the VSD group. The results of the RT-PCR were consistent with those of the microarray analysis. Gene ontology analysis indicated that the top target genes were mainly related to cardiac right ventricle morphogenesis. Additionally, we predicted NOTCH1, HAND1, ZFPM2, and GATA3 as targets of hsa-let-7e-5p, hsa-miR-222-3p and hsa-miR-433. Conclusion: The study has reported for the first time three circulating miRNA profiles for patients with VSD and VSD-free controls and validated these results in a larger group of subjects. These findings may reveal important insights into the pathogenesis of VSD.

VSD; microRNAs; NOTCH1; HAND1; ZFPM2; GATA3

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013WS0320)。

許美玲(1972—)，女，山東寧陽人，主管技師，主要從事專業(yè)衛(wèi)生檢驗(yàn)工作。

紀(jì)龍，男，講師。

R541.1

A

1004-7115(2016)09-0961-07

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.09.001

2016-05-10)